整合熒光成像和化療的有機(jī)小分子診療探針的研究進(jìn)展

常通航，程 震

（1.中國科學(xué)院上海藥物研究所分子影像中心,新藥研究國家重點實驗室,上海 201203；2.中科環(huán)渤海(煙臺)藥物高等研究院,煙臺新藥創(chuàng)制山東省實驗室,煙臺 264117；3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049）

當(dāng)今，癌癥仍然是一種嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)病率和高致死率的惡性疾病.根據(jù)GLOBOCAN 2020年的報告，預(yù)測2040年全球癌癥的患者數(shù)量將達(dá)到2840萬例，相比于2020年將會增長47%.同時，在全球112個國家中，癌癥是這些國家70歲以下人口死亡的第一或第二主要原因［1］.對于早期實體瘤，手術(shù)切除是治療癌癥的首選措施，但是手術(shù)切除受限于癌癥的種類、位置、分期以及其它潛在的疾病.如，在西方國家95%的肝癌患者通常合并潛在的肝硬化，手術(shù)切除后往往存在肝功能衰竭的風(fēng)險［2］.化療是治療癌癥的另外一種主要方式，尤其對于晚期癌癥患者.傳統(tǒng)的化療藥物包括具有細(xì)胞毒性的抗生素（如阿霉素和絲裂霉素）、烷化試劑（氮芥類、順鉑和環(huán)磷酰胺）、抗代謝類（氟尿嘧啶、吉西他濱和甲氨蝶呤）、微管蛋白抑制劑（長春新堿和紫杉醇）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑（喜樹堿和伊立替康）等.然而傳統(tǒng)化療通常需要多次劑量才能有效，導(dǎo)致治療過程中日益嚴(yán)重的全身毒性和耐藥性，同時很多腫瘤化療的療效也受到藥物在腫瘤中積累能力的限制［3］.為了解決這些問題，大量的研究集中在開發(fā)更有效且更有選擇性的抗癌藥物上，同時也積極研究新的治療策略.

疾病的診斷作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不可或缺的一部分，在幫助醫(yī)生快速對疾病做出治療決策方面發(fā)揮著重要作用.早期診斷且發(fā)現(xiàn)癌癥將有利于延長5年生存期，甚至完全治愈癌癥［4］.如何在癌癥早期精準(zhǔn)診斷并發(fā)現(xiàn)腫瘤微病灶成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)發(fā)展極為迫切的需求點［5］.診療一體化是指將診斷與治療功能結(jié)合為一體，是當(dāng)前應(yīng)對癌癥的一種新興的策略［6］.當(dāng)前常見的診斷方式包括計算機(jī)斷層掃描（Computed tomography，CT）、核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射斷層掃描（Positron emission tomography，PET）與單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描（Single photon emission computed tomography，SPECT）、超聲成像（Ultrasound，US）以及光學(xué)成像（Optical imaging，OI）.

光學(xué)活體成像利用波長位于400～1700 nm波段的光實現(xiàn)了對多種疾病的體內(nèi)生物成像.近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)波長比可見光更長的近紅外光（NIR，700～1700 nm）在生物組織上可以實現(xiàn)更高分辨率、更大穿透深度的成像.近紅外成像又分為近紅外一區(qū)（NIR-Ⅰ，700～900 nm）和近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000～1700 nm）成像.與傳統(tǒng)的近紅外一區(qū)相比，近紅外二區(qū)成像質(zhì)量更好，能提供更高的信噪比和更深的穿透深度［7～10］.光學(xué)成像，尤其是NIR-Ⅱ成像技術(shù)避免了CT，PET及SPECT存在電磁輻射的問題，同時具有微米級別的分辨率，展現(xiàn)出良好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景.同時，化學(xué)、材料科學(xué)和納米技術(shù)的快速發(fā)展也幫助科學(xué)家開發(fā)出不同種類的近紅外探針，包括量子點、稀土摻雜納米粒子、碳納米管、有機(jī)小分子以及有機(jī)共軛聚合物類［11～17］.其中，稀土摻雜納米材料相比于有機(jī)探針光穩(wěn)定性更好，不過其長期滯留體內(nèi)帶來的潛在毒性阻礙了進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用；同時，單壁碳納米管的熒光量子產(chǎn)率較低，不能很好地從體內(nèi)代謝；而通過調(diào)節(jié)量子點的粒徑大小和形狀可以調(diào)控其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和組織分布，因此研發(fā)超小量子點納米晶體使其低于腎臟代謝閾值（≈40000）具有重要意義，然而減小納米尺寸又會降低量子產(chǎn)率，如何平衡好各方面是一個具有挑戰(zhàn)性的難題［18，19］.鑒于以上問題，有機(jī)熒光探針具有分子量小、可快速代謝、可修飾性高、生物相容性高和明確的分子骨架等優(yōu)點而成為生物成像領(lǐng)域的研究重點.相比上述無機(jī)納米材料的種種缺點，有機(jī)熒光分子更有希望被推向臨床應(yīng)用.

