腎小球?yàn)V過(guò)率活體實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光示蹤劑的研究進(jìn)展

丁奕如，張超穎，謝賀新

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237）

腎臟是人體新陳代謝過(guò)程的重要器官，通過(guò)過(guò)濾血液生成尿液排泄、清除代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)血容量，維持電解質(zhì)和酸堿平衡，從而保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［1，2］.腎小球是血液和尿路之間的過(guò)濾屏障，對(duì)于成年人而言，每天約有180 L的血液流經(jīng)腎臟，隨后通過(guò)腎小球的濾過(guò)作用和腎小管的重吸收作用產(chǎn)生尿液［3，4］.

急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）是一種臨床常見(jiàn)的急性腎臟疾病.急性腎損傷臨床表現(xiàn)主要為腎功能迅速下降或喪失，其主要特征有血液中廢物溶質(zhì)（如尿素和肌酐）水平升高、少尿及電解質(zhì)紊亂［5］.根據(jù)全球權(quán)威腎臟醫(yī)學(xué)組織KDIGO（Kidney Disease：Improving Global Outcomes）共識(shí)定義，48 h內(nèi)血清肌酐升高至26.5 mmol/L，或在7 d內(nèi)升高至基線的1.5倍，或尿量少于0.5 mL·kg-1·h-1持續(xù)6 h，即可定義為急性腎損傷.

通常，急性腎損傷的病因是多因素的，其中膿毒癥、休克和腎毒性占據(jù)了大多數(shù)［6］.急性腎損傷的發(fā)病率在所有住院患者中為1%～7%，在重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者中高達(dá)30%～50%，并且伴有非常高的死亡率（約50%）.全球每年約有170萬(wàn)人的死亡與急性腎損傷密切相關(guān)，并且在存活患者中容易發(fā)展成慢性腎臟病（約20%）或是終末期腎臟?。s5%）［7］.同時(shí)，急性腎損傷也經(jīng)常作為其它綜合征（如心衰、肝功能衰竭和膿毒癥等）的一部分出現(xiàn)，而這些綜合征本身也會(huì)導(dǎo)致大量的發(fā)病率和死亡率.

在腎功能受損的情況下，對(duì)腎功能的準(zhǔn)確評(píng)估對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)腎功能衰竭、評(píng)估干預(yù)措施和監(jiān)測(cè)腎功能變化至關(guān)重要［8］.盡管在過(guò)去的近100年里，診斷技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但腎臟疾病的早期診斷與發(fā)現(xiàn)仍然非常具有挑戰(zhàn)性，特別是在重癥監(jiān)護(hù)病房中的易發(fā)患者中.血清肌酐和尿量是診斷急性腎損傷的非常有效的手段，但這兩項(xiàng)指標(biāo)都是腎臟損傷的較晚期標(biāo)志，血清肌酐還會(huì)受到年齡、性別、飲食和藥物等的影響.此外，腎臟的功能狀態(tài)也可以通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)率、腎血流量和腎小管重吸收或各種化合物的分泌來(lái)評(píng)估.其中，腎小球?yàn)V過(guò)率（Glomerular filtration rate，GFR，即在單位時(shí)間內(nèi)腎產(chǎn)生的濾液量）一直以來(lái)都被認(rèn)為是評(píng)估腎功能的最佳指標(biāo)［9］.然而，GFR難以進(jìn)行直接測(cè)定，因此通常應(yīng)用特定標(biāo)志物的腎臟清除率來(lái)進(jìn)行推測(cè).一種物質(zhì)的腎臟清除率被定義為每單位濃度從血漿中清除該物質(zhì)的速率［10］，不同的標(biāo)志物通常具有不同的GFR計(jì)算方法.

早期的GFR標(biāo)志物主要是內(nèi)源性標(biāo)志物，包括血清肌酐（Scr）［11，12］、尿素（Urea）［13］、β2-微球蛋白（β2-M）［14，15］、β-痕跡蛋白（BTP）［16］以及血清胱抑素C（Cystatin C，CysC）［17，18］，然而這些內(nèi)源性標(biāo)志物的檢測(cè)通常操作方法繁瑣、準(zhǔn)確性偏低［19，20］.另外，內(nèi)源性標(biāo)志物不可避免地受到個(gè)體差異的影響［21］，并且這些標(biāo)志物大部分是蛋白質(zhì).對(duì)這些標(biāo)志物進(jìn)行高靈敏度和準(zhǔn)確度的檢測(cè)通常依賴于復(fù)雜、精密的儀器設(shè)備，而且一般操作耗時(shí)和成本昂貴.迄今為止，尚未尋找到完美的內(nèi)源性標(biāo)志物，也仍未開(kāi)發(fā)出精確和可靠的估計(jì)方法.

Fig.1 Structures of exogenous tracers for GFR

為了克服上述內(nèi)源性標(biāo)志物的問(wèn)題，研究人員開(kāi)始將目光轉(zhuǎn)向GFR外源性標(biāo)志物的開(kāi)發(fā).外源性標(biāo)志物幾乎不受個(gè)體因素的影響，具有更高的個(gè)體間重現(xiàn)性.目前常用的外源性標(biāo)志物主要有菊粉（Inulin）［9］、碘酞酸鹽（Iothalamate）［22］和碘海醇（Iohexol）［23～25］等（圖1）.這些標(biāo)志物可以用于檢測(cè)其在血漿中的清除率，但一般需要應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）或X射線熒光法（X-ray fluorescence）進(jìn)行檢測(cè)，并且需要費(fèi)時(shí)費(fèi)力多次采集血液和尿液樣本，難以適合在臨床環(huán)境中進(jìn)行GFR的連續(xù)監(jiān)測(cè)［20，26，27］.為了解決這些問(wèn)題，放射性的外源性GFR標(biāo)志物［如51Cr-EDTA（EDTA=乙二胺四乙酸）［28］，99mTc-DTPA（DTPA=二乙基三胺五乙酸）［29］等］也被開(kāi)發(fā)出來(lái).應(yīng)用這些放射性的試劑在監(jiān)測(cè)GFR中準(zhǔn)確性更高，并可實(shí)現(xiàn)連續(xù)檢測(cè).然而這個(gè)過(guò)程中需要使用到價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備，且監(jiān)測(cè)對(duì)象需較長(zhǎng)時(shí)間暴露在輻射中，很大程度上也限制了這些放射性標(biāo)志物的臨床應(yīng)用［30］.

分子熒光探針的成像技術(shù)作為一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的非侵入性檢測(cè)方法，其在活體成像研究、臨床疾病診斷等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景.近年來(lái)，一系列基于熒光技術(shù)的GFR示蹤劑被設(shè)計(jì)、發(fā)展出來(lái).同時(shí)，為了配合這些熒光示蹤劑的應(yīng)用，各種類型的檢測(cè)儀器也陸續(xù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，這些新型示蹤分子和檢測(cè)儀器在急性腎損傷的臨床檢測(cè)與診斷應(yīng)用中取得了重要的進(jìn)展［31］.研究表明，外源性GFR熒光示蹤劑的消除率可以在相關(guān)檢測(cè)儀器的幫助下通過(guò)皮膚實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)的監(jiān)測(cè).與傳統(tǒng)的方法相比，這一方法有效避免了頻繁抽血和后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，顯著提升了GFR監(jiān)測(cè)的效率與操作的便捷性.基于GFR熒光示蹤劑的分子結(jié)構(gòu)，本文對(duì)其相關(guān)研究進(jìn)行了歸納和總結(jié)，重點(diǎn)介紹了其設(shè)計(jì)策略以及臨床應(yīng)用的最新進(jìn)展.同時(shí)，對(duì)相應(yīng)的檢測(cè)儀器開(kāi)發(fā)進(jìn)行了簡(jiǎn)單介紹，并展望了這些基于GFR熒光示蹤劑的檢測(cè)技術(shù)引入臨床實(shí)踐的發(fā)展前景.

