細胞內(nèi)源性分子輔助熒光信號放大策略及細胞成像

馬小飛，胡 山，李俊彬，楊 盛，諶委菊，卿志和，周怡波，楊榮華

（1.長沙理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,細胞化學(xué)湖南省重點實驗室,長沙 410114；2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點實驗室,長沙 410081）

準確獲取細胞內(nèi)分子信息對于闡明生理和病理相關(guān)機制至關(guān)重要［1］，熒光探針具有靈敏度高、實時監(jiān)測和非侵入性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和分析化學(xué)等領(lǐng)域［2，3］.但部分靶標的低豐度特性為傳統(tǒng)熒光探針的檢測應(yīng)用帶來巨大挑戰(zhàn).信號放大策略通過增加輸出信號強度來提高熒光探針檢測靈敏度，進而對惡性疾病相關(guān)的信號分子和生物標志物進行檢測［4］.常規(guī)細胞內(nèi)信號放大方法包括雜交鏈式反應(yīng)（Hybrid chain reaction，HCR）［5～7］、等溫擴增-支點介導(dǎo)滾環(huán)放大（Rolling circle amplification，RCA）［8～10］及催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)（Catalytic hairpin assembly，CHR）［11～13］等，通過在細胞內(nèi)原位產(chǎn)生DNA構(gòu)象變化對內(nèi)源性核酸靶標物進行高靈敏成像.但這些核酸信號放大策略依賴外源性金屬離子或核酸，而外部添加物將不可避免地對細胞內(nèi)微環(huán)境造成干擾，進而影響機體的正常生理活動.因此，如何克服外源性添加物依賴性，發(fā)展適用于低豐度目標物檢測的信號放大方法具有重要意義.

核酸、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子，谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）等活性小分子以及金屬離子（Na+，K+，Ca2+，Mg2+）是構(gòu)成細胞的重要成分，且其在細胞內(nèi)濃度較高.基于此，研究者們利用高豐度胞內(nèi)分子作放大基質(zhì)，構(gòu)建了多種新型熒光信號放大策略用于細胞內(nèi)重要靶標物的檢測及熒光成像.本文對目前已報道的細胞內(nèi)源性分子輔助信號放大方法進行了歸納整理，介紹其信號放大機制，并總結(jié)了該策略在生物傳感領(lǐng)域取得的重要研究進展.

1 內(nèi)源性核酸輔助信號放大

內(nèi)源性核酸輔助信號放大策略利用高濃度內(nèi)源性核酸分子作輔助鏈，參與核酸雜交反應(yīng)，通過釋放多個分子信標實現(xiàn)細胞內(nèi)原位信號擴增，從而對低濃度核酸靶標物進行檢測.此方法無需外源性輔助鏈，彌補了常規(guī)細胞內(nèi)核酸信號放大方法的缺點.

Wang等［14］構(gòu)建了一種用于miRNA（micro RNA）放大檢測及熒光成像的納米耀斑，首次將內(nèi)源性mRNA（messenger RNA）用作信號放大基質(zhì).該納米耀斑的檢出限低至9.0 pmol/L，比常規(guī)納米耀斑低約3個數(shù)量級.如圖1（A）所示，金納米顆粒負載2種類型的DNA雙鏈體（R/S和F*/R*），分別可與靶標miRNA和內(nèi)源性輔助鏈mRNA反應(yīng).miRNA與R/S反應(yīng)后可釋放單個分子信號產(chǎn)生熒光信號，同時，細胞內(nèi)高濃度mRNA與F*/R*作用釋放大量單鏈核酸（R*），其與R/S發(fā)生競爭反應(yīng)后釋放靶標miRNA，從而參與下一循環(huán)，以此產(chǎn)生大量分子信標實現(xiàn)熒光信號放大.細胞成像結(jié)果表明，與常規(guī)納米耀斑相比，基于內(nèi)源性mRNA輔助放大策略構(gòu)筑的納米耀斑展現(xiàn)出更高的熒光強度［圖1（B）］.

