銀杏葉提取物防治慢性阻塞性肺疾病的機制研究：基于PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)控肺泡巨噬細胞自噬

郭棟偉，張鵬飛*，任明君，廖麗君，黃茹妍，羅湘蓉

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，疾病負擔嚴重，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測，到2030年COPD將成為人類第三大死亡原因［1］。COPD發(fā)病機制主要包括慢性氣道炎癥、氧化-抗氧化失衡、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及免疫相關(guān)機制［2］，其中巨噬細胞參與免疫相關(guān)的調(diào)節(jié)，通過釋放促炎遞質(zhì)，包括趨化因子、細胞因子、蛋白酶等，在協(xié)調(diào)COPD的炎癥過程中發(fā)揮重要作用［3］。肺巨噬細胞數(shù)量增加與功能受損是COPD發(fā)病的重要機制［4］。自噬是細胞通過自噬溶酶體溶解細胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)、細胞器等來維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種重要的分解代謝過程［5］，為細胞修復(fù)、再生及延續(xù)提供條件。自噬在維持肺部炎性反應(yīng)系統(tǒng)的正常功能和COPD的病情進展中起著至關(guān)重要的作用［6］。吸煙是COPD的首要發(fā)病因素，研究發(fā)現(xiàn)吸煙者的肺泡巨噬細胞存在自噬功能缺陷，吸煙者的肺泡巨噬細胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體的異常蓄積，從而導(dǎo)致自噬體成熟障礙，引起蛋白質(zhì)聚集清除受損，線粒體功能失調(diào)，以及細菌向溶酶體的傳遞缺陷［7］。如何抑制巨噬細胞釋放促炎因子，改善COPD患者肺泡巨噬細胞自噬缺陷已逐漸成為防治COPD的新熱點。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)途徑之一，參與調(diào)控細胞生長、增殖、分化、自噬和凋亡等［8］，在細胞自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）是從銀杏的干燥葉中提取而來的以黃酮類、萜類內(nèi)酯為主要活性成分的混合物，具有改善血液循環(huán)、抗血小板聚集、清除自由基、抗氧化等主要藥理作用［10］，臨床上被廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病。近年來有關(guān)GBE治療COPD的報道日益增多。梁煒等［11］研究發(fā)現(xiàn)GBE可抑制COPD大鼠氣道和全身炎性反應(yīng)，且早期干預(yù)效果更好。譚玉萍等［12］發(fā)現(xiàn)GBE能在一定程度上改善COPD大鼠氣道重塑及肺血管重塑情況，但GBE治療COPD的具體作用機制尚不清楚。本研究旨在驗證GBE能否通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路促進肺泡巨噬細胞自噬，起到防治COPD的作用，為GBE在COPD防治中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究時間 本實驗的研究時間為2020年11月至2022年3月。

1.1.2 實驗動物與分組 7周齡SPF級雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量（200±20）g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0013。實驗前1周將大鼠置于實驗環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫25～28 ℃，空氣流通好，顆粒麥麩飼養(yǎng)。飼養(yǎng)籠具、飼料、飲水、墊料均按照SPF級實驗動物的要求進行制備與消毒。按照隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為正常對照組、COPD模型組、GBE組、比卡魯胺組、雷帕霉素組、Taselisib組，每組15只。本實驗由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準（批準編號：DW20220615-063）。

1.1.3 實驗試劑與儀器設(shè)備 銀杏葉提取物選用舒血寧注射液（國藥準字Z13020795，河北神威藥業(yè)集團有限公司），規(guī)格5 ml/支，含銀杏葉提取物 17.5 mg，總黃酮醇苷4.2 mg，銀杏內(nèi)酯0.70 mg。比卡魯胺（愛必信生物科技有限公司，貨號：ABS817935），雷帕霉素（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號：MB1197），Taselisib（美國MCE公司，貨號：HY-13898），云煙過濾嘴香煙（紅云紅河煙草有限責任公司，焦油量10 mg/支、煙氣煙堿量1.1 mg/支，煙氣一氧化碳含量12 mg/支），脂多糖（LPS）（美國Sigma公司，貨號：L2880），白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒（深圳市欣博盛生物科技有限公司），PI3Kp110α（貨號：4249）、Akt（貨號：4691）、p-Akt（貨號：4060）、mTOR（貨號：2983）、p-mTOR（貨號：5536）、LC3A/B（貨號：12741）均購自美國CST公司，CD68抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-0649R）。倒置顯微鏡（MI52-N，廣東明美），超低溫冰箱（705，美國THERMO），倒置熒光顯微鏡（DMIL LED，德國LEICA公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（DG5033A，南京華東），冰凍切片機（CM1850 德國LAICA），全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（Tanon-5200，上海天能），透射電鏡（HT7700，日立）。