1 外源性腎小球?yàn)V過(guò)率熒光示蹤劑的設(shè)計(jì)策略

作為應(yīng)用于腎功能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的外源性GFR熒光示蹤劑，一般情況下需要滿足如下基本條件：（1）高生物兼容性，即在使用劑量范圍內(nèi)對(duì)檢測(cè)對(duì)象沒(méi)有危害性；（2）高穩(wěn)定性，除腎清除外無(wú)其它代謝途徑；（3）低血漿蛋白結(jié)合性和體內(nèi)組織攝取性及高尿液回收率；（4）高度親水性并在腎小球處自由濾過(guò)；（5）不被腎小管重吸收、分泌、合成或代謝［20］；（6）具有較長(zhǎng)的熒光的激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)及較高的熒光量子產(chǎn)率，使激發(fā)光與熒光信號(hào)能夠有效穿透身體組織，確保其檢測(cè)靈敏度.

為了滿足這些要求，目前GFR熒光示蹤劑在設(shè)計(jì)上主要采用以下兩種策略：（1）直接利用高親水性的小分子熒光化合物作為GFR示蹤劑；（2）基于親水性多糖大分子化合物與常見(jiàn)的非親水性熒光染料共價(jià)鍵連接，構(gòu)造可腎臟清除的大分子熒光GFR示蹤劑.基于高親水性小分子熒光化合物的GFR示蹤劑具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在后續(xù)合成生產(chǎn)中的品質(zhì)監(jiān)控相對(duì)更容易.但是，這類示蹤劑的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)相對(duì)較短，易于受到活體自發(fā)熒光信號(hào)以及穿透率的影響.相反，基于親水性多糖大分子化合物的示蹤劑，由于采用了與現(xiàn)有熒光染料共價(jià)鍵連接的方式來(lái)構(gòu)建，因此可以采用吸收和發(fā)射波長(zhǎng)以及熒光量子產(chǎn)率都較為理想的熒光染料，能夠有效克服自發(fā)熒光及熒光穿透率的影響.然而，這類示蹤劑一般采用具有一定分散性的多糖化合物，而非單一結(jié)構(gòu)的化合物，因此其結(jié)構(gòu)存在一定的不確定性.

目前，基于這兩種策略發(fā)展的熒光示蹤劑的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)一般都在可見(jiàn)光區(qū)域，一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)快速、動(dòng)態(tài)和準(zhǔn)確地測(cè)量腎臟清除率，均展現(xiàn)出了較好的臨床應(yīng)用前景.

2 小分子腎小球?yàn)V過(guò)率熒光示蹤劑

基于小分子熒光化合物的GFR熒光示蹤劑具有結(jié)構(gòu)明確、易于獲取的特點(diǎn).目前作為外源性GFR小分子熒光示蹤劑的主要是吡嗪類化合物.吡嗪及其衍生物通常具有較高的熒光量子產(chǎn)率、優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等特性.通過(guò)在吡嗪2位和5位引入吸電子基團(tuán)，在3位和6位引入給電子基團(tuán)（如3，6-二二甲氨基-2，5-氰基吡嗪，1）［圖2（A）］，可使其在最大吸收與發(fā)射波長(zhǎng)均在可見(jiàn)光范圍，斯托克斯位移接近100 nm，熒光量子產(chǎn)率約為0.4［32］.2011年，Rajagopalan等［33］首次將吡嗪衍生物應(yīng)用于熒光腎小球?yàn)V過(guò)率示蹤劑的設(shè)計(jì).他們以二羧酸吡嗪為母核結(jié)構(gòu)，通過(guò)在其2位和5位引入一系列具有親水性的取代基團(tuán)，設(shè)計(jì)、合成了10種化合物，并從血漿蛋白結(jié)合率、血漿清除率、尿液中回收注射劑量百分比（%ID）及腎小管分泌等方面對(duì)這些化合物進(jìn)行了篩選，最終篩選出3個(gè)較為理想的候選化合物2a（MB-102），2b和2c［圖2（A）］.在進(jìn)一步的大鼠模型實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)化合物2b具有與臨床GFR測(cè)量的“金標(biāo)準(zhǔn)”碘酞酸鹽基本相當(dāng)?shù)难獫{清除率和更高的尿液中的回收率［圖2（B）］.

在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)一步在吡嗪母核中引入高親水性的聚乙二醇（PEG）鏈作為取代基團(tuán).經(jīng)過(guò)系列篩選，發(fā)現(xiàn)化合物2d（PP-2338）和2e具有非常低的血漿蛋白結(jié)合，并且在大鼠模型實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)出了與碘酞酸鹽基本相當(dāng)?shù)难獫{清除率和尿液回收率以及更快的半衰期（2d：25 minvs.碘酞酸鹽：32 min）［34］.

Fig.2 Structures of pyrazine-based GFR tracer agents(A)and in vivo time-dependent fluorescence detection of 2b(B)[33]

為了進(jìn)一步評(píng)估化合物2d（PP-2338）在GFR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中的作用［35］，他們通過(guò)將大鼠5/6腎切除的方式構(gòu)建了急性腎損傷模型（圖3）.研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組健康大鼠相比，化合物2d在急性腎損傷大鼠中的透皮熒光信號(hào)降低的速率要慢得多，其熒光信號(hào)清除的半衰期由對(duì)照組的25 min增加至85 min.這一結(jié)果表明了大鼠熒光信號(hào)變化的速率與其腎清除率具有高度相關(guān)性，并且首次確定這類化合物在透皮熒光檢測(cè)中的潛力.

需要特別指出的是，為了更簡(jiǎn)化大鼠熒光信號(hào)的收集，他們構(gòu)建了一套專門的檢測(cè)裝置［35］（圖3）.該裝置主要包括一個(gè)激光發(fā)生器（作為激發(fā)光源）與一個(gè)感光模組（作為熒光信號(hào)收集器）.將該裝置與相應(yīng)的計(jì)算機(jī)相連即可實(shí)現(xiàn)在小型動(dòng)物中熒光信號(hào)的采集與分析.在成像過(guò)程中，將相關(guān)檢測(cè)探頭置于血管分布較為密集的大鼠耳部即可實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)非侵入性檢測(cè).這與一般的采血或采尿檢測(cè)實(shí)驗(yàn)相比在操作便捷性上具有明顯的優(yōu)勢(shì).

Fig.3 Data acquisition system designed for 2d(PP-2338)(A)and representative elimination curves of 2d measured optically in anesthetized 5/6 nephrectomized and sham rats 7 d post injury(B)[35]

與此同時(shí)，Dorshow等［36，37］對(duì)先前篩選出的候選化合物2a（MB-102）也進(jìn)行了更深入的研究.通過(guò)對(duì)MB-102在嚙齒動(dòng)物、比格犬等動(dòng)物的體內(nèi)安全性和毒性實(shí)驗(yàn)研究，證明了MB-102是一種具有高度生物安全性的GFR示蹤劑候選化合物.通過(guò)對(duì)符合生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）條件下生產(chǎn)的MB-102進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這一化合物具有高化學(xué)穩(wěn)定性，在2～8℃下可以保持3年以上不發(fā)生變化［38］.此外，研究發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典GFR示蹤劑碘海醇相比，MB-102具有更低的血漿蛋白結(jié)合率（MB-102：4.1%；碘海醇：6%），同時(shí)，MB-102固有的光物理特性為GFR的實(shí)時(shí)、定量測(cè)定提供了一種可靠的方法.