Huang等［15］構(gòu)建了一種用于活細胞中miRNA成像的新型光籠放大納米耀斑.將DNA雙鏈體F*/R*和光響應(yīng)的三重鏈R/P/S結(jié)合到金納米顆粒上構(gòu)建了納米耀斑，其熒光信號強度與miRNA濃度對數(shù)值之間的線性關(guān)系良好，檢出限為3.5 pmol/L，比傳統(tǒng)納米耀斑低約3個數(shù)量級.在光照條件下，三重鏈裂解產(chǎn)生游離的P鏈，R鏈裸露的部分與靶標物miRNA反應(yīng)后可釋放單個分子信標產(chǎn)生熒光信號.而細胞內(nèi)高濃度的mRNA可繼續(xù)參與鏈置換反應(yīng)釋放靶標miRNA，進而不斷循環(huán)實現(xiàn)熒光信號放大.與Wang等［14］報道的納米耀斑相比，該納米耀斑引入了光控裝置，可對納米機器進行時空控制，避免產(chǎn)生非特異性信號，從而提高了檢測的精準度和靈敏度.在紫外光照射下，與常規(guī)納米耀斑相比，基于該策略設(shè)計的納米耀斑表現(xiàn)出更強的熒光信號，表明該探針可通過光控對內(nèi)源性miRNA進行精確熒光成像.

與傳統(tǒng)的納米耀斑相比，基于內(nèi)源性核酸輔助信號放大策略所構(gòu)建的放大型熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）納米耀斑具有較強的抗干擾能力，可在一定程度上避免DNA水解酶和谷胱甘肽所引起的假陽性信號，從而提高其檢測靈敏度和精確度.然而，該策略的檢測對象局限于核酸分子，不適用于活性小分子物種及其它生物大分子，且核酸在細胞復(fù)雜環(huán)境中不穩(wěn)定，DNA降解后將嚴重影響信號放大效率及檢測準確性.

Fig.1 An endogenous mRNA-powered nanoflare image of intracellular microRNA in living cells[14]

2 內(nèi)源性酶輔助信號放大

酶具有良好的催化活性，可催化相應(yīng)底物產(chǎn)生指數(shù)倍信號輸出，是提高檢測靈敏度的有效方法［16］.基于酶的信號放大方法，如環(huán)介導(dǎo)的等溫放大（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［17］、鏈置換放大（Strand displacement amplification，SDA）［18］和滾環(huán)放大（Rolling circle amplification，RCA）［19，20］等可對微量目標物進行體外檢測，但其對酶的依賴性阻礙了其在活細胞內(nèi)的進一步應(yīng)用.

Su等［21］受堿基切除修復(fù)過程的啟發(fā)，首次構(gòu)建了由胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶（Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease I，APE1）驅(qū)動的“燒橋”DNA馬達.如圖2（A）所示，APE1是一種DNA損傷修復(fù)的核酸內(nèi)切酶，對雙鏈DNA中脫嘌呤嘧啶（Apurinopyrimidine，AP）位點具有高度特異性，可實現(xiàn)核酸定向自主運動.如圖2（B）所示，通過單分子熒光技術(shù)監(jiān)測DNA馬達的移動性，證實該系統(tǒng)具有優(yōu)異的可控性和連續(xù)性.該DNA馬達的速度高度依賴于APE1濃度，通過不同濃度APE1產(chǎn)生不同熒光信號強度，從而對癌細胞［圖2（C1）］和正常細胞［圖2（C2）］進行有效區(qū)分.

