基于Box－Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化黨參抗氧化活性組分提取工藝

任海云，韓瑞，張磊

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 榆次 030619）

在遭受有害刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧自由基，導(dǎo)致機(jī)體組織氧化損傷，盡管機(jī)體具有抗氧化防御和修復(fù)機(jī)制，然而過(guò)度的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織損傷，引發(fā)各種疾病，如何有效抑制過(guò)度的氧化應(yīng)激至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，很多傳統(tǒng)中藥具有抗氧化作用。近年來(lái)，找尋天然抗氧化劑，并對(duì)其抗氧化活性成分及抗氧化機(jī)制進(jìn)行完全的闡釋已成為藥品、食品研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。黨參屬桔?？浦参?，含多種抗氧化活性成分，近幾年有關(guān)黨參的研究多集中在中藥組分的提取及其抗氧化活性的研究［1?6］，而將工藝與抗氧化活性相結(jié)合追蹤篩選工藝研究的則比較少。本研究以黨參為研究對(duì)象，采用抗氧化活性與工藝相結(jié)合的方式進(jìn)行跟蹤篩選，以期得到能高度富集抗氧化有效成分的工藝，為下一步血清藥物化學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

黨參藥材產(chǎn)于山西太行，冷凍干燥后粉碎過(guò)2 號(hào)篩；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、Tris－HCl緩沖溶液、維生素C（Vc）、氫氧化鈉、過(guò)硫酸鉀購(gòu)于山西吉泰生化試劑有限公司；蘆丁對(duì)照品、鄰苯三酚、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（ABTS）、2′－聯(lián)氨－雙－3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸（DPPH）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所用試劑皆為分析純。

1.2 儀器

冷凍干燥機(jī)（寧波新芝凍干設(shè)備有限公司）；瓦里安50 Cary紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安公司）；電子天平（上海象平儀器儀表有限公司）；SG－4054型數(shù)控精密恒溫水浴鍋（上海碩光電子科技有限公司）；R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)中的方法測(cè)定總黃酮得率［7?11］，精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（干燥至恒重）20.6 mg，加入60%的乙醇，超聲溶解并定容，即得蘆丁對(duì)照品溶液（C=0.206 mg/mL）。分別準(zhǔn)確移取對(duì)照品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL 容量瓶中，加蒸餾水至6.0 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，放置約5 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，放置約5 min，加入4% 氫氧化鈉溶液10.0 mL，最后加入蒸餾水定容，靜置20 min，在400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得λmax=505 nm。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制A～C曲線。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合得回歸分析方程：y=13.670 25x－0.007 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 69，表明樣品濃度在0.008 24～0.049 44 mg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性相關(guān)性。

圖1 A～C曲線

2.2 黨參總黃酮樣品溶液及抗氧化能力測(cè)試液的制備

首先將黨參進(jìn)行冷凍干燥預(yù)處理，粉碎過(guò)篩放于干燥器中待用。稱取黨參粉末2.0 g于圓底燒瓶中，加入不同體積與濃度的乙醇，設(shè)定溫度和時(shí)間后進(jìn)行水浴回流提取，濾過(guò)，取上清液進(jìn)行旋蒸濃縮，然后迅速轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，加入提取時(shí)同樣濃度的乙醇至刻度線即得黨參總黃酮樣品溶液及抗氧化能力測(cè)試液。

其中：x為黃酮含量（mg/mL），y為總黃酮得率。

2.3 單因素對(duì)黨參體外抗氧化能力的影響

以提取溫度85 ℃、乙醇濃度80%、提取時(shí)間60 min、提取1 次為條件考察不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）對(duì)黨參體外抗氧化能力影響；以料液比1∶25、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間60 min、提取1次為條件考察不同乙醇濃度（75%、80%、85%、90%、95%）對(duì)黨參體外抗氧化能力影響；以料液比1∶25、乙醇濃度80%、提取時(shí)間60 min、提取1次為條件考察不同提取溫度（75、80、85、90、95 ℃）對(duì)黨參體外抗氧化能力影響；以料液比1∶25、乙醇濃度80%、提取溫度85 ℃、提取1次的條件考察不同提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）對(duì)黨參體外抗氧化能力影響；料液比1∶25、乙醇濃度80%、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間60 min的條件考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對(duì)黨參體外抗氧化能力影響；以黨參對(duì)ABTS自由基清除率評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力。

