47 kDa尾相互作用蛋白在慢性疾病中的作用研究進(jìn)展

張夢瑤，劉 睿，秦 潔

PAT家族蛋白鑲嵌在脂滴表面，是重要的脂滴表面蛋白之一。47 kDa尾相互作用蛋白(TIP47)屬于PAT家族蛋白的一員，主要參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，與動(dòng)脈粥樣硬化、肝脂肪變性、2型糖尿病、多囊卵巢綜合征(PCOS)及腫瘤等多種疾病相關(guān)。近年，隨著研究的深入，TIP47可能逐漸成為防治以上疾病的新靶點(diǎn)。本文綜述TIP47在上述疾病中的作用研究進(jìn)展，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 TIP47概述

TIP47最早發(fā)現(xiàn)于1983年，由BOHN等[1]從人胎盤組織細(xì)胞中提取所得，并將其命名為可溶性胎盤組織蛋白17。1998年美國斯坦福大學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TIP47可以直接與甘露糖-6-磷酸受體的細(xì)胞質(zhì)尾結(jié)合，介導(dǎo)其從核內(nèi)體到反高爾基體網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)輸，而且通過酵母雙雜交法提取出一分子量為47 kDa的蛋白，并將其正式命名為TIP47[2]。TIP47作為甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合蛋白，也被稱為甘露糖-6-磷酸受體蛋白1(M6PRBP1)。編碼該蛋白的基因也有不同的名字，如PLIN3、TIP47、M6PRBP1[3]。

TIP47是一種由434個(gè)氨基酸組成的親水蛋白，計(jì)算分子量為47033，預(yù)測pI為5.03[2]。它由一個(gè)四螺旋束結(jié)構(gòu)和一個(gè)α/β結(jié)構(gòu)域通過疏水裂縫連接而成，疏水裂縫保證了TIP47能夠穩(wěn)定地錨在脂滴表面。值得注意的是，TIP47的氨基酸殘基序列87-198中包含11-mer重復(fù)序列，這些重復(fù)序列可以形成雙親性螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)而介導(dǎo)了TIP47附著于LDs表面[4]。此外，TIP47的四螺旋束結(jié)構(gòu)與載脂蛋白E氨基端的一個(gè)結(jié)構(gòu)極為相似，該結(jié)構(gòu)打開后暴露疏水表面并結(jié)合脂蛋白，關(guān)閉后維持其在細(xì)胞液中的穩(wěn)定[5]。TIP47幾乎在所有的組織中均有表達(dá)，尤其在巨噬細(xì)胞、動(dòng)脈硬化斑塊以及肝細(xì)胞中表達(dá)最為豐富[6]。

TIP47的獨(dú)特性在于它是一種可交換的LDs相關(guān)蛋白，雙向調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂代謝[7]。BULANKINA等[4]注意到穩(wěn)定狀態(tài)下的HepG2細(xì)胞中不含TIP47，但采用脂肪酸孵育后，細(xì)胞內(nèi)LDs明顯增多，且TIP47的表達(dá)上調(diào)。然而，TIP47還能夠通過AMPK通路促進(jìn)脂滴的分解。TIP47的S31和T216是AMPK的磷酸化位點(diǎn)，其中S31是位于TIP47-N'端的可與LDs結(jié)合的保守PAT結(jié)構(gòu)域，T216是位于C'端的載脂蛋白E樣結(jié)構(gòu)域[8]。ZHU等[9]研究發(fā)現(xiàn)在TIP47磷酸化突變體S31/T216表達(dá)的HTC75細(xì)胞中LDs的彌散明顯增加。因此，TIP47通過AMPK通路磷酸化使構(gòu)象改變參與脂滴分散，進(jìn)而造成脂肪酸的脂解與氧化。此外，分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)是啟動(dòng)脂肪分解所必需的。CMA能夠選擇性地從脂滴表面降解TIP47，從而促進(jìn)胞質(zhì)中具有水解三酰甘油能力的三酰甘油脂肪酶和自噬效應(yīng)蛋白聚集到脂滴，促進(jìn)脂滴分解[10]。因此，TIP47不僅參與脂滴形成，還能夠促進(jìn)脂滴的分解。

2 TIP47與疾病關(guān)系

2.1動(dòng)脈粥樣硬化 泡沫細(xì)胞形成是動(dòng)脈粥樣硬化的早期病理過程。TIP47作為脂滴表面蛋白重要成員PAT家族蛋白之一，參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和脂滴形成，與泡沫細(xì)胞病理過程密切相關(guān)。FAN等[11]研究發(fā)現(xiàn)使用葡萄糖、胰島素及油酸孵育RAW264.7細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，進(jìn)一步研究表明TIP47 mRNA水平顯著增加，且存在協(xié)同效應(yīng)，但加入酪氨酸激酶(Src)抑制劑PP2和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY-20094后TIP47表達(dá)被下調(diào)。這一結(jié)果表明高糖、高胰島素、油酸會(huì)上調(diào)TIP47的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，且該作用受Src及PI3K通路調(diào)控。另有研究發(fā)現(xiàn)TLR9配體ODN1826與氧化型低密度脂蛋白共同孵育RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積增加，并能以時(shí)間和劑量依賴的方式刺激胞內(nèi)TIP47的表達(dá)，而且使用TLR9的特異性抑制劑CQ預(yù)處理細(xì)胞后，TIP47 mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少，且使用JNK和PI3K的抑制劑能夠阻斷ODN1826誘導(dǎo)的TIP47高表達(dá)，說明TIP47的表達(dá)受TLR9信號(hào)通路的調(diào)控[12]。以上結(jié)果表明，Src、PI3K和TLR9信號(hào)通路可通過調(diào)控TIP47表達(dá)調(diào)控脂滴形成。因此，TIP47可能是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。

