小分子基溫敏聚合物納米粒子的制備及在近紅外二區(qū)熒光成像與光熱治療中的應(yīng)用

陳尚鈺，沈清明，孫鵬飛，范曲立

（南京郵電大學(xué)先進(jìn)材料研究所,南京 210023）

近年來，精準(zhǔn)診斷與實(shí)時(shí)治療并存的光診療平臺在精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域備受關(guān)注［1，2］.其中，可以將吸收的光子能量同時(shí)轉(zhuǎn)換為熒光信號與熱能的光診療平臺備受矚目，該平臺可以實(shí)現(xiàn)高分辨、深穿透的熒光成像（FI）和實(shí)時(shí)、非入侵的光熱治療（PTT）［3～7］.與傳統(tǒng)的生物窗口（波長＜900 nm）相比，波長在1000～1700 nm范圍的近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ）生物窗口具有更高的成像分辨率和更深的組織穿透能力，這是因?yàn)樯锝M織在該窗口的光子散射和自發(fā)熒光較弱［8～14］.因此，基于該窗口實(shí)施的NIR-ⅡFI及其介導(dǎo)的PTT光診療平臺極具發(fā)展前景.迄今，已經(jīng)發(fā)展了多種具有NIR-Ⅱ熒光特性的光診療分子［15～18］.其中，沒有重金屬毒性威脅的有機(jī)分子，包括有機(jī)小分子和共軛聚合物，更具有臨床轉(zhuǎn)換的潛力［19～21］.然而，大部分報(bào)道的有機(jī)分子都缺乏功能性設(shè)計(jì)，并且面臨固有的疏水問題，導(dǎo)致不可避免的嚴(yán)重聚集，從而引起這些有機(jī)分子NIR-Ⅱ熒光的猝滅，顯著影響了生物成像的質(zhì)量，不利于最終的診療［22～25］.因此，設(shè)計(jì)功能性、水溶的有機(jī)分子，提高其NIR-Ⅱ熒光亮度是亟待解決的問題.

本文以有機(jī)小分子4，9-二（5-9H-芴-2-基-噻吩-2-基）-6′，7-聯(lián)苯［1，2，5］噻二唑并［3，4-g］喹喔啉（TQF）為前驅(qū)體，將其修飾成可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（RAFT）鏈轉(zhuǎn)移劑［TQF-苯基硫代鏈轉(zhuǎn)移劑（CTA）］，以TQF-CTA為鏈轉(zhuǎn)移劑，以偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，成功引發(fā)溫敏單體N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm）和親水單體甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（OEGMA）發(fā)生RAFT聚合反應(yīng)，合成了具有良好水溶性和較低臨界溶解溫度（LCST）的溫敏共聚物TQF-P（NIPAAm-co-OEGMA）（TPNO）.以該聚合物制備的納米粒子TPNO NPs在溫度從LCST以下升高至LCST以上時(shí)表現(xiàn)出明顯的粒徑變化和顯著的熒光增強(qiáng)行為（2.2倍），并伴隨有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力（PCE=29.8%）.最后，TPNO NPs被成功應(yīng)用于明亮、高分辨NIR-ⅡFI引導(dǎo)的PTT，在精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

4-氰基-4-［（苯基硫代羰基）硫代］戊酸、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）、N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm）和甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（OEGMA），純度97%，上海百靈威科技有限公司；四氫呋喃（THF）、二氯甲烷（DCM）、1，4二氧六環(huán)、N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）、三乙胺和偶氮二異丁腈（AIBN），純度98%，上海西格瑪奧德里奇公司；4T1細(xì)胞、DMEM培養(yǎng)基、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）毒性試劑盒和4T1荷瘤裸鼠，南京凱基生物股份有限公司.

Bruker Ultra Shield Plus 400 MHz型核磁共振波譜儀（NMR），瑞士Bruker公司；Shim-pack GPC-80 X型凝膠滲透色譜（GPC），日本島津公司；日立HT7700型透射電子顯微鏡（TEM，100 kV），日立江蘇蘇美達(dá)儀器設(shè)備有限公司；ALV-7004型光散射光譜儀（DLS），德國郎根公司；Shimadzu UV-3600型紫外-可見-近紅外（UV-Vis-NIR）分光光度計(jì)，日本島津公司；Fluorolog-3型近紅外二區(qū)熒光光譜儀，美國Horiba公司；LR-ISP-808型半導(dǎo)體激光器，808 nm，10 W，長春新產(chǎn)業(yè)光電科技有限公司；Fotric 225型光熱成像儀，日本島津公司；640×512像素體內(nèi)/體外NIR-Ⅱ熒光成像儀，配有50/100 mm透鏡和640×512像素的二維InGaAs陣列，武漢光映美科技有限公司.