目前，常見的診療探針大體分為兩類：第一類通過一個納米平臺將目前常用的抗腫瘤藥物及具有診斷作用的探針整合或包載在一起.常見的藥物包括喜樹堿、阿霉素和紫杉醇等，常見的診斷試劑包括熒光分子試劑、核磁造影劑及放射性核素成像試劑等.通過在納米表面修飾靶向配體可獲得主動靶向腫瘤的能力，或者通過調(diào)節(jié)納米顆粒的尺寸依賴增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（Enhanced permeability retention effect）被動靶向.但是納米顆粒質(zhì)控艱難、制備復(fù)雜且生物相容性差，在藥代動力學(xué)體內(nèi)行為及納米顆粒釋放藥物的實時監(jiān)測方面仍存在很多亟待解決的問題，向臨床轉(zhuǎn)化的難度相比有機(jī)小分子更高.第二類屬于有機(jī)小分子偶聯(lián)診療探針.通過共價鍵如二硫鍵、酯鍵等將藥物分子與診斷試劑偶聯(lián)，這些診療探針到達(dá)病灶部位后在刺激響應(yīng)下，藥物與熒光試劑之間連接的共價鍵斷開，分別實現(xiàn)治療和成像的功能.本文將對近年來報道的一些有代表性的基于熒光成像整合化療的有機(jī)小分子診療探針的研發(fā)和應(yīng)用進(jìn)行綜合評述（Scheme 1），并根據(jù)熒光成像發(fā)射波長的范圍，分別對可見光、近紅外一區(qū)和近紅外二區(qū)有機(jī)小分子偶聯(lián)診療探針進(jìn)行了敘述和探討.

Scheme 1 Illustration of organic theranostic probes

Fig.1 Structures of Doxo-S-S-Fol and Doxo-C-C-Fol(A)and fluorescence microscopy images of A549 cells stained by Doxo-S-S-Fol at different intervals(B)[20]

1 有機(jī)小分子診療探針

1.1 可見光有機(jī)小分子診療探針

2011年，Perez等［20］開發(fā)了一類可見光有機(jī)單分子偶聯(lián)診療探針，將抗癌藥物阿霉素（Dox，發(fā)射波長：594 nm）與葉酸（FR）通過二硫鍵（—S—S—）偶聯(lián)，構(gòu)建了可發(fā)射熒光和可激活細(xì)胞毒性的靶向診療探針Doxo-S-S-Fol［圖1（A）］.當(dāng)阿霉素與葉酸通過二硫鍵偶聯(lián)時，阿霉素的熒光和細(xì)胞毒性均被猝滅（OFF）.谷胱甘肽（GSH）作為一種還原型三肽，通過控制各種細(xì)胞內(nèi)過程如細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激和化療期間的抗氧化及細(xì)胞凋亡，在保護(hù)細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用［21］.當(dāng)葉酸靶向到腫瘤部位時，在GSH存在下可以將二硫鍵斷開，阿霉素的熒光被激活（ON）.作者同時還設(shè)計了以碳碳鍵（—C—C—）連接阿霉素和葉酸的對比探針，在GSH存在下其熒光沒有明顯改變，說明二硫鍵能夠有效被GSH斷開.如圖1（B）所示，體外細(xì)胞實驗證實Doxo-S-S-Fol具有較高的細(xì)胞攝取，同時觀察到FR過表達(dá)A549細(xì)胞成像的熒光強(qiáng)度隨著時間增加而增強(qiáng)，在12 h時達(dá)到高峰.隨后Dox誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，熒光強(qiáng)度逐漸下降［圖1（B）］.GSH誘導(dǎo)激活的Doxo-S-S-Fol在48 h內(nèi)殺死近90%的癌細(xì)胞，而對照探針Doxo-C-C-Fol只引起5%的細(xì)胞死亡.與單一阿霉素（IC50=20.3μmol/L）相比，Doxo-S-S-Fol的IC50值達(dá)到1.27μmol/L，表明Doxo-S-S-Fol作為前藥是一個對癌癥細(xì)胞成像與治療都有效的診療探針.