2.4 ABTS自由基清除能力測(cè)定

分別量取7 mmol/L ABTS 水溶液和2.45 mmol/L K2S2O8（過(guò)硫酸鉀）水溶液各5 mL，兩者等體積混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h，得ABTS儲(chǔ)備液。使用時(shí)將ABTS儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇稀釋30～40 倍，制備成在波長(zhǎng)734 nm處吸光度為（0.70±0.02）的工作液。取兩組不同質(zhì)量濃度的Vc 溶液（0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL）1 mL，分別與稀釋后的ABTS 溶液4 mL 及無(wú)水乙醇4 mL 混合均勻，在室溫下避光靜置30 min 后用紫外儀在517 nm 處測(cè)定吸光度A。以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)3組平行數(shù)據(jù)，取平均值，計(jì)算清除率。

ABTS自由基清除率=［1－（A1－A2）/A0］×100%

其中：0.8 mL 無(wú)水乙醇與3.2 mL ABTS 稀釋溶液混合均勻作為A0；0.8 mL 樣品溶液與3.2 mL ABTS 稀釋溶液混合均勻作為A1；0.8 mL 樣品溶液與無(wú)水乙醇3.2 mL混合均勻作為A2。

2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

取兩組不同質(zhì)量濃度的Vc 溶液（0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL）各2 mL，分別加入0.04 g/L DPPH 溶液和無(wú)水乙醇各2 mL，經(jīng)振蕩、混合均勻后，在室溫下避光靜置30 min，再用紫外儀在517 nm 處測(cè)定吸光度A。最后以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)3組平行數(shù)據(jù)，取平均值，計(jì)算清除率。

DPPH自由基清除率=［1－（A1－A2）/A0］×100%

其中：2 mL 無(wú)水乙醇與2 mL DPPH 溶液混合均勻作為空白對(duì)照A0；2 mL 樣品溶液與2 mL DPPH 溶液混合均勻作為A1；2 mL無(wú)水乙醇與2 mL 樣品溶液混合均勻作為A2。

2.6 ·O2－自由基清除能力測(cè)定

量取兩組濃度50 mmol/LTris－HCl 緩沖液（pH=8.2）4.5 mL，在室溫放置20 min，2組均與不同質(zhì)量濃度Vc 溶液（0.08，0.16，0.24，0.32，0.40 mg/mL）1 mL 混合，一組加入2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，另一組加入蒸餾水0.4 mL混合均勻，在室溫下反應(yīng)5 min，加入8 mmol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)325 nm處測(cè)定吸光度。以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)3組平行數(shù)據(jù)，取平均值，計(jì)算清除率。

·O2－自由基清除率=［1－（A1－A2）/A0］×100%

其中：4.5 mL Tris－HCl 緩沖液與1 mL 無(wú)水乙醇+0.4 mL鄰苯三酚和1 mL HCl溶液作為A0；4.5 mL Tris－HCl 緩沖液與樣品溶液1 mL+鄰苯三酚0.4 mL 和HCl溶液1 mL混合作為A1；4.5 mL Tris－HCl緩沖液+1 mL樣品溶液+0.4 mL水+1 mL HCl溶液混合作為A2。

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box－Behnken 設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化黨參抗氧化活性工藝。利用Design－Expert 10.0 軟件以黨參ABTS 自由基清除率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)4因素3水平的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行分析，響應(yīng)面因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素對(duì)黨參體外抗氧化能力的影響