基于MB-102的首次人體臨床研究于2017年被報(bào)道［39］，研究人員搭建了一套經(jīng)皮熒光測(cè)量?jī)x，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中的MB-102熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)、非侵入性的測(cè)量.同時(shí)對(duì)測(cè)試人員身體的4個(gè)部位［前額、胸骨、內(nèi)側(cè)上部手臂和外側(cè)下胸腔（代表軀干）］進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè).觀察到MB-102進(jìn)入測(cè)量區(qū)域的平衡動(dòng)力學(xué)會(huì)因身體的測(cè)量位置不同而發(fā)生變化［圖4（A）和（B）］.此外，由于運(yùn)動(dòng)和組織光學(xué)特性的變化，研究中也會(huì)觀察到部分信號(hào)偽影.基于這些現(xiàn)象，研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)電子模型［圖4（C）］，以解釋觀察到的臨床測(cè)試結(jié)果，并完善了儀器設(shè)計(jì)［40］.總體而言，8名腎功能正常且膚色不同的測(cè)試人員的測(cè)試結(jié)果顯示，相關(guān)數(shù)據(jù)與模擬數(shù)據(jù)具有較好的一致性.

Fig.4 An example of clinical measurements of MB-102 for a single subject(A),measurements simulated by the model(B)[39]and a schematic of instrument developed to perform the transcutaneous fluorescence measurements(C)[40]

目前，MB-102已經(jīng)在20多項(xiàng)正式的毒理學(xué)、安全性和藥理學(xué)研究中［37］進(jìn)行了性能評(píng)估.并且在人體測(cè)試中顯示，靜脈注射MB-102后可以利用直接放置在皮膚上的光電探測(cè)模塊經(jīng)皮檢測(cè)MB-102的實(shí)時(shí)熒光信號(hào).這些結(jié)果均表明，MB-102有望為GFR的定量分析提供一種可靠的方法.目前，MB-102正由MediBeacon公司進(jìn)行開(kāi)發(fā)，進(jìn)行Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)研究.此化合物有望成為第一個(gè)真正在臨床應(yīng)用的實(shí)時(shí)GFR監(jiān)測(cè)示蹤劑.

3 基于大分子多聚糖的腎小球?yàn)V過(guò)率熒光示蹤劑

作為應(yīng)用于活體內(nèi)熒光實(shí)時(shí)成像的試劑，GFR示蹤劑對(duì)其激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)、熒光量子產(chǎn)率等都提出了較高的要求.然而，常用的具有較為理想光物理性質(zhì)的有機(jī)熒光染料，由于一般都具有較高的親脂性而難以有效通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò).為了能夠?qū)⑦@類高效熒光染料應(yīng)用在GFR示蹤劑中，研究人員通常采用將其與高親水性的大分子多聚糖化合物共價(jià)鍵結(jié)合的方式構(gòu)建GFR示蹤劑.由于熒光染料分子相對(duì)大分子多聚糖要小得多，因此這些染料分子的引入對(duì)多聚糖本身的腎小球?yàn)V過(guò)率影響甚微.基于這種策略構(gòu)建的示蹤劑同時(shí)具有高熒光量子產(chǎn)率和GFR示蹤劑所必須的高腎小球透過(guò)率，在近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注.應(yīng)用在這一類型GFR示蹤劑中的大分子多糖化合物主要包括菊粉、葡聚糖（Dextran）、海蔥糖（Sinistrin）以及環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）等（圖5）.這些多糖分子在GFR示蹤劑應(yīng)用研究中各有特點(diǎn)，并且其結(jié)構(gòu)也可用于其它官能團(tuán)的進(jìn)一步修飾.

Fig.5 Structures of glycan-based GFR tracer agents

3.1 基于菊粉的腎小球?yàn)V過(guò)率熒光示蹤劑

菊粉是一種分子量為3000～5000左右的惰性果糖聚合物，它可以被腎小球自由過(guò)濾，同時(shí)既不被腎小管上皮細(xì)胞分泌也不被再吸收，滿足外源性標(biāo)志物的所有標(biāo)準(zhǔn)，是一種較為理想的GFR外源性標(biāo)志物［41］.因此，菊粉清除率長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)被公認(rèn)為是GFR定量的標(biāo)準(zhǔn).菊粉的清除率被定義為每分鐘為尿液中菊粉的排出所需的血漿體積［42］.早期，菊粉單獨(dú)作為外源性標(biāo)志物被用來(lái)檢測(cè)腎功能，一般通過(guò)分光光度法和熒光法進(jìn)行定量［43］.但這一方法一般需要較高的血漿菊粉濃度，以至于最終尿液中的菊粉濃度會(huì)產(chǎn)生一定的滲透效應(yīng)，同時(shí)也進(jìn)一步加重了腎的負(fù)擔(dān).

為了便于菊粉的檢測(cè)，早在1983年，Ulfendahl等［44］即首次利用常用的熒光染料異硫氰酸熒光素（FITC）對(duì)菊粉進(jìn)行共價(jià)鍵標(biāo)記，構(gòu)建了FITC-菊粉.FITC在菊粉中的分子取代度約為0.001，即每1000個(gè)單糖中約連接1個(gè)FITC分子.在低取代度的情況下，F(xiàn)ITC的引入對(duì)菊粉本身的生物活性影響被降至最低.FITC本身具有明亮的綠色熒光，這一熒光基團(tuán)在菊粉中的引入極大地簡(jiǎn)化了在復(fù)雜環(huán)境中對(duì)菊粉的測(cè)定.利用FITC-菊粉作為標(biāo)志物，研究人員測(cè)定了腎小管液血漿濃度比（TF/P），這個(gè)比值與腎小管功能長(zhǎng)度密切相關(guān).為了研究FITC-菊粉作為衡量腎小球?yàn)V過(guò)標(biāo)志物的有效性，在研究中以51Cr-EDTA和氚代菊粉作為對(duì)照進(jìn)行了清除率和TF/P測(cè)試實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示，基于FITC-菊粉的檢測(cè)方法與這兩種方法具有良好的一致性，證明了FITC-菊粉作為GFR檢測(cè)工具的有效性.然而這種基于FITC-菊粉的方法在消耗大量樣本的同時(shí)，也同樣要求維持較高水平的血漿菊粉濃度，因此這一示蹤劑在應(yīng)用中依然受到了較大的限制.考慮到這些問(wèn)題，1999年，Lorenz等［45］利用FITC-菊粉通過(guò)微穿刺的方式研究評(píng)估單腎單元腎小球?yàn)V過(guò)率（SNGFR）和小管液再吸收情況.這種方法只需要較低水平的血漿菊粉-FITC濃度，而且分析過(guò)程中不會(huì)消耗液體樣本，因此檢測(cè)效率得到了較大的提高.