Fig.2 Activation principle and imaging property of DCM-S-CPT[30]

二氰基亞甲基-4H-吡喃衍生物（Dicyanomethylene-4H-pyran，DCM）作為經(jīng)典的給體-π-受體類熒光單元，因其超快的內(nèi)部電荷轉(zhuǎn)移而表現(xiàn)出寬的吸收帶［22～26］.基于DCM衍生物開發(fā)熒光探針在近些年來受到廣泛關(guān)注，通過調(diào)節(jié)電子受體，DCM衍生物的發(fā)射波長甚至可以延長至近紅外區(qū)，同時具有大的斯托克斯位移及高的光穩(wěn)定性等特點［27～29］.2014年，Zhu等［30］開發(fā)了一類GSH激活的單分子診療探針DCM-S-CPT.該探針以DCM作為熒光單元，通過二硫鍵與抗癌藥物喜樹堿（Camptothecin，CPT）偶聯(lián)，如圖2（A）所示，在GSH存在下二硫鍵斷開，CPT被釋放出來，DCM的氨基作為給電子基團(tuán)游離出來，從而激活DCM的熒光，其發(fā)射峰位于665 nm.作者將二硫鍵替換為碳碳鍵合成了DCM-C-CPT作為對照，體外細(xì)胞實驗證明DCM-S-CPT對BCap-37，HepG2，MCF-7，HeLa，KB和KB-200等細(xì)胞系的活性比單一的CPT更高，比DCM-C-CPT的高約2倍.為了評估DCM-S-CPT的成像功能，分別將DCM-S-CPT和DCM-C-CPT通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi).由圖2（B）和（D）可見，注射DCM-S-CPT約9 min后，小鼠身上便有了熒光信號，說明藥物已經(jīng)開始在體內(nèi)釋放；而DCM-C-CPT組的熒光信號很弱.更重要的是，體外分布實驗證明DCM-S-CPT可以在腫瘤中釋放更多的藥物［圖2（C）和（E）］.為了驗證體內(nèi)腫瘤治療效果，作者將DCM-S-CPT用聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）包載形成膠束，并且與CPT組、DCM-CCPT組及對照組（PBS）進(jìn)行對比，結(jié)果顯示DCM-S-CPT對BCap-37荷瘤鼠的治療效果最佳，充分證實了DCM-S-CPT作為診療探針的巨大潛力.

2017年，Wu等［31］以DCM作為熒光基團(tuán)，以CPT作為抗癌藥物，開發(fā)了以GSH觸發(fā)式自降解樹枝狀單元雙邊偶聯(lián)DCM和CPT的前藥CPT-DNS-DCM，其中DCM熒光團(tuán)的初始熒光幾乎完全被吸電子觸發(fā)式自降解單元猝滅.在大量GSH存在的情況下（圖3），經(jīng)過1，4-消除反應(yīng)，活性的CPT和DCM被釋放，在單光子或雙光子激發(fā)下HeLa細(xì)胞內(nèi)可觀察到明顯的熒光，表明CPT-DNS-DCM可以有效在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物，測得其對HeLa細(xì)胞系的IC50值為5.8μmol/L.該前藥還用于體內(nèi)跟蹤荷瘤小鼠的藥物釋放，在給藥4 h后便可以觀察到腫瘤部位的熒光，表明藥物開始釋放，注射24 h后腫瘤部位的熒光依舊很強(qiáng).此外，CPT-DNS-DCM脂質(zhì)體在原位抗腫瘤試驗中表現(xiàn)出對腫瘤生長的高度抑制作用.