1.2 TQF-CTA TPNO的合成

目標(biāo)化合物的合成路線如Scheme 1所示.參照文獻(xiàn)［12］方法合成TQF.

Scheme 1 Synthetic route of TPNO

在除水除氧條件下，將168 mg（0.1 mmol）TQF，50 mg（0.5 mmol）三乙胺和3 mL干燥除水的THF加入10 mL圓底燒瓶中，于室溫下攪拌30 min，逐滴滴加30 mg（0.48 mmol）乙二胺，反應(yīng)12 h，經(jīng)二氯甲烷和水多次萃取后，收集有機(jī)相并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到的綠色固體粗產(chǎn)物無需純化可直接進(jìn)行下一步反應(yīng).

將上一步反應(yīng)產(chǎn)物、93 mg（0.3 mmol）4-氰基-4-［（苯基硫代羰基）硫代］戊酸和97 mg（0.5 mmol）EDC完全溶解于2.5 mL干燥除水的二氯甲烷中，在除氧冰浴條件下，緩慢滴加0.2 mL（0.95 mmol）DIPEA，最后在室溫下反應(yīng)12 h；經(jīng)二氯甲烷和水多次萃取后，收集有機(jī)相并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，再經(jīng)石油醚沉降對其進(jìn)行純化，最終得到188 mg綠色固體產(chǎn)物TQF-CTA，產(chǎn)率為71%.

將60 mg（0.023 mmol）TQF-CTA，0.54 mg（0.0034 mmol）AIBN，500 mg（0.9 mmol）NIPAAm和120 mg（0.9 mmol）OEGMA溶解于2.5 mL 1，4二氧六環(huán)溶劑中，在N2氣保護(hù)下，于65℃攪拌反應(yīng)6 h；最后通過石油醚沉降提純得到450 mg綠色固體TPNO，產(chǎn)率為63%.

1.3 TPNO的LCST溫度測定

將TPNO溶于水即可制備TPNO NPs.制備2 mg/mL的TPNO NPs儲備液，稀釋成0.1 mg/mL，通過DLS及其配套的溫控設(shè)備，監(jiān)測并記錄其在不同溫度條件下的粒徑尺寸（流體動力學(xué)直徑，Dh）和代表濁度的光散射強(qiáng)度（Is/I0）變化.以溫度為橫坐標(biāo)，Dh和Is/I0分別為縱坐標(biāo)，繪制關(guān)系曲線，其中拐點(diǎn)對應(yīng)的溫度即代表聚合物TPNO的LCST溫度.

1.4 TPNO NPs的組織穿透能力測定

將制備的TPNO NPs母液裝入直徑為1 mm的細(xì)管中，然后將超市購買的雞胸肉切成不同厚度的薄片，用直尺比對雞肉高度并覆蓋于裝了TPNO NPs溶液的小管上，利用近紅外二區(qū)熒光成像儀對其進(jìn)行測試.將檢測的信號用計(jì)算機(jī)軟件分析處理后，得到不同成像深度的NIR-ⅡFI圖片，通過對比、分析其NIR-Ⅱ熒光強(qiáng)度值以評估TPNO NPs的組織穿透能力.

1.5 TPNO NPs的血管與腫瘤的高分辨NIR-ⅡFI

本文涉及的所有小動物實(shí)驗(yàn)均按照江蘇省實(shí)驗(yàn)動物管理局批準(zhǔn)的《中國國家實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理?xiàng)l例》規(guī)范進(jìn)行，并獲得先聲生物科技有限公司動物倫理委員會批準(zhǔn).在尾靜脈注射150μL TPNO NPs母液到4T1荷瘤裸鼠體內(nèi)10 min后，利用異氟烷對小鼠進(jìn)行氣體麻醉，固體好身位后通過NIR-Ⅱ活體成像儀對其全身血管，尤其是腹部和后肢腿部的血管脈絡(luò)進(jìn)行高分辨的NIR-ⅡFI.同時(shí)還監(jiān)測了不同時(shí)間點(diǎn)小鼠腫瘤處熒光信號的富集情況.最后，通過軟件處理分析圖片結(jié)果并得到相應(yīng)的熒光信號強(qiáng)度值.熒光信號強(qiáng)度與背景噪音信號強(qiáng)度的比值（SBR）按公式SBR=Is/In計(jì)算，其中參數(shù)Is和In分別代表目標(biāo)區(qū)域的熒光信號強(qiáng)度值和遠(yuǎn)離目標(biāo)區(qū)域的正常組織，即背景的噪聲信號強(qiáng)度值.