2004年，為了探尋簡(jiǎn)單、便捷的方式對(duì)清醒小鼠的腎臟功能進(jìn)行檢測(cè)，Breyer等［46］利用FITC-菊粉，分別用兩種方式對(duì)清醒小鼠體內(nèi)GFR進(jìn)行了測(cè)定.一種方法是通過(guò)血漿FITC-菊粉的清除動(dòng)力學(xué)來(lái)測(cè)量GFR，這種方式的主要優(yōu)點(diǎn)是不需要定時(shí)收集尿液或進(jìn)行手術(shù)，能夠提供高重復(fù)性結(jié)果，但是反復(fù)采血本身也會(huì)給動(dòng)物造成生存壓力.另一種是通過(guò)腹腔內(nèi)的微滲透泵持續(xù)給藥FITC-菊粉，再利用代謝籠收集尿液來(lái)測(cè)量FITC-菊粉的清除量，以此來(lái)測(cè)定其尿清除率.這種方法可避免多次血液采樣，但需要小鼠尿液的定時(shí)采集.這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但這一研究本身首次證明了利用FITC-菊粉檢測(cè)清醒小鼠GFR的可行性.

2013年，Rieg等［47］基于FITC-菊粉報(bào)道了一種高通量測(cè)試有意識(shí)小鼠GFR的方法.這種方法通過(guò)應(yīng)用雙室模型，根據(jù)特定流程，只需通過(guò)剪尾采血得到的1～2μL的稀釋血漿來(lái)測(cè)定其熒光，每天可以測(cè)量多達(dá)24只小鼠的GFR.該方法中所有的血液樣本都可以在清醒小鼠體內(nèi)采集，且只需要短暫的異氟烷麻醉.剪尾采血使得操作更方便快捷，同時(shí)，這種方式的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，它可以在長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月的時(shí)間內(nèi)持續(xù)跟蹤治療，通過(guò)飲食變化或藥物應(yīng)用進(jìn)行配對(duì)協(xié)同實(shí)驗(yàn).

然而，基于單一波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度測(cè)量容易受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響從而造成偏差，如激發(fā)光源的波動(dòng)、成像設(shè)備的不均勻性和不同成像深度的強(qiáng)度衰減等.為了克服這一問(wèn)題，Yu等［48］發(fā)展了一種比率熒光測(cè)量法，利用活體熒光顯微鏡快速評(píng)估嚙齒模型動(dòng)物的腎功能.他們將FITC-菊粉和德克薩斯紅-葡聚糖混合試劑經(jīng)皮注入血液.在這兩種試劑中，發(fā)出綠色熒光信號(hào)的FITC-菊粉由于分子量較?。?000～5000），可以自由透過(guò)腎小管，而發(fā)出紅色熒光信號(hào)的德克薩斯紅-葡聚糖由于分子量較大（500000）而不能被腎臟過(guò)濾，因此被限制在血管內(nèi).通過(guò)測(cè)量腎臟中綠色與紅色熒光強(qiáng)度比率即可實(shí)現(xiàn)對(duì)GFR效率的快速評(píng)估，在量化腎功能方面具有更高的準(zhǔn)確度.

在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)一步利用FITC-菊粉和德克薩斯紅-葡聚糖混合試劑對(duì)急性腎損傷模型大鼠進(jìn)行了研究［49］.他們將混合試劑對(duì)小鼠進(jìn)行快速輸注，并對(duì)其腎臟進(jìn)行熒光成像.從圖6（A）可以看出，毛細(xì)血管的紅色熒光通道的整體信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定，而毛細(xì)血管的綠色熒光通道的信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，表明綠色熒光標(biāo)記的菊糖從血管間隙中代謝消失.經(jīng)過(guò)研究獲得了0.17～1.12 mL·min-1·100 g-1范圍的全譜GFR值，與標(biāo)準(zhǔn)菊粉清除分析得到的GFR值有很好的相關(guān)性.該課題組［50］還通過(guò)測(cè)定45 min缺血模型后24 h內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的GFR值，首次分析了腎臟缺血對(duì)腎功能的早期影響.研究發(fā)現(xiàn)，利用這種混合示蹤劑再結(jié)合活體熒光比率雙熒光通道腎臟成像和兩室藥代動(dòng)力學(xué)模型，可以對(duì)正常和急性腎損傷模型大鼠實(shí)現(xiàn)GFR的快速量化.

為了將這一雙熒光通道技術(shù)應(yīng)用于臨床，Wang等［50］進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了能夠產(chǎn)生及傳遞兩個(gè)激發(fā)源，并對(duì)相應(yīng)的發(fā)射進(jìn)行檢測(cè)量化的比率型光纖系統(tǒng)［圖6（B）］，可分別為FITC和德克薩斯紅熒光標(biāo)記物提供激發(fā)光源.經(jīng)過(guò)特定的激發(fā)濾光片后，兩束近準(zhǔn)直的光束在反射藍(lán)色并發(fā)射琥珀色的激發(fā)二向色鏡處合并，混合熒光信號(hào)通過(guò)反射激發(fā)波長(zhǎng)的同一雙頻分束器.他們將可傳遞激發(fā)光并收集熒光發(fā)射的亞毫米光纖通過(guò)商業(yè)靜脈導(dǎo)管插入動(dòng)物模型的外周靜脈或中心靜脈通路.混合注入分子量較小的腎自由過(guò)濾分子FITC-菊粉和腎不可過(guò)濾的德克薩斯紅-葡聚糖，在被發(fā)光二極管激發(fā)后，光電倍增管檢測(cè)和量化體內(nèi)信號(hào).該比率測(cè)定技術(shù)既可以檢測(cè)血漿血管體積，又能高精度地實(shí)時(shí)測(cè)定GFR.這種獨(dú)特的定量熒光方法的原理可以擴(kuò)展應(yīng)用到其它器官或其它過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中，從而提高準(zhǔn)確性.然而，考慮到混合試劑中含有的排泄半衰期接近無(wú)窮大的分子帶來(lái)的潛在毒性，這種檢測(cè)策略在臨床應(yīng)用上受到了極大的限制.

另一種經(jīng)皮測(cè)量技術(shù)是Luyt等［51］研發(fā)的經(jīng)皮脈搏染料密度計(jì)（TPDD）.他們將開(kāi)發(fā)的一種近紅外染料（Cy7.5）標(biāo)記的菊粉作為光學(xué)探針，在血氧儀中實(shí)時(shí)計(jì)算染料在動(dòng)脈中的濃度，以非侵入性的方式測(cè)量活體的GFR.近紅外熒光染料的應(yīng)用有助于提升熒光穿透率，更利于檢測(cè)深層組織的熒光信號(hào).利用這一方法，目前已成功實(shí)現(xiàn)模型豬的無(wú)創(chuàng)GFR測(cè)量.

目前，在外源性標(biāo)志物中，菊粉本身既不被腎小管重吸收也不分泌的特點(diǎn)使其依舊作為金標(biāo)準(zhǔn)而被廣泛認(rèn)可.而FITC-菊粉作為GFR熒光示蹤劑在研究中也取得了一定的進(jìn)展.然而，F(xiàn)ITC-菊粉的一些不利因素長(zhǎng)久以來(lái)一直困擾著研究人員.如其水溶性較差，使用前通常需要高溫加熱促進(jìn)其溶解，并且其熒光染料FITC發(fā)射波長(zhǎng)較短，穿透性有限，在部分活體成像中依然需要使用侵入性的方式進(jìn)行.基于這些原因，目前各種替代策略也在開(kāi)發(fā)研究之中.

Fig.6 Two-photon images from a living rat infused a mixture of Texas red-dextran(red)and FITC-inulin(green)(A)[49]and design of the ratiometric optical fiber system(B)

3.2 基于海蔥糖的腎小球?yàn)V過(guò)率熒光示蹤劑

海蔥糖（Sinistrin）是一種由果糖單位（97%）和葡萄糖單位（約3%）組成的支鏈多聚果糖，分子量范圍在2000～6000之間，平均分子量為3500.由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在側(cè)鏈而增加了水溶性，使其在應(yīng)用中更容易處理，并且海蔥糖的聚合度、相對(duì)分子質(zhì)量和流體動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，其通過(guò)腎小球基底膜的滲透性比較好.因此，作為一種極具潛力的菊粉替代品，海蔥糖在1963年首次被引入作為腎臟標(biāo)志物［52］.