綜上，TIP47與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和脂滴形成密切相關(guān)，從而參與巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞分化的病理過程，鑒于泡沫細(xì)胞形成是動(dòng)脈粥樣硬化的早期事件，故下調(diào)TIP47表達(dá)極有可能成為早期防治動(dòng)脈粥樣硬化的新策略。遺憾的是，查閱文獻(xiàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)于TIP47在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究均為體外細(xì)胞試驗(yàn)，未見到動(dòng)物和臨床研究，所以TIP47想要成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)，還有很長的路要走。

2.2肝臟疾病 酒精性肝病(ALD)是指因酒精導(dǎo)致肝臟脂肪變性到酒精性肝炎、肝硬化及肝癌的一系列廣泛疾病。肝臟脂肪變性是酒精攝入的早期病理改變，也是ALD最常見的病理形式。GU等[13]研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組小鼠相比，ALD模型小鼠肝臟總膽固醇含量上升約80%，同時(shí)TIP47 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高，該結(jié)果在體外研究即酒精處理的小鼠肝臟細(xì)胞AML12得到驗(yàn)證。通過shRNA技術(shù)下調(diào)AML12細(xì)胞中的TIP47表達(dá)，與對照組相比，沉默TIP47能夠抑制酒精所致AML12細(xì)胞增殖，尤其在高濃度酒精干預(yù)組中更為明顯，說明下調(diào)TIP47表達(dá)，能夠抑制酒精導(dǎo)致的肝臟脂肪變性。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)沉默TIP47組細(xì)胞給予酒精干預(yù)后，凋亡程度明顯高于對照組細(xì)胞，而且腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-1β等炎性因子的表達(dá)升高。以上結(jié)果表明TIP47在ALD的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但其結(jié)果仍存在一定爭議，有待進(jìn)一步研究闡明TIP47在ALD中的確切作用。

丙型肝炎病毒(HCV)是一種包膜RNA病毒，其中超過50%的慢性丙型肝炎的病理學(xué)基礎(chǔ)是肝臟脂肪變性，病毒通過HCV核心蛋白促進(jìn)脂肪變性和病毒顆粒組裝。核心蛋白為HCV病毒復(fù)制過程中的關(guān)鍵部分。有研究發(fā)現(xiàn)采用反義寡核苷酸降低TIP47的表達(dá)后，HCV組小鼠的肝臟切片可觀察到脂質(zhì)儲(chǔ)存減少[7]。PLOEN等[14]采用肝素層析法純化HCV復(fù)制細(xì)胞及HCV陰性細(xì)胞的上清，通過Western blot對洗脫成分分析后發(fā)現(xiàn)，TIP47與病毒粒子共純化，在HCV陰性細(xì)胞中未檢測到TIP47的表達(dá)。HCV顆粒可與TIP47特異性抗體共沉淀，而且含HCV復(fù)制細(xì)胞的上清液與TIP47特異性抗體共同孵育后顯著降低了HCV的傳染性。此外，HCV的非結(jié)構(gòu)成分NS5A和TIP47之間的相互作用也是HCV復(fù)制所必需的。NS5A由DⅠ、DⅡ及DⅢ 3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中DⅠ和DⅡ是基因復(fù)制的必備條件。通過酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)NS5A的DⅠ域可與TIP47相互作用，DⅡ域的缺失顯著削弱了NS5A與TIP47的相互作用[15]。在轉(zhuǎn)染突變NS5A16的HCV復(fù)制細(xì)胞中，與HCV的非結(jié)構(gòu)成分NS5A結(jié)合的TIP47減少，幾乎沒有菌落形成[16]。采用具有傳染性的HCV JHF1培養(yǎng)HuH7.5細(xì)胞后，過表達(dá)TIP47有利于HCV病毒的復(fù)制。反之，采用siRNA沉默TIP47的表達(dá)可致細(xì)胞內(nèi)HCV mRNA水平下降，完全沉默TIP47可以消除HCV病毒的復(fù)制，對TIP47水平降低細(xì)胞的上清液進(jìn)行傳染性分析發(fā)現(xiàn)病毒顆粒釋放量明顯減少[15]。EL-EKIABY等[17]發(fā)現(xiàn)在HCV感染患者的肝臟活組織病理檢查結(jié)果中，相較于健康組TIP47的表達(dá)上調(diào)。因此，TIP47可調(diào)控HCV的RNA復(fù)制，TIP47過表達(dá)能夠促進(jìn)HCV釋放，而TIP47沉默減少了傳染性顆粒的釋放，但HCV與TIP47的結(jié)合位點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制目前尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