1.6 TPNO NPs的光熱轉(zhuǎn)化能力

為研究TPNO NPs的光熱轉(zhuǎn)化能力，將150μL 0.1 mg/mL的TPNO NPs裝入200μL離心管中，用808 nm激光器以生物組織最大允許功率曝光（MPE）的強(qiáng)度（0.33 W/cm2）持續(xù)照射5 min，隨后關(guān)閉激光器使其自然冷卻，并用光熱成像儀記錄其溫度變化，以每隔30 s的溫度變化值繪制升溫降溫曲線.參考文獻(xiàn)［26］方法計(jì)算得到TPNO NPs的光熱轉(zhuǎn)化效率（PCE）.

1.7 TPNO NPs對細(xì)胞的PTT評估

利用MTT法，取2組培養(yǎng)好的96孔細(xì)胞板，分別加入不同濃度用不含血清的DMEM稀釋的TPNO NPs溶液，將其放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出96孔板，吸出溶液，加入新鮮的不含血清的DMEM培養(yǎng)液，用808 nm激光器對其中一個(gè)96孔板做5 min光照處理.更換培養(yǎng)基后，讓細(xì)胞自然凋亡12 h，再在每個(gè)孔中加入20μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出所有液體，加入200μL二甲亞砜，用酶標(biāo)儀測定每個(gè)孔在490 nm處的吸收值（該吸收值大小對應(yīng)細(xì)胞活性高低），分析處理數(shù)據(jù)后可評估TPNO NPs在體外對細(xì)胞PTT的療效.

2 結(jié)果與討論

2.1 溫敏聚合物TPNO的的合成與表征

首先利用1H NMR對TQF-CTA的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征與確認(rèn)，結(jié)果見本文支持信息圖S1.隨后對其光學(xué)性能進(jìn)行了表征.由本文支持信息圖S2可知，TQF-CTA在THF中表現(xiàn)出較寬的近紅外吸收（600～900 nm）以及NIR-Ⅱ發(fā)射（900～1400 nm）峰形，其最大吸收與發(fā)射峰位置分別位于734 nm和988 nm.經(jīng)計(jì)算得出TQF-CTA在最大吸收處的摩爾消光系數(shù)為4.8 L·g-1·cm-1，表明該小分子基鏈轉(zhuǎn)移劑具有較好的光吸收能力（圖S3，見本文支持信息）.在808 nm激光輻照下，測得TQF-CTA在THF中的熒光量子效率（QY）為10.3%（圖S4，見本文支持信息）.以上結(jié)果表明，TQF-CTA有潛力實(shí)現(xiàn)明亮的NIR-ⅡFI.

以TQF-CTA為基礎(chǔ)，通過一步簡單的RAFT聚合，合成了含有溫敏單體NIPAAm和親水單體OEGAM的溫敏共聚物TPNO.圖S5（見本文支持信息）給出TPNO的1H NMR譜圖，δ3.5和4.0附近為NIPAAm和OEGMA單體的信號，同時(shí)由圖S6（見本文支持信息）的GPC數(shù)據(jù)可知，TPNO的數(shù)均分子量（Mn）和分子量分布值分別為22000和1.41，這些數(shù)據(jù)證明了聚合反應(yīng)的成功進(jìn)行.

2.2 TPNO NPs的制備及其溫敏性能與光學(xué)性能表征

Scheme 2給出TPNO NPs的模擬組裝示意圖.在該LCST型溫敏聚合物TPNO中，NIPAAm提供溫敏特性，OEGMA提供水溶性.同時(shí)，基于對LCST型聚合物的一個(gè)普通認(rèn)知，當(dāng)溫度低于LCST時(shí)，TPNO在納米粒子內(nèi)是溶解舒展的，有著較好的水溶性，所以表現(xiàn)為粒徑較小、分散較為均勻的納米粒子；而當(dāng)溫度高于LCST時(shí)，TPNO在納米粒子內(nèi)呈收縮狀態(tài)，此時(shí)聚合物水溶性變差，聚合物疏水部分自發(fā)聚集在一起，從而表現(xiàn)出較大的納米粒子粒徑.