3.1.1 不同料液比對(duì)ABTS自由基清除率的影響

考察不同料液比對(duì)黨參提取液ABTS 自由基清除率的影響發(fā)現(xiàn)，隨著料液比從1∶20 到1∶40 變化時(shí)，黨參提取液對(duì)ABTS 自由基清除率伴隨乙醇體積的增加先增加至89.56%，后又下降至84.98%。同時(shí)追蹤總黃酮得率變化，其變化趨勢(shì)與黨參對(duì)ABTS 自由基清除率變化趨勢(shì)相似，隨著溶劑乙醇量增多，總黃酮很快溶解析出，但繼續(xù)增加溶劑其得率有所下降。這可能是由于在后續(xù)濃縮過(guò)程中損失增大所致，由此可見(jiàn)黨參所含抗氧化成分其得率與黨參提取液清除ABTS 自由基能力正相關(guān)。綜合分析，最終選擇1∶25與1∶35為最低和最高水平進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表2。

表2 料液比對(duì)ABTS自由基清除率的影響

3.1.2 不同醇濃度對(duì)ABTS自由基清除率的影響

考察不同乙醇濃度對(duì)黨參提取液ABTS 自由基清除率的影響發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇濃度的增加，黨參提取液ABTS 自由基清除率在乙醇濃度為85%時(shí)達(dá)到最高，為90.33%，同時(shí)總黃酮得率也達(dá)到最高，為6.79%，這是由于隨著乙醇濃度增大，總黃酮較易溶解析出。繼續(xù)增加乙醇濃度則導(dǎo)致其ABTS 自由基清除率下降，同時(shí)總黃酮得率也顯示明顯下降趨勢(shì)，降至5.31%。見(jiàn)表3。既往研究發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度過(guò)大則導(dǎo)致體系極性太低，不利于總黃酮的溶解析出［12?13］。醇濃度為85%時(shí)ABTS 自由基清除率數(shù)據(jù)最佳，以此為依據(jù)選擇醇濃度80%～90%進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

表3 乙醇濃度對(duì)ABTS自由基清除率的影響

3.1.3 不同提取溫度對(duì)ABTS自由基清除率的影響

考察不同溫度對(duì)黨參提取液ABTS清除效果的影響發(fā)現(xiàn)，在溫度為75～95 ℃范圍內(nèi)隨著溫度上升，黨參提取液ABTS清除率先在85 ℃時(shí)達(dá)到95.98%，總黃酮得率也增至6.48%，這說(shuō)明溫度升高有利于總黃酮的溶解析出。然而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)其清除率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，降至91.10%。同時(shí)追蹤總黃酮發(fā)現(xiàn)其得率也呈降低趨勢(shì)，這可能是由于溫度過(guò)高則會(huì)使總黃酮結(jié)構(gòu)中易被氧化的部分發(fā)生氧化而失去還原能力所導(dǎo)致。整體總黃酮得率與其抗氧化能力正相關(guān)。最終選擇溫度80 ℃與90 ℃作最低和最高水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。見(jiàn)表4。

表4 提取溫度對(duì)ABTS自由基清除率的影響

3.1.4 不同提取時(shí)間對(duì)ABTS自由基清除率的影響

考察不同提取時(shí)間對(duì)黨參提取液清除ABTS 自由基的影響發(fā)現(xiàn)，在30～150 min 范圍內(nèi)隨提取時(shí)間增加，ABTS自由基清除率先上升至93.27%，后又下降至87.81%。同時(shí)追蹤總黃酮得率變化發(fā)現(xiàn)，其與溫度變化趨勢(shì)相似，先增至6.48%后又下降至3.72%。由此可見(jiàn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致總黃酮部分結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化，從而使其失去抗氧化能力，黨參提取液抗氧化能力與總黃酮得率正相關(guān)。綜合分析選擇提取時(shí)間在60、90、120 min進(jìn)行下一步優(yōu)化。見(jiàn)表5。