Jiang等［22］構(gòu)建了一種由核酸內(nèi)切酶APE1驅(qū)動的DNA walker，可在細胞內(nèi)原位成像尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNA Glycocasylase，UDG）.如圖3（A）所示，通過將所有組分整合到DNA-AuNP偶聯(lián)物中，該DNA walker可有效避免功能核酸組分非特異性降解，從而降低背景熒光信號.進入細胞后，DNA walker與UDG相互作用，軌道鏈中的尿嘧啶堿基被切除，暴露出AP識別位點，繼而與核酸內(nèi)切酶APE1發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致熒光素釋放，從而恢復(fù)熒光信號.如此往復(fù)，大量熒光團被釋放產(chǎn)生熒光信號，從而實現(xiàn)對UDG的高靈敏檢測.如圖3（B）所示，與以胸腺嘧啶代替尿嘧啶的對照組相比，DNA walker在細胞內(nèi)產(chǎn)生明顯的綠色熒光信號，表明在細胞內(nèi)源性UDG和APE1的作用下，DNA walker能夠靈敏地檢測活細胞中的UDG活性.

細胞內(nèi)的大分子擴散決定了生物化學(xué)過程的動力學(xué)，同時也限制了仿生DNA納米機器的應(yīng)用［23～26］.Zhao等［27］設(shè)計了一種可以在活細胞中原位快速“行走”的DNA分子馬達，在擴散受限的微環(huán)境（如細胞質(zhì)）中啟動粒子“行走”.如圖4（A）所示，單鏈DNA（DW）、含有識別位點（I，oG）的DNA（DTs）通過Au-S作用修飾在金納米顆粒上形成DNA walker.DW與DT可形成雙聯(lián)，進而激活其特異性位點.進入細胞后，內(nèi)源性糖苷酶與DT發(fā)生特異性反應(yīng)，移除受損的8-氧鳥嘌呤（oG）或肌苷（I）堿基從而暴露AP位點.該位點可與APE1酶作用從而使DT鏈斷裂，釋放熒光團.錨定的DW可以與其它DT分子形成新的雙聯(lián)，以此循環(huán)釋放更多的熒光團.如圖4（B）所示，2種陰性對照系統(tǒng)（無DW和隨機序列DW）處理的細胞熒光信號極弱，而孵育DNA walker的細胞有明顯熒光信號.與常規(guī)組裝系統(tǒng)相比，此方法可避免低效率的擴散組裝并加速反應(yīng)動力學(xué)，對不同細胞的異質(zhì)環(huán)境做出可靠響應(yīng).

Fig.2 Intracellular endonuclease-driven DNA motors for discrimination of cancer cells and normal cells[21]

Fig.3 Endogenous enzyme-driven DNA walker image of uracil-DNA glycosylase in living cells[22]

Fig.4 DNA walkers image of diffusion-restricted microenvironments in cells[27]

酶是細胞內(nèi)廣泛存在的生物大分子，可作為刺激物用于分子檢測和藥物釋放［28～30］.利用內(nèi)源性酶輔助信號放大可避免外源添加酶對宿主基因造成損害，但是該策略的信號放大效率依賴酶的活性，導(dǎo)致其檢測精確度較低且局限于特定的檢測對象，不適用于其它小分子（如活性氧）的檢測.

3 胞漿蛋白輔助信號放大

蛋白質(zhì)是細胞的重要組成部分，是生命活動的主要承擔(dān)者，與細胞的生長［31，32］、新陳代謝［33，34］、應(yīng)激反應(yīng)［35，36］及免疫反應(yīng)［37，38］關(guān)系密切.借助活細胞內(nèi)高豐度胞漿蛋白輔助增強探針的熒光信號，可實現(xiàn)低豐度靶標物的原位檢測［39，40］.