1.2 實驗方法

1.2.1 COPD大鼠造模與結(jié)果判定 正常對照組于第1、14天向氣管內(nèi)注入0.9%氯化鈉溶液（NS）100 μl/100 g，其余時間均進行正常飼養(yǎng)。其余各組采用香煙煙霧熏吸聯(lián)合氣管內(nèi)注入LPS構(gòu)建COPD大鼠模型［13］，在造模的第1 、14 天將大鼠以10%水合氯醛（3 ml/kg）以腹腔注射麻醉后，將大鼠固定，暴露喉頭，向大鼠氣管內(nèi)注入LPS 100 μl/100 g（1 mg/ml），完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s，使LPS均勻分布于肺部，于實驗的第2～13 天、15～28 天，每天在自制煙熏箱（120 cm×80 cm×80 cm，含1個進煙孔，2個排煙孔）中對大鼠進行香煙煙霧暴露，持續(xù)吸入新鮮的香煙煙霧1 h/d，30 支/d，造模28 d結(jié)束；造模過程中，因麻醉意外和香煙煙霧熏吸導(dǎo)致正常對照組、GBE組、比卡魯胺組、雷帕霉素組各死亡1只，COPD模型組和Taselisib組各死亡2只，造模結(jié)束后，每組大鼠隨機處死2只進行肺組織病理檢測，判斷造模結(jié)果。實驗28 d后，正常對照組大鼠進食、活動均正常，呼吸順暢，大鼠肺泡壁完整、泡腔無擴大，支氣管結(jié)構(gòu)正常、形態(tài)清晰、纖毛排列整齊，血管腔無狹窄、血管壁無增厚，其余各造模組大鼠出現(xiàn)進食減少、蜷伏少動、毛發(fā)枯黃易脫落、氣道有痰鳴音表現(xiàn)，肺組織病理表現(xiàn)為肺泡壁斷裂融合形成肺大泡、肺氣腫明顯、氣道管壁增厚、氣道管腔狹窄、血管壁增厚、血管腔狹窄、炎性細胞浸潤明顯，判定造模成功。

1.2.2 用藥方案 實驗的第15 ～28 天，GBE組給予舒血寧注射液腹腔注射，用藥量為0.4 ml·kg-1·d-1，其余各組均腹腔注射同等體積的NS做對照；于實驗第29～42 天，采用由DMSO、聚乙二醇、吐溫80、NS配制的混合溶劑溶解藥劑，比卡魯胺組按照1.0 mg·kg-1·d-1腹腔注射給藥、雷帕霉素組按照0.5 mg·kg-1·d-1給藥、Taselisib組按照1.5 mg·kg-1·d-1給藥，其余各組均采用腹腔注射混合溶劑對照。

1.2.3 標本采集 全部實驗結(jié)束后即第43 天，各組大鼠用10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，腹主動脈采血5 ml/只，3 000 r/min（離心半徑為9 cm）離心15 min，留取血清分裝，于-80 ℃冰箱保存。提取大鼠原代肺泡巨噬細胞、留取大鼠肺泡灌洗液（BALF），隨后剖取肺臟，取距離肺門3 mm處的右肺組織做連續(xù)切片，快速放入4%多聚甲醛溶液中，用于后續(xù)的病理檢測。其余的右肺組織經(jīng)干冰速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白與RNA提取。取左肺組織放入電鏡固定液固定，用于透射電鏡觀察。

1.2.4 大鼠原代肺泡巨噬細胞分離純化與BALF留取參照禹茜等［14］的方法，將麻醉后的大鼠用75%乙醇浸泡30 min，剪開頸部皮膚，分離氣管，在環(huán)狀軟骨下用剪刀做T字形切口，將自制氣管插管由切口處插入氣管內(nèi)，使用縫合線固定，取5 ml注射器去除針頭，吸取含體積分數(shù)5%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液的冷PBS緩沖液 3 ml，由氣管插管口注入大鼠肺內(nèi)，輕柔按摩2 min后回吸，重復(fù)5次，可回收BALF約10 ml，離心（4 000 r/min，離心20 min，離心半徑為9 cm）后取上清液于-80 ℃冰箱保存，沉淀應(yīng)用紅細胞裂解液去除紅細胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸計數(shù)，接種入細胞培養(yǎng)瓶中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后換液，用傳統(tǒng)貼壁法進一步提純細胞。