2005年，為了克服FITC-菊粉水溶性較差、使用前需提前加熱促溶解的問(wèn)題，Pill等［53］首次將FITC與海蔥糖共價(jià)鍵連接合成得到了FITC-海蔥糖，其分子取代度約為0.08，即每100個(gè)單糖中約連接8個(gè)FITC分子.初步研究發(fā)現(xiàn)，利用FITC-海蔥糖可使用常規(guī)熒光計(jì)檢測(cè)其隨時(shí)間變化的血漿清除率，并且基于這一試劑測(cè)定GFR的方法耐受性好、準(zhǔn)確度高及相對(duì)易于操作，這些特點(diǎn)使得FITC-海蔥糖成為一種極具潛力的GFR示蹤劑.

為了簡(jiǎn)化活體中GFR的測(cè)定，Schock-Kusch等［26］注意到了利用GFR熒光示蹤劑通過(guò)透皮實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)量GFR的潛力.為此，他們首次利用FITC-海蔥糖作為熒光示蹤劑，結(jié)合小型活體動(dòng)物成像儀通過(guò)測(cè)量大鼠耳上的熒光信號(hào)開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)評(píng)估GFR的方法［圖7（A）］.由于活體成像儀的應(yīng)用極大地簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)的收集，從而可以大大增加消除曲線上的測(cè)量點(diǎn)數(shù)量，有效提高了GFR的檢測(cè)精度.他們通過(guò)與常用的酶法和熒光法同時(shí)測(cè)定的血漿清除率比較，證明了利用FITC-海蔥糖經(jīng)皮測(cè)量熒光強(qiáng)度得到的GFR結(jié)果的有效性.但這一方法與傳統(tǒng)方法相比，避免了血液或尿液采樣以及耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)室工作，極大地簡(jiǎn)化并加快了小型實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的GFR測(cè)定.然而，此研究中所選用的單室模型沒(méi)有考慮到藥物血漿濃度最初的快速下降，也存在一定的問(wèn)題.對(duì)此可以通過(guò)獲得大量的經(jīng)皮測(cè)量數(shù)據(jù)，分析復(fù)雜的運(yùn)動(dòng)特征，根據(jù)獲得的結(jié)果數(shù)據(jù)來(lái)建模，從而更精確地估計(jì)GFR.

Fig.7 Fluorescence images of a depilated rat ear taken before and after injection of FITC-sinistrin using a CRI Maestro small animal imager(A)[26],a schematic drawing of a transcutaneous device and optical part of the device(RFID:radio-frequency identification)(B)and a schematic drawing of a modified miniaturized device(C)

一般小型活體動(dòng)物成像儀對(duì)小型動(dòng)物GFR的檢測(cè)過(guò)程中通常需要提前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉處理，而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉本身也有很大可能對(duì)其GFR測(cè)定造成影響，從而降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性.為了實(shí)現(xiàn)對(duì)非麻醉狀態(tài)下的小型動(dòng)物GFR的測(cè)量，Schock-Kusch等［54］設(shè)計(jì)、發(fā)展了一種小型便攜熒光監(jiān)測(cè)裝置［圖7（B）］，該裝置主要包括用于激發(fā)熒光標(biāo)記物的發(fā)光二極管和用于檢測(cè)所發(fā)射的熒光的光電二極管.將該裝置固定在大鼠的皮膚上后，通過(guò)在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)閃爍反復(fù)激發(fā)血管間隙內(nèi)的熒光標(biāo)志物，其發(fā)出的熒光信號(hào)被檢測(cè)并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，存儲(chǔ)在內(nèi)部存儲(chǔ)器中.利用這個(gè)監(jiān)測(cè)裝置，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)非麻醉狀態(tài)下的小型動(dòng)物進(jìn)行熒光成像.這種用于測(cè)量非麻醉動(dòng)物腎功能的非侵入性方法不會(huì)對(duì)動(dòng)脈壓、心率或運(yùn)動(dòng)活動(dòng)產(chǎn)生不良影響［54］.因此，可以避免麻醉本身導(dǎo)致的GFR變化，有利于獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果.

2012年，該課題組［55］對(duì)先前報(bào)道的可用于大鼠的小型便攜性監(jiān)測(cè)裝置進(jìn)行進(jìn)了優(yōu)化，通過(guò)進(jìn)一步縮減監(jiān)測(cè)裝置的尺寸，并配備內(nèi)部存儲(chǔ)器，使其可適用于體型更小的小鼠.基于這一裝置，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)自由活動(dòng)的清醒小鼠GFR的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)［圖7（C）］.使用這一小型化成像設(shè)備，結(jié)合已建立的二室模型，經(jīng)皮測(cè)量熒光腎標(biāo)記物FITC-海蔥糖的消除動(dòng)力學(xué)，并且在單側(cè)腎切除小鼠和腎結(jié)核模型小鼠中證明了透皮檢測(cè)法與傳統(tǒng)血漿清除率法的結(jié)果具有良好的一致性.

在此基礎(chǔ)上，該課題組［56］基于FITC-海蔥糖透皮檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步建立了一種實(shí)時(shí)反饋調(diào)節(jié)的恒定輸液清除方法.恒定輸液清除（CIC）技術(shù)一直以來(lái)被認(rèn)為是GFR評(píng)估方法的金標(biāo)準(zhǔn).該系統(tǒng)主要由透皮監(jiān)測(cè)裝置和主機(jī)上用于調(diào)節(jié)輸液泵的控制器組成.熒光檢測(cè)器將測(cè)量的數(shù)據(jù)發(fā)送到主機(jī)，主機(jī)能夠控制一個(gè)裝有FITC-海蔥糖的注射器泵，將藥物注射進(jìn)動(dòng)物的股靜脈.設(shè)置參考劑量后，閉環(huán)調(diào)節(jié)能夠自動(dòng)確定最佳的維持注射劑量，從而做到對(duì)每一實(shí)驗(yàn)對(duì)象的平衡時(shí)間單獨(dú)優(yōu)化.這種方法可以精確地確定穩(wěn)態(tài)標(biāo)記濃度的起始點(diǎn)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)標(biāo)記物濃度的相對(duì)變化，從而實(shí)現(xiàn)獨(dú)立于GFR水平的維持劑量的單獨(dú)優(yōu)化調(diào)節(jié).此外，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后可以連續(xù)監(jiān)測(cè)數(shù)小時(shí)，且可以只使用單一血液樣本確定GFR.他們還對(duì)不同品系小鼠（Balb/c，SV129，NMRI和C57BL/6）進(jìn)行兩次經(jīng)皮GFR測(cè)定，評(píng)估了GFR的日?？芍貜?fù)性、品系內(nèi)和品系間變異性以及年齡等參數(shù)對(duì)研究的影響［57］.這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，同一動(dòng)物在3 d內(nèi)記錄的GFR測(cè)量數(shù)據(jù)可靠性強(qiáng)，根據(jù)小鼠品系的不同，變異系數(shù)穩(wěn)定在3.0%～6.2%之間.