本課題組［41］通過對大量染料與細胞裂解液作用后篩選出熒光增強型染料，并進一步證明該染料可與胞漿蛋白中的肌動蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，使熒光信號大幅度增強.基于此，利用介孔二氧化硅作載體，構(gòu)建了一種胞漿蛋白輔助信號放大納米探針用于檢測細胞內(nèi)羥基自由基（·OH）.如圖5（A）所示，修飾單鏈DNA的功能化介孔硅負載大量熒光染料，表面吸附聚合物（PTAD）構(gòu)成納米探針.當(dāng)探針進入細胞后，內(nèi)源性·OH裂解單鏈DNA，使表面堵孔聚合物脫離，從而釋放出大量染料，恢復(fù)其熒光信號，且釋放出的染料可與胞漿蛋白結(jié)合進一步大幅度增強熒光信號，其放大效率高達近400倍.通過級聯(lián)式信號放大，納米探針對·OH展現(xiàn)出極高的檢測靈敏度，檢出限為6.4 pmol/L.如圖5（B）所示，將探針與巨噬細胞一起孵育后，熒光信號隨著孵育時間逐漸增強，表明該探針可有效進入細胞且對內(nèi)源性·OH進行熒光成像.

Fig.5 Nanosensor based on cytoplasmic protein-assisted signal amplification for imaging of·OH[41]

基于蛋白結(jié)合熒光信號增強策略，本課題組［42］在介孔硅上修飾缺氧響應(yīng)型偶氮苯甲酸，負載熒光染料及猝滅劑后，與環(huán)糊精聚合物發(fā)生主-客體作用構(gòu)造新型納米探針（HCFA）.該探針的檢測信噪比（S/B）可高達791.5倍，且信噪比與氧濃度在0～10%范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系.如圖6（A）所示，當(dāng)HCFA因滯留效應(yīng)被動靶向急性發(fā)炎的結(jié)腸組織時，偶氮鍵在缺氧條件下還原為氨基衍生物，其與環(huán)糊精聚合物之間的主-客相互作用被破壞，染料逸出恢復(fù)熒光.同時，游離態(tài)染料可與胞漿蛋白結(jié)合，進一步增強其熒光強度.圖6（B）和（C）所示熒光成像結(jié)果表明，探針HCFA可區(qū)分細胞不同程度的缺氧情況，并在小鼠活體內(nèi)成像不同程度的腸炎，從而揭示急性結(jié)腸炎與缺氧的潛在關(guān)系.

本課題組［43］還構(gòu)建了H2Sn響應(yīng)型聚合物膠束，在其內(nèi)部負載蛋白增強型染料及猝滅劑構(gòu)成新型熒光納米信標.該納米信標可以在體外靈敏地響應(yīng)H2Sn，信噪比可達941.2倍，且信噪比與H2Sn濃度在0.02～30μmol/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，檢出限低至0.42 nmol/L.如圖7（A）所示，納米信標進入胚胎細胞后，被內(nèi)源性H2Sn激活釋放熒光染料，染料與猝滅劑脫離后熒光信號恢復(fù)，且染料可與胞漿蛋白結(jié)合，進一步實現(xiàn)熒光信號的大幅度增強，達到二次信號放大的目的.聚合物納米信標通過兩次信號放大模式展現(xiàn)出極高的靈敏度，從而實現(xiàn)對胚胎發(fā)育過程中的H2Sn進行熒光成像.由圖7（B）所示斑馬魚成像結(jié)果可知，受精卵內(nèi)H2Sn的濃度較低，隨著胚胎發(fā)育熒光強度逐漸增強（2.5 hpf），表明H2Sn的濃度升高.但原腸胚期（6 hpf）后，熒光強度開始降低，其中體節(jié)期熒光強度降低至50%，并逐漸達到平穩(wěn)，表明H2Sn在抗氧化、保護正常生理發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用.