1.2.5 HE染色 采用4%多聚甲醛固定大鼠右肺組織48 h后，采用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，冰凍后切片，切片厚度為3 μm，二甲苯脫蠟脫水，進行HE染色后使用中性樹膠封固。使用倒置顯微鏡拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析測算。

肺泡病理改變：在每只大鼠的HE染色切片中選取5個不同視野，200倍鏡下觀察、記錄、分析肺泡的病理改變。如下，（1）觀察肺平均內(nèi)襯間隔（MLI）：以每個視野的正中為中心劃“十”字線，計數(shù)經(jīng)此十字線的肺泡間隔總數(shù)（Ns），計算十字線總長度（L），MLI=L/Ns，其值反映肺泡平均直徑；（2）平均肺泡數(shù)（MAN）：計數(shù)每個視野內(nèi)的肺泡總數(shù)（Na），除以此視野的面積（TA），MAN=Na/TA（個/mm2），其值反映肺泡的密度；（3）平均肺泡面積（MAA）：以HE染色陽性區(qū)域的面積為PA，MAA=（TA-PA）/Na（μm2）。氣道重塑：顯微鏡下觀察各組大鼠支氣管的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、纖毛排列以及炎性細胞浸潤情況。

1.2.6 ELISA檢測 采用ELISA檢測大鼠BALF與血清中IL-6、IL-8水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.7 原代肺泡巨噬細胞的免疫熒光鑒定 CD68抗體分布在細胞表面，在單核細胞的表面表達較少，當其向巨噬細胞轉(zhuǎn)化后表達明顯增加，CD68抗體是巨噬細胞譜系中高度特異性表達的蛋白質(zhì)，常作為鑒定巨噬細胞的特異性標志物［15-16］，純化后的巨噬細胞使用胰蛋白酶消化后，重懸調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml，將24孔板爬片置入24孔板中，巨噬細胞接種于細胞爬片上，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出，巨噬細胞已完全貼壁。先后予PBS緩沖液浸洗、4%多聚甲醛固定、0.5%Triton X-100室溫通透、5%山羊血清37 ℃封閉、CD68抗體4 ℃孵育過夜、熒光羊抗兔二抗37 ℃孵育、DAPI染核、抗熒光淬滅劑封固，使用倒置熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.8 各組大鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量的比較 由于各組大鼠間體質(zhì)量存在一定差異，因此采用單位質(zhì)量肺組織肺泡巨噬細胞的收集量（×106/g肺組織）來比較各組大鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量差異，具體計算方法如下：大鼠肺泡灌洗收集到的肺泡巨噬細胞總數(shù)量與大鼠肺組織的質(zhì)量之比。將各組大鼠肺泡巨噬細胞使用胰蛋白酶消化后，收集于15 ml離心管中離心（2 000 r/min，離心10 min，離心半徑為6 cm），吸去上清，后各加入3 ml RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，使用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計算每只大鼠的肺泡巨噬細胞數(shù)量。

1.2.9 大鼠肺泡巨噬細胞的透射電鏡觀察 采用透射電鏡觀察大鼠肺泡巨噬細胞的超微結(jié)構(gòu)，將大鼠的左肺組織取出后切成小塊，快速放入新鮮的2.5%戊二醛固定液中，在固定液中使用鋒利的刀片將肺組織切成 1 mm3大小，乙醇、丙酮脫水后丙酮、環(huán)氧樹脂浸透，再進行包埋、聚合，超薄切片（厚度60 nm）。先后使用醋酸鈾避光染色、枸櫞酸鉛避光染色，使用透射電鏡觀察巨噬細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)并采集圖像。