表5 提取時(shí)間對(duì)ABTS自由基清除率的影響

3.1.5 不同提取次數(shù)對(duì)ABTS自由基清除率的影響

考察提取次數(shù)對(duì)黨參提取液ABTS 自由基清除效果的影響發(fā)現(xiàn)，隨著提取次數(shù)的增加清除率隨之上升并趨于平緩，提取次數(shù)1次與2次之間的清除率差值較大，3～5 次的清除率變化減小，均在89%左右，見(jiàn)表6。可明顯看出提取次數(shù)的增加對(duì)總黃酮得率影響不大。從試劑消耗、抗氧化能力與富集以總黃酮為代表的抗氧化成分多少綜合分析，選擇2 次為最佳條件進(jìn)行優(yōu)化。

表6 提取次數(shù)對(duì)ABTS自由基清除率的影響

3.2 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

黨參抗氧化活性優(yōu)化工藝回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表7和表8。

表7 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案

表8 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用軟件Design－Expert 10.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到自變量料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇濃度（D）與ABTS 自由基清除率（Y）的多元二次回歸方程為：

對(duì)響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表8。該回歸模型F值為3.15，P=0.026 8<0.05，表示該試驗(yàn)所得的回歸方程達(dá)到極顯著水平，該模型具有較高的可信度，回歸方程可以很好地預(yù)測(cè)黨參抗氧化活性。該模型中一次項(xiàng)D，二次項(xiàng)D2數(shù)據(jù)均<0.05，說(shuō)明因素D對(duì)結(jié)果影響顯著，而一次項(xiàng)A，B，C，和二次項(xiàng)A2，B2，C2的P值均>0.05，可見(jiàn)其交互作用相對(duì)較弱，對(duì)結(jié)果影響不顯著。

3.3 響應(yīng)面分析

由交互作用圖可知，AC即料液比與提取溫度交互作用曲面最陡，其交互作用最為顯著，AC 交互作用P值0.073 9 與顯著水平相當(dāng)，這說(shuō)明黨參抗氧化能力對(duì)料液比與提取溫度的改變較為敏感，與方差分析結(jié)果一致。見(jiàn)圖2。

圖2 影響因素交互作用響應(yīng)面圖

為了得到響應(yīng)面最大值及實(shí)驗(yàn)最優(yōu)方案，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，可得各變量因素的最大值料液比為1∶30.923，乙醇濃度為83.521%，提取溫度為89.336 ℃，提取時(shí)間為68.727 min，最終得到的清除率為99.942%，考慮到實(shí)驗(yàn)的可實(shí)行性將因素水平進(jìn)行改善，最終料液比、乙醇濃度、提取溫度與提取時(shí)間分別為1∶30、85%、90 ℃、70 min，清除率為（99.93 ±0.03）%，與預(yù)測(cè)值接近，相對(duì)誤差較小。

3.4 與Vc的抗氧化活性比較

在最佳工藝條件下對(duì)黨參提取液與陽(yáng)性對(duì)照組Vc抗氧化活性進(jìn)行比較，結(jié)果在0.08～0.40 mg/mL的濃度范圍內(nèi)黨參提取液對(duì)ABTS 自由基的清除率明顯高于Vc，清除·O2－自由基與DPPH 自由基的能力則與Vc 相當(dāng)，這說(shuō)明通過(guò)工藝優(yōu)化有效提高了黨參抗氧化能力。見(jiàn)表9。

表9 黨參與Vc對(duì)DPPH、ABTS以及·O2?自由基清除率的比較（%）

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，能高度富集抗氧化活性的工藝條件為：料液比1∶30、乙醇濃度85%、提取溫度90 ℃與提取時(shí)間70 min。在最優(yōu)工藝條件下黨參提取液對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基以及·O2－自由基均展現(xiàn)出了優(yōu)良的清除能力，且與維生素C 相當(dāng)，甚至在清除ABTS 自由基時(shí)展現(xiàn)出了優(yōu)于維生素C的抗氧化能力。追蹤其抗氧化成分之一——總黃酮的含量也得到很大的提高，進(jìn)一步表明該工藝能高度富集黨參抗氧化活性成分，可以為下一步的血清藥物化學(xué)提供技術(shù)支持。