Fig.6 Nanoprobe based on cytoplasmic protein-assisted signal amplification image of hypoxia associated with acute colitis[42]

Fig.7 Monitoring the fluctuation of hydrogen polysulfides during fertilization and embryonic development with polymeric nanobeacon[43]

利用納米顆粒負載染料可實現(xiàn)熒光信號的有效放大，但染料非特異性泄露也極易誘發(fā)假陽性信號，導(dǎo)致信號獲取不準確.基于此，本課題組［44］提出一種以染料為支架的新型信號放大策略，構(gòu)建了自降解染料摻雜聚合物探針（SDPP）［圖8（A）］.與染料負載納米探針相比，該探針穩(wěn)定性好、抗干擾能力強，能精確檢測·OH，其放大效率可達396.9倍.如圖8（B）所示，SDPP進入細胞后可被·OH激活，通過自降解反應(yīng)釋放染料，進而與蛋白結(jié)合放大熒光信號.與染料負載型納米探針相比，SDPP可有效避免假陽性信號，精確成像細胞內(nèi)·OH.活體熒光成像結(jié)果表明，SDPP可對活體內(nèi)心肌炎相關(guān)·OH進行準確成像.該工作不僅為活體中·OH的成像提供了一種有效的分子工具，而且為精確可靠地獲取細胞內(nèi)分子信息的信號放大策略提供了新的方向［圖8（C）］.

蛋白輔助放大策略以蛋白結(jié)合熒光增強型染料為基礎(chǔ)，利用不同納米顆粒作載體，修飾特異性響應(yīng)開關(guān)后負載染料構(gòu)建負載型熒光納米探針.該類納米探針選擇性好、抗干擾能力強，且基于納米顆粒的高負載性及蛋白增強熒光機制，納米探針的響應(yīng)靈敏度高，可用于檢測各種低豐度靶標物（如細胞內(nèi)核酸和小分子）.但是，負載型納米探針在活體應(yīng)用中面臨染料泄露產(chǎn)生假陽性信號的問題.自降解染料摻雜聚合物探針雖然可以避免上述問題，但基于靶標觸發(fā)的自降解反應(yīng)所需時間較長，在小鼠活體應(yīng)用熒光成像中面臨一定問題.

Fig.8 Self-immolative dye-doped polymeric probe image of·OH by avoiding leakage[44]

Fig.9 ATP-driven photosensitizers image of microRNA in cells[48]

4 內(nèi)源性小分子輔助信號放大

ATP作為一種高能磷酸小分子化合物，是細胞生命活動的主要能量來源，且普遍存在于細胞質(zhì)和細胞核中.同時，ATP可以作為信號分子用于調(diào)節(jié)細胞主動運輸［45］、神經(jīng)傳遞［46］和離子通道［47］，在細胞內(nèi)含量高且濃度穩(wěn)定.因此，ATP是一種理想的細胞內(nèi)源性信號放大分子.近年來，已開發(fā)了幾種利用細胞內(nèi)ATP作為燃料的DNA納米機器，用于細胞內(nèi)低豐度核酸靶標物的檢測.

Xu等［48］基于ATP驅(qū)動的鏈置換級聯(lián)擴增策略，設(shè)計了一種腫瘤靶向miRNA激活的納米光敏劑Y-motif/FA@HyNP.該光敏劑在水溶液中穩(wěn)定性好，可以特異性、高靈敏地檢測miRNA，其檢出限為0.4 pmol/L.如圖9（A）所示，在半導(dǎo)體量子點表面修飾葉酸及功能DNA（Y-motif）構(gòu)成納米光敏劑.當(dāng)利用葉酸靶向腫瘤細胞后，細胞內(nèi)miRNA與Y-motif特異性結(jié)合，釋放出其中的ATP適配體.適配體與胞內(nèi)高豐度ATP結(jié)合后，可進一步釋放出miRNA特異性結(jié)合序列參與循環(huán)反應(yīng).同時，Y-motif構(gòu)象變化導(dǎo)致猝滅劑脫離，恢復(fù)量子點熒光及光動力學(xué)治療功能.如圖9（B）所示，與正常細胞相比，Y-motif/FA@HyNP在癌細胞中有明顯的熒光信號，表明納米光敏劑可通過葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用靶向腫瘤細胞.熒光成像結(jié)果表明，Y-motif/FA@HyNPs以細胞內(nèi)ATP為燃料，可對MCF-7細胞中低水平內(nèi)源核酸Let-7a進行靈敏熒光成像.