1.2.10 大鼠肺泡巨噬細胞中自噬相關(guān)蛋白表達水平測定及微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值計算 采用免疫印記法檢測PI3Kp110α、Akt、p-Ak、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達水平，將各組大鼠原代肺泡巨噬細胞從培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)液，使用PBS緩沖液清洗2遍后按照每1×106個細胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液200 μl，4 ℃充分裂解細胞，提取肺泡巨噬細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度使各組保持一致，取20 μg總蛋白進行上樣，用SDS-PAGE電泳分離后，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入一抗 PI3 Kinase p110α、Akt、p-Ak、mTOR、p-mTOR、LC3A/B、β-Actin，稀釋比均為1∶1 000，4 ℃過夜，PBST緩沖液洗滌3次，按照1∶10 000稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG二抗，與膜室溫孵育1 h，用PBST緩沖液洗滌3次，將膜放置在暗室中，根據(jù)用量取ECL發(fā)光液進行顯影，采用Image J圖像分析軟件統(tǒng)計各條帶灰度值并計算各蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組大鼠肺泡病理改變 HE染色結(jié)果顯示：正常對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)，肺泡壁完整，泡腔無擴大，肺泡數(shù)目較多；與正常對照組相比，COPD模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)雜亂，肺泡壁變薄斷裂，肺泡腔擴大，肺泡間隔數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)較多肺大泡，肺氣腫明顯；GBE組及各抑制劑組大鼠肺泡損傷程度較COPD模型組有所減輕，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，肺大泡形成較少，見圖1。六組大鼠MLI、MAA、MAN比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。COPD模型組、GBE組、比卡魯胺組、雷帕霉素組、Taselisib組MLI與MAA大于正常對照組，MAN小于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；GBE組、比卡魯胺組、雷帕霉素組、Taselisib組MLI與MAA小于COPD模型組，MAN大于COPD模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠MLI、MAN、MAA的比較（±s）Table 1 Comparison of mean linear intercept，mean alveolar area and mean alveolar number in rats of six groups

表1 各組大鼠MLI、MAN、MAA的比較（±s）Table 1 Comparison of mean linear intercept，mean alveolar area and mean alveolar number in rats of six groups

注：，COPD=慢性阻塞性肺疾病，GBE=銀杏葉提取物，MLI=肺平均內(nèi)襯間隔，MAN=平均肺泡數(shù)，MAA=平均肺泡面積；a表示與正常對照組比較P<0.05，b表示與COPD模型組比較P<0.05

組別 只數(shù) MLI（μm） MAN（個/mm2） MAA（μm2）正常對照組 12 47.59±4.74 206.91±31.14 4 573.30±789.90 COPD模型組 11 123.01±21.94a 85.36±14.73a 11 512.17±3 579.00a GBE 組 12 73.58±8.23ab 131.37±19.26ab 7 124.91±1 748.43ab比卡魯胺組 12 78.16±8.54ab 135.78±20.68ab 7 272.16±1 450.47ab雷帕霉素組 12 80.75±14.69ab 134.38±28.50ab 7 879.51±2 038.87ab Taselisib組 11 75.01±8.37ab 149.44±19.83ab 6 720.84±1 028.26ab F值 44.564 33.002 14.992 P值 <0.001 <0.001 <0.001

圖1 各組大鼠肺泡病理改變（200×）Figure 1 Pathological changes of alveoli in rats of normal control，COPD model，GBE，bicalutamide，rapamycin and taselisib groups

2.2 六組大鼠氣道重塑的比較 顯微鏡下觀察，正常對照組支氣管結(jié)構(gòu)正常，形態(tài)清晰，纖毛排列整齊，氣道纖毛柱狀上皮細胞完整，無炎性細胞浸潤；COPD模型組支氣管平滑肌層增厚，部分肌層已經(jīng)斷裂，黏膜下及外膜見膠原纖維增生，管腔狹窄，氣道黏膜上皮脫落、減少、紊亂，管壁及其周圍有明顯炎性細胞浸潤；GBE組與各抑制劑組大鼠支氣管壁結(jié)構(gòu)基本完整，氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，纖毛排列相對COPD模型組整齊，支氣管平滑肌層稍增厚，支氣管管壁及其周圍炎性細胞浸潤較少，詳見圖2。

圖2 各組大鼠氣道重塑的比較（400×）Figure 2 Comparison of airway remodeling status in rats of normal control，COPD model，GBE，bicalutamide，rapamycin and taselisib groups