目前，這種非侵入性腎臟清除檢測(cè)裝置（NIC）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化制造，并在多種動(dòng)物模型中驗(yàn)證了其可行性.如，Cowley等［58］應(yīng)用該裝置，通過(guò)注射FITC-海蔥糖連續(xù)測(cè)定有意識(shí)且行動(dòng)自由的達(dá)爾鹽敏感性（SS）大鼠中隨著高血壓發(fā)展的前21 d GFR的變化.研究結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的基于肌酐清除的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法相比，檢測(cè)靈敏度更高，且更為簡(jiǎn)便省時(shí).并且，實(shí)驗(yàn)顯示SS大鼠的腎小球?yàn)V過(guò)率下降出現(xiàn)于高血壓發(fā)生的約14 d后，因此推斷腎小球?yàn)V過(guò)率的降低是高血壓所導(dǎo)致的結(jié)果而并非其原因.此外，該裝置還被用于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因敲除小鼠中，證明了腎臟ACE對(duì)于一氧化氮合成誘發(fā)的高血壓抑制起著非常重要的作用［59］.

利用FITC-海蔥糖和非侵入性腎臟清除檢測(cè)裝置，Street等［60］測(cè)定了野生型和A1aR基因敲除小鼠盲腸結(jié)扎和穿刺性膿毒癥早期的GFR和系統(tǒng)血流動(dòng)力學(xué)，為已知的膿毒性急性腎損傷中GFR降低建立早期時(shí)間表.研究表明，透皮熒光檢測(cè)可以準(zhǔn)確快速監(jiān)測(cè)GFR在膿毒癥期間的變化，而傳統(tǒng)的GFR生物標(biāo)志物檢測(cè)方式無(wú)法檢測(cè)到如此快速的變化.此外，Scarfe等［61］利用類似的技術(shù)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎病模型小鼠的GFR進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)海蔥糖清除率與患有阿霉素誘導(dǎo)腎病的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中受損腎小球的比例顯著相關(guān).這項(xiàng)技術(shù)允許對(duì)個(gè)體動(dòng)物進(jìn)行反復(fù)測(cè)試，最大限度地利用腎病和/或再生效應(yīng)的進(jìn)展獲得信息，可以顯著減少臨床前腎病模型中的動(dòng)物數(shù)量.

Mullins等［62］基于FITC-海蔥糖對(duì)瘦和肥胖C57BL/6J雄性小鼠進(jìn)行了經(jīng)皮GFR測(cè)試研究.研究發(fā)現(xiàn)，這種非侵入性技術(shù)可以實(shí)時(shí)連續(xù)測(cè)量清醒瘦小鼠的GFR，而無(wú)需收集血液和尿液或進(jìn)行化驗(yàn).但是在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、高血糖和近端腎小管病變的小鼠中，基于經(jīng)皮熒光測(cè)試得到的GFR與公認(rèn)的血漿清除方法得到的結(jié)果差異性較大.他們推測(cè)，GFR經(jīng)皮熒光和/或血漿檢測(cè)可能受到循環(huán)脂類與FITC-海蔥糖之間相互作用的影響.此外，Chang等［63］首次將透皮監(jiān)測(cè)裝置和FITC-海蔥糖用于實(shí)時(shí)測(cè)量模型大鼠GFR和腎損傷生物標(biāo)志物的研究中.

由于活體動(dòng)物背景熒光信號(hào)干擾、熒光信號(hào)透過(guò)率低等原因，用于監(jiān)測(cè)GFR的熒光示蹤劑通常需要使用較高的濃度.但是，熒光示蹤劑的血漿和/或尿液濃度過(guò)高可能會(huì)干擾常規(guī)的血液或尿液檢測(cè).因此，在應(yīng)用于人體之前，應(yīng)最大限度地減少熒光標(biāo)記物使用的濃度，以此減少其潛在副作用.為此，Shmarlouski等［64］提出了基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）的一種新的GFR透皮測(cè)量方法，稱為熒光壽命分解測(cè)量（LTDM），即將時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)采集與新的分解方法相結(jié)合［圖8（A）］.該硬件的光路由發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm的新型緊湊型皮秒脈沖二極管激光器、柔性光纖束和可安裝于清醒大鼠背上的測(cè)量頭，以及以單光子計(jì)數(shù)模式工作的光電倍增管和經(jīng)優(yōu)化的時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)單元組成.這種方法可以將FITC熒光信號(hào)與背景熒光信號(hào)分離，有效排除體內(nèi)自發(fā)熒光，從而提高檢測(cè)靈敏度.與NIC透皮檢測(cè)裝置相比，在保留相同檢測(cè)精度的情況下，該系統(tǒng)在清醒大鼠體內(nèi)的所需FITC-海蔥糖檢測(cè)劑量減少了200倍.但是，LTDM依賴于光導(dǎo)，因此必須使用Raturn微透析籠來(lái)防止測(cè)量頭因強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)而分離，因此檢測(cè)成本較高.研究指出，LTDM設(shè)備的高昂成本與Raturn籠的應(yīng)用缺陷能夠被節(jié)省GFR熒光示蹤劑的優(yōu)勢(shì)所彌補(bǔ).當(dāng)監(jiān)測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)或者在需要更大劑量熒光示蹤劑的狗或豬等高等動(dòng)物中進(jìn)行臨床前研究時(shí)，這一優(yōu)勢(shì)更為明顯.

Fig.8 Components of optical measurement systems for lifetime-decomposition measurement(LTDM)(A)and MR-compatible optical sensor devices for FITC-sinistrin clearance measurement(B)[67]

同樣，為了解決透皮檢測(cè)GFR過(guò)程中皮膚漂白、自發(fā)熒光以及由皮膚灌流變化的影響，F(xiàn)riedemann等［65］通過(guò)測(cè)得的經(jīng)皮熒光數(shù)據(jù)，推導(dǎo)并驗(yàn)證了一個(gè)新的區(qū)別于標(biāo)準(zhǔn)1～3室模型的FITC-海蔥糖分布和排泄動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)算法.結(jié)果表明，記錄從注射示蹤劑開(kāi)始的完整動(dòng)力學(xué)過(guò)程，結(jié)合基線信號(hào)偏移的自動(dòng)校正，基于透皮熒光測(cè)定得到的GFR可以達(dá)到與金標(biāo)準(zhǔn)恒定輸液清除率近乎相當(dāng)?shù)木?

除了熒光示蹤劑透皮檢測(cè)外，動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像（DCE-MRI）也是一種非侵入性的GFR檢測(cè)方法.動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像還支持單腎GFR，甚至可以通過(guò)計(jì)算參數(shù)圖對(duì)GFR進(jìn)行空間分辨分析.但是，基于這一方法在人體研究和動(dòng)物研究中的結(jié)果表明，其與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法結(jié)果偏差較大［66］.Z?llner等［67］在Schreiber等［55］設(shè)計(jì)的透皮裝置的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，首次報(bào)道了一種可以同時(shí)進(jìn)行磁共振成像（MRI）和熒光成像的小型傳感器［圖8（B）］.這種傳感器包括用于信號(hào)激發(fā)和接收的LED及光電二極管的原始設(shè)備和電子器件，采用銅箔屏蔽，僅保留LED、光電二極管和電池插頭.該裝置允許通過(guò)兩種非侵入性技術(shù)（動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像和經(jīng)皮熒光檢測(cè)）同時(shí)測(cè)量GFR，免除了血液/尿液采樣或?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)的繁瑣程序，具有高時(shí)空的三維（3D）分辨成像.通過(guò)透皮熒光檢測(cè)所獲得的平均GFR值大約是DCE-MRI值的兩倍.與之前的報(bào)道相比，這種差異的縮減改善了大鼠GFR的測(cè)量結(jié)果.研究認(rèn)為，GFR測(cè)量差異可能是由于未能找到最佳的動(dòng)脈輸入函數(shù)以及未能考慮到信號(hào)強(qiáng)度與濃度曲線轉(zhuǎn)化中的偏差.