Ye等［49］報道了一種簡單、高度集成的DNA納米機器，通過ATP與適配體的特異性結(jié)合驅(qū)動納米機器產(chǎn)生熒光信號，對細胞內(nèi)miRNA進行成像.該納米機器可高靈敏、特異性地響應(yīng)miRNA，熒光強度與T堿基濃度在100 pmol/L～2 nmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系.如圖10（A）所示，單鏈發(fā)夾搖臂及功能雙鏈結(jié)合于金納米顆粒上構(gòu)成納米機器.當(dāng)細胞內(nèi)靶標核酸與發(fā)夾搖臂結(jié)合后，發(fā)夾DNA打開，其端部序列自由擺動，與金顆粒表面功能雙鏈雜交，競爭下修飾熒光基團的ATP適配體.同時，細胞內(nèi)ATP可進一步與適配體作用，使其遠離金納米顆粒，恢復(fù)熒光信號.基于細胞內(nèi)ATP的高豐度性，可使大量適配體脫離納米顆粒進而產(chǎn)生高強度熒光信號.如圖10（B）和（C）所示，該納米機器可以區(qū)分人胚胎腎細胞（HEK-293T）和人胚肺成纖維細胞（MRC-5）中不同濃度的miRNA-21，并靈敏地檢測到HEK-293T中低表達的miRNA-21，表明該納米機器對細胞內(nèi)miRNA成像的良好適用性和準確性，且成像時間可持續(xù)2 h.

Fig.10 DNA nanomachine powered by endogenous ATP sense target in living cells[49]

Xian等［50］開發(fā)了一種ATP驅(qū)動光激活DNA walker，用于活細胞中miRNA的時空可控?zé)晒獬上?該DNA walker可以高靈敏響應(yīng)miRNA，且熒光強度與miR-21的濃度對數(shù)在100 pmol/L～5 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.如圖11（A）所示，上轉(zhuǎn)換納米顆粒作為載體負載DNA發(fā)夾（HP）探針構(gòu)成納米機器.待其進入細胞后，在近紅外光激發(fā)下上轉(zhuǎn)換納米顆粒發(fā)出紫外光，激活DNA發(fā)夾位點使其斷裂，暴露靶標結(jié)合序列.靶標物miR-21與其結(jié)合釋放激活單鏈，參與DNA walker激活循環(huán)中.與Ye等［49］報道的DNA納米機器原理類似，此DNA walker利用上轉(zhuǎn)換納米顆粒產(chǎn)生的紫外光激活傳感器，并利用ATP與適配體作用釋放熒光信號報告單元，具備時空可控性.如圖11（B）所示，該DNA Walker可對細胞內(nèi)miR-21進行檢測和熒光成像.

半導(dǎo)體或金納米顆粒對于組裝在其表面的DNA組分具有很強的保護性，可在一定程度上抵抗酶的降解，從而使納米機器具有較好的穩(wěn)定性.實驗結(jié)果也表明，上述報道探針的穩(wěn)定性好，具有一定的抗干擾能力.但是ATP輔助信號放大方法以DNA適配體與分子相互作用為基礎(chǔ)，而ATP與適體之間的相互作用不穩(wěn)定，其復(fù)合物在復(fù)雜的細胞內(nèi)微環(huán)境中容易被生物分子（如酶和蛋白質(zhì)）降解，將嚴重影響信號放大效率.

Fig.11 Imaging of intracellular microRNA with near-infrared light controllable DNA walker driven by ATP[50]

Fig.12 Nanoprobe based on metal ion-assisted signal amplification for miRNA imaging[53]

5 內(nèi)源性離子輔助信號放大

細胞內(nèi)金屬離子（K+，Mg2+，Ca2+等）參與細胞分裂、神經(jīng)信號傳遞等生理過程，對維持細胞結(jié)構(gòu)及蛋白酶活性具有重要作用，且其在細胞內(nèi)濃度較高.如細胞內(nèi)Mg2+通常由各種轉(zhuǎn)運蛋白和離子通道控制，其濃度保持在0.5～1.2 mmol/L范圍內(nèi)［51，52］.利用金屬離子作為信號放大基質(zhì)或參與信號放大反應(yīng)過程，可有效提高檢測靈敏度.