2.3 六組大鼠BALF中IL-6、IL-8水平比較 六組大鼠BALF中IL-6、IL-8水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。COPD模型組IL-6、IL-8水平高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；GBE組IL-6高于正常對照組、比卡魯胺組、Taselisib組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；GBE組IL-8水平高于正常對照組、比卡魯胺組、雷帕霉素組和Taselisib組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠BALF中IL-6、IL-8水平的比較（±s，pg/ml）Table 2 Comparison of levels of IL-6 and IL-8 in alveolar lavage fluid in rats of six groups

表2 各組大鼠BALF中IL-6、IL-8水平的比較（±s，pg/ml）Table 2 Comparison of levels of IL-6 and IL-8 in alveolar lavage fluid in rats of six groups

注：IL-6=白介素6，IL-8=白介素8；a表示與正常對照組比較P<0.05，b表示與COPD模型組比較P<0.05，c表示與GBE組相比P<0.05，d表示與比卡魯胺組比較P<0.05，e表示與雷帕霉素組比較P<0.05

組別 只數(shù) IL-6 IL-8正常對照組 12 28.52±4.10 36.29±4.41 COPD模型組 11 243.26±13.93a 222.49±8.12a GBE組 12 34.39±2.01ab 114.98±7.37ab比卡魯胺組 12 20.58±2.83abc 73.75±3.82abc雷帕霉素組 12 28.97±4.23bd 101.42±7.27abcd Taselisib組 11 28.15±6.40bcd 75.50±3.01abce F值 1 923.260 1 282.215 P值 <0.001 <0.001

2.4 六組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較 六組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。COPD模型組的IL-6、IL-8水平高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），GBE組IL-6高于正常對照組、比卡魯胺組、雷帕霉素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），GBE組IL-8水平高于正常對照組、比卡魯胺組和Taselisib組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較（±s，pg/ml）Table 3 Comparison of serum levels of IL-6 and IL-8 in the rats of six groups

表3 各組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較（±s，pg/ml）Table 3 Comparison of serum levels of IL-6 and IL-8 in the rats of six groups

注：a表示與正常對照組比較P<0.05，b表示與COPD模型組比較P<0.05，c表示與GBE組相比P<0.05，d表示與比卡魯胺組比較P<0.05，e表示與雷帕霉素組比較P<0.05

組別 只數(shù) IL-6 IL-8正常對照組 12 80.56±12.72 17.63±1.95 COPD模型組 11 242.43±74.86a 85.79±17.19a GBE 組 12 181.92±44.39ab 67.57±11.83ab比卡魯胺組 12 137.37±18.40abc 45.16±2.69abc雷帕霉素組 12 59.49±13.63bcd 65.20±4.39abd Taselisib組 11 162.26±54.13abe 33.67±1.67abcde F值 29.251 94.826 P值 <0.001 <0.001

2.5 原代肺泡巨噬細胞的免疫熒光鑒定 細胞免疫熒光顯示細胞呈特異性表面標志物CD68抗體表達陽性，表明肺泡原代巨噬細胞的提取、純化成功，見圖3。

圖3 原代肺泡巨噬細胞的免疫熒光鑒定（200×）Figure 3 Primary alveolar macrophages identified by immunofluorescence staining

2.6 六組大鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量的比較 六組巨噬細胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；正常對照組巨噬細胞數(shù)量低于其他各組，COPD模型組巨噬細胞數(shù)量高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表4。

表4 各組大鼠單位重量肺組織肺泡巨噬細胞數(shù)量的比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of the number of alveolar macrophages per unit weight in lung tissues of rats in six groups

表4 各組大鼠單位重量肺組織肺泡巨噬細胞數(shù)量的比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of the number of alveolar macrophages per unit weight in lung tissues of rats in six groups

注：a表示與正常對照組比較P<0.05，b表示與COPD模型組比較P<0.05

組別 巨噬細胞數(shù)量（×106個/g）正常對照組 1.35±0.09 COPD模型組 3.68±0.20a GBE組 2.51±0.14ab比卡魯胺組 2.49±0.11ab雷帕霉素組 2.29±0.18ab Taselisib組 2.30±0.01ab F值 87.380 P值 <0.001