Fig.3 Activation principle of CPT-DNS-DCM

Fig.4 Organic theranostic probes based on naphthalimide fluorophore

萘二甲酰亞胺因其獨特的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移特性和高的量子產(chǎn)率而被認(rèn)為是一種有較大價值的熒光報告基團(tuán)［32～34］.2012年，Kim等［35］報道了一個基于萘二甲酰亞胺熒光團(tuán)的可見光診療探針.如圖4中化合物1所示，通過二硫鍵將熒光基團(tuán)萘二甲酰亞胺（紅色部分）與抗癌藥物喜樹堿偶聯(lián)；同時，萘二甲酰亞胺的N上連接了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）環(huán)肽用于靶向U78腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的αvβ3受體，在腫瘤的GSH催化下二硫鍵斷開，熒光團(tuán)和藥物分別被釋放，其中萘二甲酰亞胺可以發(fā)射535 nm的光.作者通過細(xì)胞成像驗證了化合物1在U78細(xì)胞內(nèi)可以有效斷開二硫鍵并釋放藥物，測得其48 h的IC50值為1μmol/L.2014年，該課題組［36］通過將RGD更改為生物素作為定向基團(tuán)，同時將抗癌藥物喜樹堿更改為多肽藥物Holiday Junction（HJ）抑制劑，設(shè)計合成了化合物3（圖4）.HJ是在DNA損傷的同源重組修復(fù)過程中形成的一種短暫的4鏈DNA結(jié)構(gòu)，而HJ多肽抑制劑可以與HJ相互作用從而發(fā)揮抗癌活性.化合物3可通過生物素靶向至HepG2細(xì)胞并釋放HJ多肽抑制劑，同時細(xì)胞內(nèi)熒光增強(qiáng).通過熒光強(qiáng)度實時監(jiān)測藥物的釋放量，從而為其它多肽類藥物的開發(fā)提供了一種策略，也為診療藥物的開發(fā)提供了思路.2013年，Zhou等［37］將氮芥類藥物與萘二甲酰亞胺通過二硫鍵相偶聯(lián)，合成了化合物2（圖4）.體外光學(xué)性質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)，化合物2的二硫鍵斷開前的發(fā)射波長為475 nm，滴加二巰基蘇糖醇后二硫鍵斷開，其發(fā)射波長紅移至533 nm.采用HeLa癌細(xì)胞測得其IC50值為（28.8±0.8）μmol/L，同時通過細(xì)胞成像觀察到細(xì)胞熒光從藍(lán)色［藍(lán)色通道：（450±35）nm］逐漸變?yōu)榫G色［綠色通道：（515±30）nm］，從而證明在細(xì)胞內(nèi)化合物2的二硫鍵斷開，藥物被釋放，同時萘二甲酰亞胺的熒光發(fā)生變化.

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，在各種生物過程中發(fā)揮著重要作用，眾多氧化還原反應(yīng)在這些細(xì)胞器內(nèi)進(jìn)行［38］.在癌細(xì)胞內(nèi)，線粒體具有更高的膜電位.三苯基膦（TPP）由于親脂陽離子的特性從而可以靶向線粒體，因此常作為靶向線粒體的分子單元與其它藥物偶聯(lián).F16小分子是一種新的親脂陽離子，既能作為熒光團(tuán)，又具有殺傷癌細(xì)胞的活力，同時作為離域陽離子化合物可以靶向癌細(xì)胞的線粒體，引發(fā)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和壞死［39，40］.2014年，Cheng［41］等將TPP與F16衍生物偶聯(lián)，研發(fā)了可見光有機(jī)診療探針F16-TPP，F(xiàn)F16-TPP和MeF16-TPP［圖5（A）］.該類化合物具有雙靶向線粒體的離域陽離子基團(tuán)，發(fā)射波長位于525 nm.在U84MG和MDA-MB-231兩個細(xì)胞系上分別進(jìn)行細(xì)胞攝取實驗和細(xì)胞熒光成像實驗，結(jié)果顯示這些化合物均可以很好地分布在癌細(xì)胞線粒體內(nèi).其中，相比于U87MG細(xì)胞系，F(xiàn)F16-TPP在MDA-MB-231細(xì)胞系中具有更高的攝取量，在這些化合物中，MeF16-TPP具有最優(yōu)異的癌細(xì)胞攝取能力.在U87MG細(xì)胞系上測得F16-TPP，F(xiàn)F-16-TPP和MeF16-TPP的IC50值分別為＞200，（28.9±1.1）和（64.0±1.3）μmol/L，氟原子的引入顯著提高了細(xì)胞活性.2019年，Cheng等［42］繼續(xù)改進(jìn)該類化合物，合成出一系列F16的衍生物，其中5BMF顯示出最好的細(xì)胞活性，其IC50達(dá)到約50 nmol/L，對癌細(xì)胞的選擇性是正常細(xì)胞的225倍［圖5（A）］.體外細(xì)胞成像結(jié)果顯示，該化合物可以在3T3，H838和T24等細(xì)胞系的線粒體內(nèi)積累，與商業(yè)化線粒體示蹤探針MitoTracker Red成像重合度非常高［圖5（B），Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.978，0.924和0.929］.因此，將該化合物用于荷瘤鼠的體內(nèi)研究.以15 mg/kg的劑量靜脈注射5BMF，2 h后HCC827荷瘤鼠的腫瘤部位出現(xiàn)熒光［圖5（C）］，腫瘤與周圍正常組織的熒光比值為2.腫瘤治療實驗顯示，5BMF具有強(qiáng)效的抑制腫瘤生長的能力，表明5BMF作為有機(jī)小分子診療探針的較好潛力.