Wang等［53］開發(fā)了一種負載DNAzyme的金納米顆粒熒光探針，用于放大檢測細胞內(nèi)miRNA.該納米探針在Mg2+存在時可高靈敏地檢測靶標miR-21，檢出限為10 pmol/L，且其生物相容性好，具有一定的抗干擾能力，適用于細胞中miRNA成像.如圖12（A）所示，該探針由金納米顆粒和分裂DNAzyme雜交的底物序列組成.熒光基團靠近猝滅劑，其熒光信號被猝滅.當(dāng)探針進入細胞后，靶標物miRNA與分裂的DNAzyme結(jié)合形成活性二級結(jié)構(gòu)，在細胞內(nèi)Mg2+催化作用下發(fā)生斷裂，釋放修飾有熒光基團的核酸序列及靶標物，產(chǎn)生熒光信號.同時，釋放的靶標物可參與下一循環(huán)，大量熒光基團被釋放產(chǎn)生高強度熒光信號，從而對細胞內(nèi)miRNA進行檢測.如圖12（B）所示，在細胞生理濃度Mg2+條件下，細胞熒光強度隨著探針孵育時間逐漸增強，與之對比，正常細胞（L02）始終未觀察到明顯的熒光，說明該探針利用細胞固有Mg2+催化作用，可對腫瘤細胞及正常細胞中miRNA進行成像，并依此區(qū)分細胞.

6 總結(jié)與展望

本文介紹了內(nèi)源性核酸、酶、蛋白質(zhì)、ATP和金屬離子輔助信號放大探針的構(gòu)建和響應(yīng)機理，總結(jié)了其在細胞內(nèi)低豐度靶標物檢測及相關(guān)病理研究中的應(yīng)用.該類探針基于納米顆粒（如金納米顆粒、介孔二氧化硅及聚合物膠束等）的高負載性，利用細胞內(nèi)固有的分子為放大基質(zhì)，實現(xiàn)原位信號放大.與常規(guī)細胞內(nèi)信號放大策略相比，該信號放大策略不依賴外源性輔助物，所用納米顆粒均具有良好的生物相容性，且其降解物易被機體排出體外，因此不會對機體造成影響.在探針設(shè)計中充分利用了生物體系的多樣性，在靶標相關(guān)生化信息的超靈敏獲取中展現(xiàn)其獨特優(yōu)勢.

當(dāng)然，該策略面臨眾多困難與挑戰(zhàn)，如核酸輔助信號放大策略的檢測對象局限于核酸，且核酸探針在細胞復(fù)雜環(huán)境中不穩(wěn)定，降解后將影響信號放大效率及檢測準確性；而ATP輔助信號放大方法由于ATP與適配體作用力弱，在細胞內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境中進一步被削弱，進而影響其信號放大效率；基于蛋白輔助信號放大策略構(gòu)建的負載型熒光納米探針在活體應(yīng)用中存在染料泄露產(chǎn)生假陽性信號的問題.因此，如何克服內(nèi)源性分子輔助信號放大策略的缺點，發(fā)展更為完善的信號放大方法用于低豐度重要疾病標志物的檢測，在熒光成像應(yīng)用方面做出新的突破，是研究者努力的方向.如利用細胞內(nèi)ATP高豐度特性，設(shè)計高親和力的信號報告單元，可避免ATP-信號體復(fù)合物在復(fù)雜環(huán)境中信號強度受限的問題.總之，基于內(nèi)源性分子輔助信號放大方法的提出為熒光探針在生化傳感領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了新的方向，也為揭示重要疾病標志物與疾病潛在關(guān)系提供了有力的工具.