2.7 大鼠肺泡巨噬細胞透射電鏡觀察 電鏡是觀察細胞自噬的金標準，從透射電鏡圖片中可以看出，肺泡巨噬細胞位于肺的基底膜空腔內(nèi)側(cè)，巨噬細胞多呈圓形或橢圓形，表面有凸起，細胞漿內(nèi)可見數(shù)量不等的初級和次級溶酶體或吞噬體。圖4中綠色箭頭指示初級溶酶體，內(nèi)含未開始消化衰老的細胞器、線粒體、糖原等物質(zhì)；當細胞內(nèi)退變、崩解的某些細胞器或局部細胞質(zhì)由雙層膜加以包圍后形成囊泡狀小體，稱為自噬體。當自噬體與初級溶酶體融合后會形成次級溶酶體，又稱自噬溶酶體（藍色箭頭指示），并激活水解酶分解衰老的細胞器或過量積存的糖元等物質(zhì)，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。透射電鏡結(jié)果顯示正常對照組存在自噬，但自噬活動較弱，初級溶酶體與自噬溶酶體均較少；COPD模型組自噬作用較正常對照組增強，但自噬溶酶體較少，而初級溶酶體增多；GBE組與比卡魯胺組、雷帕霉素組、Taselisib組的自噬溶酶體較COPD模型組增多，見圖4。

圖4 各組肺泡巨噬細胞透射電鏡圖（7 000×）Figure 4 Transmission electron micrographs of alveolar macrophages in normal control，COPD model，GBE，bicalutamide，rapamycin and taselisib groups

2.8 六組大鼠肺泡巨噬細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較 六組大鼠肺泡巨噬細胞PI3Kp110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。正常對照組的PI3Kp110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達水平高于其他各組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。COPD模型組PI3Kp110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達水平高于GBE組、比卡魯胺組、雷帕霉素組、Taselisib組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值低于GBE組、比卡魯胺組、雷帕霉素組、Taselisib組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。GBE組Akt、mTOR高于Taselisib組，p-mTOR高于雷帕霉素組和Taselisib組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表5、圖5～7。

表5 各組大鼠肺泡巨噬細胞中自噬相關(guān)蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of expression levels of autophagy-related proteins in alveolar macrophages of rats in six groups

表5 各組大鼠肺泡巨噬細胞中自噬相關(guān)蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of expression levels of autophagy-related proteins in alveolar macrophages of rats in six groups

注：a表示與正常對照組比較P<0.05，b表示與COPD模型組比較P<0.05，c表示與GBE組相比P<0.05，d表示與比卡魯胺組比較P<0.05；e表示與雷帕霉素組比較P<0.05

組別 PI3Kp110α Akt p-Akt mTOR p-mTOR LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ正常對照組 1.11±0.23 0.98±0.11 0.55±0.02 0.77±0.12 0.47±0.02 1.02±0.01 COPD 模型組 0.81±0.18a 0.73±0.13a 0.42±0.01a 0.59±0.10a 0.42±0.02a 1.20±0.03a GBE 組 0.51 ±0.15ab 0.51±0.12ab 0.23±0.10ab 0.43±0.07ab 0.37±0.02ab 1.38±0.07ab比卡魯胺組 0.48±0.17ab 0.46±0.11ab 0.11±0.06ab 0.37±0.09ab 0.36±0.02ab 1.40±0.08ab雷帕霉素組 0.36±0.08ab 0.34±0.09ab 0.20±0.09ab 0.31±0.07ab 0.14±0.03abcd 1.43±0.15ab Taselisib 組 0.24±0.09ab 0.19±0.06abcd 0.22±0.11ab 0.23±0.07abc 0.33±0.02abce 1.39±0.08ab F值 11.783 21.185 15.120 15.078 76.594 11.798 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

圖5 各組大鼠肺泡巨噬細胞中PI3Kp110α、Akt、mTOR蛋白的表達Figure 5 Expression levels of PI3Kp110α，Akt and mTOR proteins in alveolar macrophages of rats in six groups

圖6 各組大鼠肺泡巨噬細胞中p-Akt、p-mTOR蛋白的表達Figure 6 Expression levels of p-Akt and p-mTOR proteins in alveolar macrophages of rats in six groups

圖7 各組大鼠肺泡巨噬細胞自噬相關(guān)蛋白的表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值Figure 7 Expression levels of LC3I and LC3II proteins in alveolar macrophages of rats in six groups