Fig.5 Structures and imaging property of F16 derivatives[42]

1.2 近紅外一區(qū)有機(jī)小分子診療探針

花菁染料作為經(jīng)典的近紅外熒光染料，廣泛用于動物血管、腫瘤以及淋巴結(jié)成像.其中，吲哚菁綠（ICG）是目前唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的花菁染料，用于人體肝臟疾病的診斷.基于花菁染料結(jié)構(gòu)設(shè)計診療探針是一個很有前景的方向.2013年，Yang等［43］開發(fā)了一系列通過氨基甲酸乙二硫基連接花菁染料和抗癌藥物吉西他濱的診療探針，同時連接葉酸作為靶向基團(tuán)［圖6（A）］.當(dāng)在含有0.2 mmol/L的GSH溶液中孵育時，該診療探針在735 nm處的熒光增強(qiáng)了42倍，通過電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）進(jìn)一步證實了GSH可以有效斷開二硫鍵，并釋放藥物吉西他濱.作者選取葉酸受體表達(dá)陽性的KB細(xì)胞和葉酸受體表達(dá)陰性的A549細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞熒光成像實驗，結(jié)果顯示只有在KB細(xì)胞中觀察到紅色熒光，說明探針進(jìn)入到KB細(xì)胞并成功釋放藥物［圖6（B）］.此外，建立了KB皮下瘤小鼠模型和A549皮下瘤小鼠模型，將Cy7通過靜脈注射入小鼠體內(nèi)，24 h后將腫瘤摘除并切成7μm厚的薄片，隨后進(jìn)行熒光成像.只有在KB皮下瘤實驗組觀察到了紅色熒光，而A549皮下瘤實驗組未觀察到，表明Cy7具有靶向腫瘤葉酸受體的特異性.

Fig.6 Structure and imaging property of Cy7[43]

IR-780碘化物是一種近紅外熒光染料，其在腫瘤細(xì)胞的線粒體中表現(xiàn)出特異積累的特性.2014年，Shi等［44］研究了IR-780靶向腫瘤細(xì)胞的可能機(jī)制及其作為藥物遞送載體的潛力，發(fā)現(xiàn)IR-780碘化物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞線粒體屬于能量依賴的主動轉(zhuǎn)運(yùn)，腫瘤細(xì)胞對其攝取受糖酵解和線粒體膜電位的影響.此外，OATP1B3亞型有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽（OATPs）可能在IR-780碘化物轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞中起主導(dǎo)作用，而細(xì)胞內(nèi)吞作用、線粒體膜電位和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對其沒有顯著影響.作者將IR-780與氮芥偶聯(lián)得到IR-780NM，動物腫瘤成像顯示出IR-780NM具有腫瘤靶向特性，表明IR-780碘化物可潛在地用作癌癥靶向成像和治療藥物的遞送，為有機(jī)診療探針的設(shè)計提供載體.腦腫瘤以及腦腫瘤轉(zhuǎn)移是一類預(yù)后極差、患者生存期極短的致命性疾病，由于腦腫瘤對化療和放療具有較高耐受性，因此通過成像發(fā)現(xiàn)腫瘤并早期手術(shù)干預(yù)腦腫瘤是一線標(biāo)準(zhǔn)治療［45，46］.研發(fā)對腦腫瘤檢測與治療的診療探針的核心挑戰(zhàn)是將診療藥物有效輸送至腫瘤部位，而血腦屏障是大多數(shù)藥物從體循環(huán)輸送至腦腫瘤組織的主要障礙.為解決這個問題，Wu等［47］基于近紅外花菁染料開發(fā)了用于原發(fā)性腦腫瘤成像和治療的診療探針NIRG.該探針將IR783與抗癌藥物吉西他濱偶聯(lián)，前期研究證實IR783可以通過缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）和有機(jī)陰離子通道（OATPs）信號軸優(yōu)先靶向腫瘤細(xì)胞［48］.為了驗證NIRG是否可以通過血腦屏障到達(dá)腦腫瘤，構(gòu)建了小鼠顱內(nèi)U87異種移植瘤，每只小鼠給藥后1 h便可以觀察到近紅外熒光.這說明NIRG能夠穿透血腦屏障靶向腦腫瘤，在24 h熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；與無腫瘤對照組相比，不同時間點的信號背景比值在3.5～4.2之間.體外分布實驗表明，腦腫瘤熒光強(qiáng)度是脾臟的7.9倍.NIRG顯著抑制了小鼠顱內(nèi)U87腫瘤的生長，而且小鼠的體重未受影響，表明NIRG是一個有效的有機(jī)診療探針.Shih等［49］將單胺氧化酶A（MAOA）抑制劑Clorgyline與花菁染料通過共價鍵偶聯(lián)，得到有機(jī)診療藥物NMI［圖7（A）］.作者構(gòu)建了人前列腺癌細(xì)胞C4-2B皮下瘤小鼠模型，通過定期瘤內(nèi)注射NMI，考察了NMI對腫瘤的治療作用.在給藥后通過近紅外成像發(fā)現(xiàn)，NMI可以蓄積在腫瘤部位［圖7（B）］，在整個治療期間NMI組小鼠的腫瘤生長明顯被抑制［圖7（C）］.