Scheme 2 Schematic illustration of the self-assembly process of TPNO NPs

為驗(yàn)證上述推測，首先通過DLS測定了該溫敏聚合物的LCST，通過監(jiān)測不同溫度條件下Dh和光散射強(qiáng)度的變化，測得TPNO的LCST約為35℃［圖1（A）］.隨后，研究了TPNO NPs的溫敏性能對其粒徑的影響.在不同溫度下通過DLS對TPNO NPs的Dh進(jìn)行監(jiān)測.由圖1（B）可見，在低于LCST溫度的測試條件下，TPNO NPs的Dh和PDI分別為92 nm和0.181，而當(dāng)溫度高于LCST達(dá)到37℃時(shí)，其Dh和PDI值分別增大至188 nm和0.363.同樣的結(jié)果在圖1（C）和（D）中也可以觀察到，隨著溫度升高至LCST以上，從TEM照片中可以觀察到顯著的粒徑變化.這些結(jié)果都有力地證實(shí)了上述的組裝推測.

Fig.1 LCST measurement of TPNO NPs(A),D h(B)and TEM images of TPNO NPs under 25℃(C)and 37℃(D)

Fig.2 Normalized absorption spectra(A)and NIR-II fluorescence spectra(B)of TPNO NPs aqueous solutions at different temperatures

圖2（A）示出水相中測得的不同溫度下TPNO NPs的吸收光譜圖.可以看出，溫度對其吸收峰形的影響較小，不同溫度條件下測得的吸收圖譜基本一致.TPNO NPs的吸收主峰位于690 nm，相對于有機(jī)相藍(lán)移了44 nm.圖2（B）為TPNO NPs在不同溫度下的熒光發(fā)射圖譜.與有機(jī)相類似，TPNO NPs在水相中也有著較好的NIR-Ⅱ熒光信號，并在LCST溫度以上表現(xiàn)出一個(gè)2.2倍高的熒光信號增強(qiáng).從圖2（B）插圖中的NIR-Ⅱ熒光照片亦可以直觀地觀察到熒光亮度的變化.同時(shí)，隨著溫度的升高，TPNO NPs的熒光發(fā)射主峰從941 nm移動到931 nm處.該峰的藍(lán)移也間接證明了由于NIPAAm性質(zhì)的變化起到的保護(hù)作用.此時(shí)的疏水染料核被收縮的NIPAAm單體緊密包裹起來，顯著降低了其染料核之間的聚集程度，從而增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度.計(jì)算得到的TPNO NPs的QY值為1.5%（見本文支持信息圖S7）.圖3（A）示出了對TPNO NPs的組織穿透能力的評估情況，可見TPNO NPs在雞肉厚度增加到8 mm時(shí)仍可觀察到NIR-Ⅱ熒光信號，證明其有著較好的組織穿透能力.圖3（B）結(jié)果表明，在TPNO NPs濃度為0.1 mg/mL時(shí)，連續(xù)使用0.33 W/cm2的808 nm激光器對其照射30 min，TPNO NPs的溫度快速從室溫上升，并在30 min時(shí)達(dá)到約70℃.但此時(shí)其在808 nm處的吸收值仍基本保持不變.這些優(yōu)異的光學(xué)性能使得TPNO NPs有潛力應(yīng)用于后續(xù)的活體NIR-ⅡFI.

Fig.3 Fluorescence intensity of the inset NIR-II images at different depth(A)and absorption changes of TPNO NPs at 808 nm(A808)under 808 nm laser irradiation for 30 min(B)

2.3 TPNO NPs對血管與腫瘤的高分辨NIR-Ⅱ熒光成像

通過尾靜脈注射150μL 2 mg/mL的TPNO NPs到4T1荷瘤鼠中以實(shí)現(xiàn)其對小鼠的NIR-ⅡFI，并利用NIR-Ⅱ活體成像儀實(shí)時(shí)監(jiān)測其目標(biāo)區(qū)域的熒光信號.由圖4可以清晰觀察到小鼠全身的血管脈絡(luò).對小鼠后肢腿部（藍(lán)色虛線框）和腹部（紅色虛線框）進(jìn)行局部放大并分析其對應(yīng)的熒光信號強(qiáng)度（圖5和圖6），可以估算出目標(biāo)區(qū)域單根血管的血管寬度，分別為0.75 mm和0.45 mm，并計(jì)算得到各自對應(yīng)血管處的SBR，分別為16.7與12.5.這些結(jié)果證明了TPNO NPs具有優(yōu)異的體內(nèi)NIR-ⅡFI能力.由圖4可以看出，隨著時(shí)間的延長，小鼠腫瘤處的熒光信號逐漸增強(qiáng)，并在12 h時(shí)達(dá)到最大.從對應(yīng)的腫瘤處量化的熒光信號值變化情況（圖6）也可以得出相同結(jié)論.最后，在24 h時(shí)，斷頸處死小鼠后得到解剖離體的腫瘤與主要臟器以評估TPNO NPs在小鼠體內(nèi)的代謝分布情況.從圖7可以發(fā)現(xiàn)，腫瘤、肝臟與脾臟處表現(xiàn)出明顯的NIR-Ⅱ熒光信號，證明了TPNO NPs在其中的高富集.