3 討論

COPD的發(fā)病機制主要包括炎性機制、氧化應(yīng)激機制、免疫學(xué)機制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡，而炎性機制是COPD的關(guān)鍵致病機制［17］，肺泡巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞在COPD的慢性炎性機制中發(fā)揮重要作用［18］。COPD患者氣道、肺實質(zhì)、BALF與痰液中巨噬細胞的數(shù)量明顯增多，且在肺氣腫肺泡壁破壞部位的浸潤更加明顯，而在肺實質(zhì)中的巨噬細胞數(shù)量與肺氣腫的嚴重程度呈正相關(guān)［19］。研究表明，肺泡巨噬細胞是導(dǎo)致COPD患者出現(xiàn)機體炎癥的始動細胞，其能促進炎癥趨化因子、中性粒細胞的釋放，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與COPD炎癥進展［20］。在本次研究中，COPD造模后的大鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量較正常對照組顯著增加，且肺氣腫、氣道重塑與肺泡壁破壞情況嚴重，大鼠氣道與肺組織內(nèi)炎癥浸潤明顯，血清與BALF中炎性因子IL-6、IL-8水平較正常對照組顯著升高，表明COPD造模成功；與COPD模型組比較，GBE組、比卡魯胺組、雷帕霉素組、Taselisib組均能在一定程度上改善COPD大鼠肺氣腫、肺泡壁破壞及氣道重塑，并能降低血清與BALF中IL-6、IL-8的水平，考慮和GBE與各抑制劑組均能降低大鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量、減輕巨噬細胞浸潤有關(guān)。

自噬是廣泛存在于真核細胞中的一種正常的生理降解機制，可主動清除細胞內(nèi)多余、受損、衰老的蛋白質(zhì)與細胞器以維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞完整性，是維持細胞自身生存的關(guān)鍵細胞修復(fù)途徑之一［21-22］。正常生理狀態(tài)下細胞自噬處于較低水平，而在應(yīng)激情況如營養(yǎng)缺乏、缺氧等條件下，可使細胞自噬作用增強［23］，作為機體自我保護的一種重要機制，自噬參與多種疾病的病理、生理過程，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展［24］。自噬在COPD的病理、生理過程中起關(guān)鍵性作用，既可以發(fā)揮保護作用，也可產(chǎn)生破壞性影響［25］。PI3K/Akt/mTOR信號通路已被證實是調(diào)節(jié)細胞自噬的主要通路［26］，PI3K是一種廣泛存在于胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，在炎性反應(yīng)、信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用，根據(jù)其序列同源性和底物特異性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3類，其中Ⅰ類PI3K可分為p110α催化亞基和p110β催化亞基［27］，PI3K能夠激活A(yù)kt參與下游信號因子的調(diào)控，Akt分子作為PI3K/Akt/mTOR信號通路中的關(guān)鍵分子，在促進細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細胞自噬和凋亡中發(fā)揮核心作用［28］，磷酸化后的Akt會將信號傳遞給mTOR，并通過激活泛素蛋白酶體途徑參與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因與下游底物表達，從而起到抑制自噬的作用［29］。mTOR是細胞自噬的調(diào)控中心，同時也是細胞自噬的能量和營養(yǎng)狀態(tài)的感受器，受包括PI3K/Akt等在內(nèi)的多種信號通路的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)細胞自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用［30-31］。LC3是自噬過程中的一個標志性蛋白質(zhì)，其表達的強度與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)［32］，自噬啟動后LC3-Ⅰ開始向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，LC3-Ⅱ被認為是代表自噬作用的標志性指標，其表達量的高低在一定程度上反應(yīng)了自噬體的數(shù)量和自噬的程度［33］，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與自噬小體的形成程度密切相關(guān)，是反映整個自噬水平的重要標志［34］。