此外，Ahmad等［68］于2021年首次報(bào)道了X射線計(jì)算機(jī)斷層成像（CT）和FITC-海蔥糖透皮熒光檢測(cè)在放射性腎臟疾病成像中的聯(lián)合應(yīng)用，利用FITC-海蔥糖熒光成像彌補(bǔ)了X射線成像不利于在7 d內(nèi)多次評(píng)估的問(wèn)題.該課題組評(píng)估了C57BL/6小鼠接受雙側(cè)局灶X射線照射治療后的腎損傷，結(jié)合FITC-海蔥糖腎排泄的透皮測(cè)量以及使用造影劑（ISOVUE-300 Iopamidol）的動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)CT成像來(lái)檢測(cè)GFR.基于FITC-海蔥糖的技術(shù)允許在有意識(shí)、自由移動(dòng)的小鼠中重復(fù)測(cè)量GFR，而使用非離子造影劑的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)CT成像可以提供腎臟的功能信息和形態(tài)特征，兩種方法具有較好的互補(bǔ)性.

FITC-海蔥糖的優(yōu)異表現(xiàn)使研究人員在腎病模型的研究和臨床應(yīng)用中對(duì)海蔥糖尤為關(guān)注.然而這種示蹤劑具有一定的局限性，如海蔥糖成本相對(duì)較高、提取和純化過(guò)程復(fù)雜.此外，大部分多糖都是多分散的聚合物，結(jié)構(gòu)的確定性相對(duì)較低.這些物質(zhì)是否均勻可靠也是它們能否用作GFR標(biāo)志物的一個(gè)重要限制因素.

3.3 基于環(huán)糊精衍生物的腎小球?yàn)V過(guò)率熒光示蹤劑

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）是一類環(huán)狀低聚糖，一般含有6～12個(gè)D-吡喃葡萄糖單元.這些環(huán)狀寡糖具有高水溶性，在動(dòng)物和人體內(nèi)毒性都非常低，生物相容性良好，并且不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，因此在制藥與相關(guān)工業(yè)中具有非常廣泛的應(yīng)用［69］.2-羥丙基環(huán)糊精（HPCD）由于破壞了次級(jí)羥基之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，具有比一般天然環(huán)糊精更好的水溶性［70］，如，2-羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD）水溶性可以達(dá)到60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），甚至更高.并且，這一類化合物對(duì)豬源或人源的α-淀粉酶的水解性也更穩(wěn)定.此外，它們的分子量相對(duì)海蔥糖分布更窄，獲取成本更低.HPCD經(jīng)靜脈給藥后體內(nèi)吸收非常低，主要經(jīng)由腎臟排泄.HPCD已被證明在人體內(nèi)短期和長(zhǎng)期研究中耐受性良好，靜脈給藥對(duì)腎臟或其它器官基本沒(méi)有不良影響［71］.諸多優(yōu)良性能使它們成為GFR熒光試劑的理想骨架［72，73］.

2016年，Gretz課題組［74］首次基于2-羥丙基環(huán)糊精發(fā)展了一系列GFR熒光示蹤劑，其中，基于2-羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD）構(gòu)造的化合物FITC-HPβCD是最具潛力的GFR檢測(cè)試劑（圖5）.這一熒光示蹤劑可以經(jīng)由2-羥丙基β環(huán)糊精與熒光染料FITC共價(jià)鍵標(biāo)記快速合成得到，并且化合物具有良好的熒光特性.研究表明，F(xiàn)ITC-HPβCD具有低血漿蛋白結(jié)合力，高血漿與酯酶穩(wěn)定性，并且沒(méi)有展現(xiàn)出任何可檢測(cè)到的細(xì)胞毒性.在模型大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC-HPβCD在體內(nèi)基本不被代謝，具有非常高的尿液回收率.他們進(jìn)一步通過(guò)一個(gè)微型經(jīng)皮熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)裝置對(duì)注射FITC-HPβCD的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行了非侵入性實(shí)時(shí)熒光信號(hào)分析［圖9（A）］，結(jié)果顯示，在有與沒(méi)有丙磺舒處理的情況下，F(xiàn)ITC-HPβCD的清除沒(méi)有顯著差異［圖9（C）和（D）］，證明腎臟近端小管對(duì)這一示蹤劑既沒(méi)有重吸收也沒(méi)有分泌，即FITC-HPβCD僅被腎小球?yàn)V過(guò).這些結(jié)果為基于2-羥丙基環(huán)糊精發(fā)展GFR示蹤劑奠定了重要基礎(chǔ).此外，相關(guān)檢測(cè)設(shè)備體積小，可以直接穿戴在清醒大鼠身上［圖9（B）］，通過(guò)對(duì)其熒光信號(hào)強(qiáng)度變化的測(cè)量，實(shí)現(xiàn)了以非侵入性的方式對(duì)未麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物GFR的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè).

基于熒光探針?lè)肿拥某上窦夹g(shù)在活體動(dòng)物成像中易于受到光穿透率、光散射和自發(fā)熒光信號(hào)的干擾.如，血液中的血紅蛋白對(duì)可見(jiàn)光具有較強(qiáng)的吸收作用，極大地限制了短波長(zhǎng)熒光信號(hào)的穿透，而源自彈性蛋白、膠原蛋白以及其它一些生物熒光團(tuán)的自發(fā)熒光也會(huì)對(duì)活體熒光信號(hào)的檢測(cè)造成較大的干擾［75，76］.由于GFR熒光示蹤劑發(fā)射波長(zhǎng)大部分都在波長(zhǎng)較短的藍(lán)、綠光范圍，在進(jìn)行體內(nèi)無(wú)創(chuàng)透皮腎功能評(píng)估時(shí)，不可避免地受到信號(hào)穿透性差和組織的自發(fā)熒光信號(hào)背景的干擾，限制了其應(yīng)用.而在700～1700 nm近紅外區(qū)域，包括近紅外第一窗口（NIR-I，波長(zhǎng)：700～900 nm）和近紅外第二窗口（NIR-II，波長(zhǎng)：1000～1700 nm），由于其組織穿透深、自發(fā)熒光干擾少及成像速度快等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)引起了極大關(guān)注［77］.但是，有機(jī)近紅外熒光染料大多具有強(qiáng)疏水性的大π-共軛體系，這通常會(huì)導(dǎo)致染料與血清中的蛋白質(zhì)之間有很強(qiáng)的結(jié)合，會(huì)影響由此產(chǎn)生的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和體內(nèi)的生物分布［78］.