Fig.7 Theranostic property of cyanine based probes[49]

2016年，Ye等［50］基于花菁染料推拉電子結(jié)構(gòu)的改變會導(dǎo)致發(fā)射波長變化的原理，設(shè)計了一類新型有機(jī)診療探針Cy-S-CPT.該探針通過二硫鍵將花菁染料與喜樹堿偶聯(lián)，在GSH的催化下通過二硫鍵斷開和分子內(nèi)環(huán)合2步，釋放游離的CyA-K和CPT［圖8（A）］.其中，熒光團(tuán)的發(fā)射波長由于π共軛體系被減弱，從825 nm藍(lán)移至650 nm，從而允許雙通道雙色檢測探針在動物體內(nèi)的分布.采用Cy-S-CPT在人乳腺癌細(xì)胞BCap-37和正常細(xì)胞MDCK進(jìn)行了細(xì)胞活性實驗，同時以碳碳鍵偶聯(lián)花菁染料和喜樹堿的探針Cy-C-CPT作為對照，結(jié)果測得Cy-S-CPT的IC50值為1.7μmol/L，Cy-C-CPT的則為11.3μmol/L.由于對正常細(xì)胞也具有毒性，作者采用PEG-PLA包載形成納米粒從而增大在腫瘤中的攝取.如圖8（B）～（D）所示，對小鼠通過尾靜脈注射了PEG-PLA/Cy-S-CPT，PEG-PLA/Cy-C-CPT及PEG-PLA/CyA-K，選取825 nm通道（綠色）觀察探針在全身的生物分布，選取650 nm通道觀察藥物的釋放情況，兩種通道的疊加（黃色）表明同時存在原始探針與游離的探針.注射4 h后，由于Cy-S-CPT逐漸被激活，綠色信號逐漸減弱，紅色信號逐漸增強(qiáng)，注射24 h后腫瘤部位的信號比Cy-C-CPT更高，說明藥物被有效釋放，也表明了Cy-S-CPT探針的優(yōu)異性能.在治療方面，BCap-37皮下瘤小鼠模型被隨機(jī)分組并靜脈注射PEG-PLA/Cy-S-CPT、伊立替康（CPT-11）和PBS，治療周期結(jié)束后，測得PEG-PLA/Cy-S-CPT組的腫瘤抑制率達(dá)到94.0%，而CPT-11組則僅為55.8%，說明納米粒子滲透腫瘤以及二硫鍵斷開能夠更有效地發(fā)揮抗腫瘤活性.基于同樣的思路，Guo等［51］設(shè)計合成了Cy-CPT-Biotin（圖9），其發(fā)射波長為810 nm，該探針通過氨基甲酸酯與喜樹堿偶聯(lián)，同時通過點擊反應(yīng)與靶向配體生物素相連接.在680 nm（20 mW/cm2）光激發(fā)下，與花菁中心環(huán)相連的碳碳雙鍵發(fā)生斷裂，隨后連接喜樹堿的乙二氨基片段在生理條件下會發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)從而自我消除，釋放游離的喜樹堿，新生成的Cy-Biotin的發(fā)射波長藍(lán)移至535 nm.體外和體內(nèi)研究均表明Cy-CPT-Biotin具有良好的腫瘤靶向能力和光激發(fā)依賴的細(xì)胞毒性.該類體外光激活釋藥的診療探針具有雙通道熒光成像跟蹤藥物行為、優(yōu)秀的腫瘤靶向能力及利用光激活藥物釋放的時空控制等優(yōu)勢，從而能夠精確和有效地調(diào)整藥物在何處、何時及如何被遞送.