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，GBE能降低COPD大鼠血清與BALF中IL-1、IL-8的水平，并能夠抑制COPD大鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，從而發(fā)揮抑制COPD大鼠氣道與全身炎性反應(yīng)、肺組織重塑與肺纖維化的作用，但其具體機制尚不清楚［35-36］。Taselisib是一種有效的選擇性PI3K抑制劑［37］；比卡魯胺作為Akt的抑制劑，能抑制小鼠RAW264.7巨噬細胞的Akt、mTOR蛋白的表達，增加LC3-Ⅱ蛋白表達［38］；雷帕霉素是一種經(jīng)典的自噬激動劑，通過抑制mTOR來激活自噬［39］；因此，本次研究采用Taselisib、比卡魯胺、雷帕霉素作為GBE能否通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路促進肺泡巨噬細胞自噬治療COPD的對照藥物。研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，COPD模型組肺泡巨噬細胞中PI3Kp110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表達水平下降，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上升，說明在COPD大鼠的肺泡巨噬細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路被抑制，自噬水平升高，進而引起肺泡巨噬細胞自噬增強；給予GBE、Taselisib、比卡魯胺、雷帕霉素干預(yù)后，與COPD模型組相比，大鼠肺泡巨噬細胞中的 PI3Kp110α、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平進一步下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，巨噬細胞自噬作用增強，加速清除多余、受損、衰老的蛋白質(zhì)與細胞器，保障巨噬細胞發(fā)揮正常的功能，抑制了COPD大鼠氣道與肺實質(zhì)內(nèi)巨噬細胞的異常蓄積，進而減輕了巨噬細胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)、肺泡破損與氣道重塑。

電鏡是觀測細胞自噬的“金標準”，由本次研究中透射電鏡結(jié)果可以看出正常對照組自噬溶酶體數(shù)量較少，自噬水平較低，COPD模型組溶酶體數(shù)量增多，自噬被激活，但以初級溶酶體增多為主，而自噬溶酶體較少，表明自噬體和初級溶酶體存在融合障礙，致使受損的細胞器、糖原等物質(zhì)溶解受阻，異常堆積，進而影響正常的細胞代謝與細胞器的更新，致使肺泡巨噬細胞自噬功能受損。GBE組與各抑制劑組的自噬溶酶體較COPD模型組明顯增多，能加速受損的細胞器、糖原的消化，促進細胞代謝與細胞器的更新，從而維持肺泡巨噬細胞發(fā)揮正常的自噬功能。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙的COPD患者肺泡巨噬細胞中自噬體的數(shù)量明顯增加，但由于存在自噬體運輸至溶酶體的功能障礙，致使自噬活性減弱、肺泡巨噬細胞清除功能受損，導(dǎo)致COPD肺氣腫的發(fā)生［7］。KONO等［40］研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧可損傷巨噬細胞的自噬功能，造成巨噬細胞自噬體成熟缺陷和自噬體內(nèi)蛋白質(zhì)、細胞器等物質(zhì)的異常積聚，本次研究結(jié)果與其一致。

巨噬細胞作為機體重要的免疫效應(yīng)細胞，具有十分強大的吞噬和殺傷病原體的功能，在機體的抗感染免疫中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［41］。研究表明，COPD患者的巨噬細胞吞噬功能低下，而香煙煙霧對巨噬細胞吞噬功能的損害更明顯，可造成其吞噬能力顯著下降［42］，而維持巨噬細胞正常的自噬功能可以直接參與調(diào)控巨噬細胞的吞噬功能，從而使巨噬細胞能有效清除病原體［43］。在本研究中，使用GBE與比卡魯胺、雷帕霉素、Taselisib干預(yù)后，PI3K/AKT/mTOR信號通路被抑制，自噬水平增強，促進了自噬體與溶酶體的結(jié)合，自噬溶酶體的數(shù)量明顯增加，加速受損的細胞器、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的消化，促進細胞代謝與細胞器的更新，使巨噬細胞的自噬活性增強，維持了巨噬細胞的正常的吞噬功能，使巨噬細胞能有效發(fā)揮其吞噬功能，清除COPD大鼠氣道與血液中的病原菌，減輕氣道與全身炎性反應(yīng)。

綜上所述，GBE能夠通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進肺泡巨噬細胞發(fā)揮正常自噬功能，起到治療COPD的作用，為GBE在COPD治療中的應(yīng)用提供一定實驗依據(jù)。本研究尚有不足之處，未設(shè)置相關(guān)蛋白分子的激動劑，部分指標影響機制相對復(fù)雜，仍需今后進一步深入研究。

作者貢獻：郭棟偉負責實驗設(shè)計、文章的構(gòu)思與設(shè)計，并對文章負責；張鵬飛組織課題實施、控制實驗質(zhì)量，負責論文起草、論文修訂與審校；任明君、廖麗君進行動物實驗與細胞實驗以及實驗相關(guān)指標檢測；黃茹妍、羅湘蓉負責論文檢索與查重。

本文無利益沖突。