Fig.4 NIR-II fluorescence images of 4T1 tumor-bearing mice treated with TPNO NPs(2 mg/mL,150μL)at different monitoring time under 808 nm laser irradiation

Fig.5 The corresponding cross-sectional intensity profile along the red dotted line in Fig.4 after 10 min injection

Fig.6 The corresponding quantification analysis of fluorescence intensity from tumor region

Fig.7 The ex vivo NIR-II images of tumors and major organs as well as their corresponding fluorescence intensity

2.4 TPNO NPs的體外光熱性能與細(xì)胞PTT研究

鑒于TPNO NPs較好的光吸收能力以及在808 nm處較強(qiáng)的吸收，進(jìn)一步對其光熱性能進(jìn)行了研究.使用808 nm激光器，以PTT最大允許功率（0.33 W/cm2）對TPNO NPs溶液（0.1 mg/mL，150μL）照射來進(jìn)行升溫降溫實(shí)驗(yàn)，并通過熱成像儀實(shí)時(shí)記錄TPNO NPs溫度值的變化.從圖8（A）的溫度變化曲線可以看出，TPNO NPs在5 min內(nèi)可以快速升溫到約65℃，該溫度可有效殺傷腫瘤細(xì)胞.通過對應(yīng)降溫曲線的分析及線性曲線擬合，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的光熱公式，計(jì)算得出TPNO NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率為29.8%.多次反復(fù)對TPNO NPs進(jìn)行激光照射與自然冷卻實(shí)驗(yàn)［圖8（B）］，發(fā)現(xiàn)TPNO NPs有著良好的光熱穩(wěn)定性能.這些優(yōu)異的光熱性能為TPNO NPs實(shí)現(xiàn)理想PTT提供了可能性.

Fig.9 NIR-II fluorescence intensity of 4T1 cells incubated with TPNO NPs

Fig.10 Cell viability of 4T1 cells treated with TPNO NPs at different concentrations without or with 808 nm laser irradiation(0.33 W/cm2)

選用4T1腫瘤細(xì)胞，通過MTT法進(jìn)一步評估了TPNO NPs對體外細(xì)胞的PTT療效.首先，通過NIR-Ⅱ熒光成像儀證明了TPNO NPs在與癌細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后可以很好地被腫瘤細(xì)胞攝取，其熒光信號強(qiáng)度明顯高于純細(xì)胞對照組（圖9）.圖10為通過MTT法評價(jià)的TPNO NPs的潛在細(xì)胞暗毒性與光照毒性.可見，在不同濃度的TPNO NPs與4T1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，光照處理5 min的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞活性抑制效果，其細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯下滑狀態(tài)，尤其是在TPNO NPs為2 mg/mL的高濃度下其細(xì)胞活性不足20%.而對于無光照處理的純細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，即使在2 mg/mL的濃度下也表現(xiàn)出95%以上的細(xì)胞相對活性，這說明TPNO NPs未表現(xiàn)出明顯的體外細(xì)胞毒性.圖11所示共聚焦成像結(jié)果也證明了TPNO NPs在光照后產(chǎn)生的熱可以起到一個(gè)很好的細(xì)胞殺傷效果，可以觀察到細(xì)胞基本全部從綠色的活細(xì)胞變?yōu)榧t色的由光熱誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞.所有這些數(shù)據(jù)均表明TPNO NPs對體外腫瘤細(xì)胞有著良好的PTT效果.

Fig.11 Fluorescence images of live(green)(A)and dead(red)cells(B)without or with 808 nm laser irradiation

3 結(jié) 論

開發(fā)了一種基于小分子TQF-CTA的溫敏聚合物TPNO，該聚合物可直接溶于水形成溫敏納米粒子TPNO NPs.當(dāng)溫度高于LCST時(shí)，TPNO NPs表現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)（2.2倍）行為，計(jì)算得到的QY為1.5%，可以實(shí)現(xiàn)對活體小鼠的高分辨NIR-ⅡFI.同時(shí)，TPNO NPs還具有良好的光熱性能，光熱轉(zhuǎn)換效率為29.8%，并在體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對4T1腫瘤細(xì)胞的顯著PTT療效.綜上所述，這種溫敏的TPNO NPs在生物成像與光診療領(lǐng)域表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20220392.