Gretz課題組［79］將近紅外熒光染料七甲川菁與2-羥丙基β環(huán)糊精共價(jià)鍵連接，首次發(fā)展了發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外區(qū)域的GFR熒光示蹤劑ABZWCY-HPβCD與AAZWCY-HPβCD（圖5）.同時(shí)，為了降低親脂性的熒光染料與蛋白的非特異性結(jié)合，他們?cè)谌玖现幸牖撬峄庪x子和季銨鹽陽(yáng)離子，使其具有兩性離子.研究結(jié)果表明，這些近紅外熒光示蹤劑具有非常強(qiáng)的親水性、極低的血漿蛋白結(jié)合與生物毒性以及更深的熒光信號(hào)穿透性.同時(shí)，與多數(shù)GFR熒光示蹤劑一樣，可以有效透過(guò)腎小管而不被腎小管重新吸收與分泌.他們進(jìn)一步將這些近紅外熒光示蹤劑分別注射到健康大鼠與過(guò)表達(dá)人Ang II 1型受體（hAT1R）的腎功能障礙大鼠中.同時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)清醒大鼠的熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)，他們也開(kāi)發(fā)出一個(gè)穿戴式的小型熒光監(jiān)測(cè)裝置.該裝置由兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)為700 nm的發(fā)光二極管和一個(gè)用于檢測(cè)790 nm發(fā)射波長(zhǎng)的光電二極管組成.通過(guò)無(wú)創(chuàng)透皮實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腎功能障礙大鼠的血漿半清除時(shí)長(zhǎng)比腎功能正常大鼠顯著增加［圖9（E）和（F）］，從均值32.98 min增加到了42.88 min，表明基于這些近紅外的熒光示蹤劑來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腎臟的功能具有較高的可行性.

Fig.9 Miniaturized transcutaneous devices and a battery for transcutaneous measurement(A),a conscious Sprague-Dawley(SD)rat under transcutaneous measurement with an attached device(B),elimination curves of FITC-HPβCD by transcutaneous measurements in SD rats in the absence(C)and presence(D)of probenecid treatment[74],elimination curves of ABZWCY-HPβCD by transcutaneous measurements in wild-type rats(E)and AT1R transgenic rats(F)[79]

綜上，腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）熒光示蹤劑在過(guò)去的20多年間取得了長(zhǎng)足的發(fā)展（表1），一系列新穎的熒光示蹤劑被陸續(xù)發(fā)展出來(lái)，同時(shí)，與之相匹配的系列檢測(cè)裝置也被開(kāi)發(fā)出來(lái).這些示蹤劑與新型成像裝置的結(jié)合，已在模型動(dòng)物的GFR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中展示出極大的應(yīng)用潛力.特別是通過(guò)小型穿戴式熒光成像裝置，更可實(shí)現(xiàn)對(duì)清醒無(wú)麻醉狀態(tài)下模型動(dòng)物的透皮非侵入性熒光檢測(cè)，實(shí)時(shí)了解其腎臟功能.

Table 1 Summary of GFR fluorescent tracers and their key parameters

4 總結(jié)與展望

基于熒光示蹤劑的分子結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)策略，對(duì)近20年來(lái)發(fā)展的GFR熒光示蹤劑進(jìn)行了歸納與總結(jié)，同時(shí)對(duì)相關(guān)的檢測(cè)儀器或裝置也進(jìn)行了介紹.在這些探針?lè)肿又?，基于吡嗪的熒光示蹤劑MB-102目前由MediBeacon公司進(jìn)行開(kāi)發(fā)，正在進(jìn)行臨床Ⅲ期研究當(dāng)中.同時(shí)，基于大分子多糖化合物與常用熒光染料共價(jià)鍵連接構(gòu)建的GFR熒光示蹤劑，由于其具有的熒光量子產(chǎn)率高、結(jié)構(gòu)可調(diào)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，受到了越來(lái)越多的關(guān)注，相關(guān)的臨床研究也在穩(wěn)步推進(jìn)中.這些GFR熒光示蹤劑的成功開(kāi)發(fā)，再結(jié)合可穿戴式的小型化檢測(cè)儀器，一方面將極大地簡(jiǎn)化腎臟功能相關(guān)模型動(dòng)物的研究，實(shí)現(xiàn)對(duì)各種類型動(dòng)物在清醒非麻醉狀態(tài)下的實(shí)時(shí)腎功能監(jiān)測(cè).更為重要的是，在另一方面將為潛在腎功能障礙病人，特別是處于重癥監(jiān)護(hù)室中的急性腎損傷高危人群提供一個(gè)無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)與診斷工具，使醫(yī)護(hù)人員能夠早了解、早干預(yù)、早治療，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值.

盡管當(dāng)前GFR熒光示蹤劑已經(jīng)取得了令人矚目的進(jìn)展，但是這些試劑的進(jìn)一步應(yīng)用，尤其在臨床應(yīng)用中仍然面臨著一些問(wèn)題.首先，活體組織固有的背景熒光信號(hào)以及熒光在活體組織中的低穿透率依然是目前GFR熒光示蹤劑需要克服的一個(gè)挑戰(zhàn)，這直接影響到了相關(guān)示蹤劑的檢測(cè)靈敏度.盡管目前通過(guò)增加示蹤劑的用量一定程度上能夠提高檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，但與此同時(shí)也增加了腎的負(fù)擔(dān)，一定程度上帶來(lái)了試劑安全性方面的問(wèn)題.此外，目前近紅外熒光染料的應(yīng)用也有助于解決熒光信號(hào)穿透率低和背景信號(hào)干擾等問(wèn)題，但依然存在較大的提升空間.可以預(yù)期，進(jìn)一步應(yīng)用具有更長(zhǎng)激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)、更高量子熒光產(chǎn)率的熒光染料，特別是處于近紅外二區(qū)（1000～1700 nm）激發(fā)/發(fā)射的熒光染料將有助于提升信號(hào)穿透率和降低背景熒光信號(hào)干擾，提升檢測(cè)靈敏度，從而進(jìn)一步降低熒光示蹤劑的用量.同時(shí)，能夠有效去除背景熒光信號(hào)與具有更高檢測(cè)靈敏度的新型儀器的開(kāi)發(fā)也將有效地降低熒光示蹤劑的實(shí)驗(yàn)量.其次，目前GFR熒光示蹤劑主要是依賴于單一熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化來(lái)評(píng)估個(gè)體GFR.這種方法盡管在應(yīng)用上相對(duì)簡(jiǎn)單，但是易于受到成像光源、信號(hào)接收裝置、檢測(cè)位點(diǎn)變化，甚至個(gè)體差異性等各個(gè)方面的影響，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性產(chǎn)生影響.為了解決這個(gè)問(wèn)題，基于混合示蹤劑的比例性熒光檢測(cè)方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，但是這種混合試劑中基本不排泄示蹤劑的應(yīng)用極大地限制了其臨床應(yīng)用的可能性.此外，基于腎小管濾過(guò)率來(lái)對(duì)腎臟功能進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和評(píng)估的方法也難以反映出腎臟本身更為早期的病理變化，從而失去對(duì)病人更早干預(yù)治療的寶貴機(jī)會(huì).近年來(lái)，一系列基于環(huán)糊精的激活型分子熒光探針被報(bào)道出來(lái)，通過(guò)體內(nèi)注射探針結(jié)合尿液分析的方式對(duì)腎臟早期病變生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)急性腎損傷更早期的診斷［80～82］.但是，這種依賴于尿液分析的方法對(duì)應(yīng)用于處于重癥監(jiān)護(hù)期的急性腎損傷易發(fā)病人群存在一定的困難.在未來(lái)的研究中，如果能夠?qū)⑦@種類型的熒光探針?lè)肿优cGFR熒光示蹤劑有機(jī)結(jié)合，構(gòu)造出具有檢測(cè)靶標(biāo)成像功能的GFR熒光示蹤劑，通過(guò)體表無(wú)創(chuàng)的方式實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)包括腎小管濾過(guò)率和前期的急性病變信號(hào)在內(nèi)的腎臟功能的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，將更有助于這一檢測(cè)策略在重癥監(jiān)護(hù)狀態(tài)下急性腎損傷易發(fā)人群中的應(yīng)用.