Fig.8 Activation principle of Cy-S-CPT and imaging property of Cy-S-CPT,Cy-C-CPT and CyA-K[50]

Fig.9 Structure of Cy-CPT-Biotin

聯(lián)合2種及以上的療法將會提高治療癌癥的療效.Liu等［52］報道了一個線粒體靶向、過氧化氫（H2O2）激活的近紅外一區(qū)有機(jī)診療探針，可實現(xiàn)近紅外熒光成像引導(dǎo)的化療-光動力（PDT）聯(lián)合治療.由圖10（A）可見，利用頻哪醇與苯硼酸之間形成的硼酸酯鍵可以在H2O2存在下斷開，選擇了含有頻哪醇的抗癌前藥脫氧氟尿苷，同時在熒光團(tuán)NPS上引入苯硼酸結(jié)構(gòu)，最終得到PNPS.由于PNPS的羥基被取代，因此其近紅外熒光和PDT效應(yīng)被抑制.NPS的熒光發(fā)射波長位于710 nm，體外細(xì)胞實驗證明，無光照條件下，不與藥物偶聯(lián)的NPS-H2O2和脫氧氟尿苷與HeLa和HepG2細(xì)胞孵育3 h后，仍有超過80%的細(xì)胞存活，而PNPS對HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值分別為16.6和14.8μmol/L，說明PNPS單獨化療效果優(yōu)于脫氧氟尿苷，而在白光照射下，PNPS對HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50分別達(dá)到9.32和8.15μmol/L.作者在HCT116腫瘤鼠上進(jìn)行了近紅外成像實驗，如圖10（B）所示，尾靜脈注射PNPS后1 h在腫瘤部位開始有熒光，說明藥物開始釋放，隨后的12 h內(nèi)熒光強(qiáng)度隨著時間的增加而增強(qiáng).這些實驗結(jié)果證明PNPS是一種高效的可靶向腫瘤的診療探針.

Fig.10 Structure and imaging property of PNPS[52]

1.3 近紅外二區(qū)有機(jī)小分子診療探針

將熒光成像窗口轉(zhuǎn)移至近紅外二區(qū)有利于提高成像分辨率、減少自體熒光和增大穿透深度，因此開發(fā)基于近紅外二區(qū)成像的診療一體化探針非常有前景.目前，已經(jīng)報道的整合近紅外二區(qū)成像與化療功能于一體的有機(jī)單分子診療探針依舊很少.2021年，Zheng等［53］報道了一個近紅外二區(qū)有機(jī)小分子診療探針H4-PEG-Glu［圖11（A）］，該探針具有線粒體靶向的能力，連接的PEG-Glu極大提高了該探針的水溶性.該探針不僅具有化療的作用，還能夠產(chǎn)生光熱效應(yīng)，同時該探針的主發(fā)射波長位于1085 nm，還有一個肩峰位于1200 nm.體外細(xì)胞實驗證實，無激光照射下H4-PEG-Glu對急性髓性白血病細(xì)胞THP-1和Molm-13的IC50值分別為（23.97±3.24）和（29.66±1.09）μmol/L，測得H4-PEG-Glu的光熱轉(zhuǎn)化效率為11.6%.作者建立了急性髓性白血病小鼠模型，考察了H4-PEG-Glu的成像和治療效果.如圖11（B）所示，尾靜脈注射3 h后便可以在骨髓處觀察到熒光信號，在對照組中無法觀察到此現(xiàn)象.隨后的治療實驗表明，H4-PEG-Glu光熱協(xié)同化療可以有效減少CD34+細(xì)胞的含量，同時生物安全性實驗未發(fā)現(xiàn)該探針對肝臟和腎臟功能的抑制，說明H4-PEG-Glu是一個相對有效而且安全的近紅外二區(qū)有機(jī)小分子診療探針.2022年，Cheng等［54］報道了一類基于Donor-Acceptor-Donor（D-A-D）電子結(jié)構(gòu)的有機(jī)小分子診療探針.受氮芥類藥物對癌細(xì)胞毒性隨著孵育溫度升高而增加的啟發(fā)，作者將氮芥藥物的活性片段雙-（二氯乙基）氨基引入到D-A-D類小分子的三苯胺受體上，從而得到整合近紅外二區(qū)熒光、光熱與化療一體化的有機(jī)小分子診療探針，為未來有機(jī)小分子診療探針的設(shè)計提供了參考．

Fig.11 Synthetic route and imaging property of H4-PEG-Glu[53]

2 現(xiàn)有挑戰(zhàn)與遠(yuǎn)景

由于個體差異的存在，癌癥治療標(biāo)準(zhǔn)化方案對不同患者產(chǎn)生的療效也有很大差別，因此個性化醫(yī)療成為趨勢.診療一體化正是通過將診斷與治療有機(jī)結(jié)合，從而對不同患者在治療過程中能夠?qū)崟r監(jiān)測疾病的變化情況，并對治療方案做出適當(dāng)改變.診療探針的研發(fā)是發(fā)展診療一體化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前已經(jīng)有基于核素成像和治療的診療探針、基于MRI的診療探針和基于熒光成像的診療探針被報道.相較于PET/SPECT和MRI，基于熒光成像的診療探針具有如下優(yōu)勢：（1）相較于MRI需要長時間掃描的特性，熒光成像具有靈敏度高的優(yōu)勢，尤其是近紅外二區(qū)成像的時間和空間分辨率較好；（2）PET/SPECT成像具有放射性，且基于PET成像的探針適合標(biāo)記的核素的半衰期通常較短（如18F，110 min），不利于長時間檢測藥物在腫瘤或者靶標(biāo)部位的分布情況；而熒光成像不具有放射性和衰減特性，在長時間檢測藥物分布方面具有優(yōu)勢；（3）開發(fā)生物小分子響應(yīng)型熒光分子能夠動態(tài)監(jiān)測生理反應(yīng)，如開發(fā)ATP，GSH，H2O2以及pH等智能響應(yīng)型熒光診療探針.這有利于反饋疾病的變化情況，對治療效果進(jìn)行實時評估并及時調(diào)整治療方案.

基于熒光成像的診療探針除了具有上述優(yōu)勢，還具有如下缺陷：（1）熒光成像穿透深度較小，對于深層組織成像不佳.盡管近紅外二區(qū)成像深度得到了極大提高，穿透深度依舊有限，大多數(shù)研究也僅停留在小鼠成像的研究階段.而研發(fā)發(fā)射波長更長的熒光團(tuán)，從而實現(xiàn)更深組織成像具有重要意義.（2）部分熒光染料的光穩(wěn)定性較差，如花菁類染料.差的光穩(wěn)定性會造成對成像結(jié)果的誤斷，因此研發(fā)光穩(wěn)定性高的熒光團(tuán)也是目前的研究重點.

與納米診療探針相比，基于熒光成像的有機(jī)單分子診療探針具有制備和質(zhì)控簡單、生物相容性好、臨床轉(zhuǎn)化前景好以及分子結(jié)構(gòu)易修飾等優(yōu)勢.研發(fā)有機(jī)單分子診療探針通常采用偶聯(lián)藥物分子和熒光團(tuán)的方式，引入的連接子（Linker）可以對生物大分子響應(yīng)（如二硫鍵對GSH響應(yīng)）從而斷開，釋放藥物和熒光團(tuán)，此外通過引入可以猝滅熒光團(tuán)的猝滅劑，可以實現(xiàn)智能響應(yīng)“點亮”型診療探針.基于熒光成像的有機(jī)診療探針雖然具有較好的臨床轉(zhuǎn)化前景，但仍舊存在以下問題亟待解決：（1）熒光成像靈敏度較高，往往只需要較低劑量便可以獲得較好的成像效果，而對于治療來說，比如化療需要較高的劑量來維持殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，因此診療探針的給藥劑量是一個需要考慮的問題.（2）將抗癌藥物與熒光團(tuán)偶聯(lián)后，與單一的藥物分子相比，診療探針在生物體內(nèi)的藥物代謝行為可能會被改變，藥物療效可能會受到影響，如何保持藥物在偶聯(lián)前后的活性也是一個很重要的問題.（3）目前診療探針的應(yīng)用還處于探索過程，具體如何利用診療探針解決臨床難題需要研究者深入思考.如，傳統(tǒng)鉑類化療藥物具有副作用大、易產(chǎn)生抗藥性、腫瘤組織蓄積少和分布不均勻等問題，通過設(shè)計具有靶向作用的診療探針，利用監(jiān)測功能實時觀察鉑類藥物在腫瘤和正常組織的代謝與分布情況，從而調(diào)控化療藥物對正常組織的副作用和在腫瘤的蓄積與分布情況.

3 總結(jié)與展望

診療一體化探針的發(fā)展目前依舊處于前期研究階段，整合熒光成像和化療功能于一個小分子上既充滿挑戰(zhàn)，又令人向往.在未來，將熒光成像的窗口轉(zhuǎn)移至近紅外二區(qū)具有巨大臨床轉(zhuǎn)化的潛力.本文重點總結(jié)了部分近年來具有代表性的有機(jī)單分子熒光成像診療探針，并將熒光成像又分為可見光成像、近紅外一區(qū)成像和近紅外二區(qū)成像三部分進(jìn)行闡述.雖然有很多研究聚焦于可見光和近紅外一區(qū)成像，開發(fā)近紅外二區(qū)成像的有機(jī)診療探針更有希望在臨床上實現(xiàn)對病人癌癥的診療.相信在未來會有越來越多基于近紅外二區(qū)成像的有機(jī)診療探針被開發(fā)出來，從而為癌癥的精準(zhǔn)防治提供更多的選擇.