對于非酒精性肝病(NAFLD)，已有研究證明喂食高脂肪食物4周后，小鼠肝臟中三酰甘油的含量較正常飲食小鼠增加了3倍，同時(shí)TIP47 mRNA及蛋白含量明顯增加。采用ASO下調(diào)肝臟TIP47表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量和高劑量TIP47 ASO可分別降低肝臟內(nèi)35%和52%的總膽固醇含量，并且通過TIP47 ASO治療顯著降低了脂肪生成酶Dgat2和Gpat的mRNA表達(dá)[18]。GARCIA MACIA等[19]研究發(fā)現(xiàn)采用OA孵育小鼠原代肝臟細(xì)胞后TIP47可與脂肪自噬相關(guān)蛋白Fip200、Atg16L相結(jié)合促進(jìn)LDs降解，且該作用受到雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)的調(diào)控，而采用RNA干擾技術(shù)敲除TIP47后結(jié)論與之相反，這一結(jié)論在小鼠體內(nèi)研究同樣得到了證實(shí)。TIP47也極有可能成為防治NAFLD的靶點(diǎn)，但是目前關(guān)于TIP47在NAFLD的體內(nèi)外研究較少，其結(jié)論有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上，ALD、病毒性肝炎和代謝性肝病等肝臟疾病的病理基礎(chǔ)均有肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，由于TIP47是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂代謝的關(guān)鍵分子，故與上述疾病關(guān)系十分密切。已有體內(nèi)和體外研究證實(shí)，下調(diào)TIP47表達(dá)能改善以上疾病，所以TIP47為靶分子防治肝臟疾病極富希望，但仍需要大規(guī)模臨床研究。

2.3糖尿病 在RAW264.7細(xì)胞中，生理性葡萄糖濃度(5.6和11.1 mmol/L)不能刺激TIP47 mRNA的表達(dá)，但高濃度葡萄糖(20和30 mmol/L)以及高濃度胰島素(50和500 nmol/L)可以顯著上調(diào)TIP47的表達(dá)[11]。有研究顯示采用ASO下調(diào)TIP47的表達(dá)，可在減輕小鼠肝臟脂肪變性的同時(shí)改善糖代謝，高劑量的TIP47 ASO減少了肝臟輸出葡萄糖，同時(shí)增加了脂肪組織及骨骼肌對葡萄糖的攝取[18]。LI等[20]采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定出在高脂飲食所建立的2型糖尿病大鼠模型中TIP47的表達(dá)上調(diào)。然而，也有不同聲音，ALGHAMDI等[21]通過觀察健康組、單純性肥胖組及肥胖合并2型糖尿病組受試人群血清發(fā)現(xiàn)，TIP47的濃度在單純性肥胖組最低，在健康組最高。此外，在所有受試者中，TIP47與葡萄糖、胰島素水平及體質(zhì)量指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

2.4PCOS PCOS是育齡婦女常見的內(nèi)分泌疾病，主要表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、無排卵性不孕癥和高雄激素血癥等，而適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動(dòng)可緩解PCOS的病情發(fā)展。COVINGTON等[22]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過16周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，PCOS患者脂肪組織中三酰甘油的含量有所下降，而TIP47是唯一基因表達(dá)譜有所增加的PAT家族蛋白，提示TIP47有助于增強(qiáng)PCOS患者脂肪組織中的脂肪分解作用。然而，目前關(guān)于TIP47與PCOS的研究較少，且深入機(jī)制不明，有待進(jìn)一步明晰。

2.5腫瘤 TIP47與宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺腺癌以及腎透明細(xì)胞癌密切相關(guān)。SZIGETI等[23]研究發(fā)現(xiàn)TIP47在正常宮頸上皮中為陰性，低級別異常增生中為中度陽性，而在高級別異常增生中為強(qiáng)陽性。采用宮頸癌根治手術(shù)后，TIP47水平開始下降，6周后可達(dá)正常水平;在宮頸癌復(fù)發(fā)患者中，TIP47水平顯著升高。與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中其他PAT家族蛋白的表達(dá)顯著降低，只有TIP47的表達(dá)有所增加，且TIP47的含量最高[24]。通過免疫組織化學(xué)染色檢測前列腺癌標(biāo)本中的TIP47蛋白水平發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中TIP47水平顯著高于正常組織，且與腫瘤分期、Gleason評分呈正相關(guān)[25]。LAMPROU等[26]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌小鼠模型中，TIP47的表達(dá)與腫瘤增殖指數(shù)MIB1呈正相關(guān)，但與T分期、Gleason評分及治療前血液中前列腺特異性抗原無顯著相關(guān)性。DU145、PC3及22Rv1細(xì)胞誘導(dǎo)形成前列腺癌細(xì)胞后，采用shRNA沉默TIP47的表達(dá)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組對放療更敏感，且需要的輻照參數(shù)有所減低，輻照后細(xì)胞的生長速度顯著降低。這一結(jié)果在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣得到驗(yàn)證，沉默TIP47后切除的腫瘤團(tuán)塊體積明顯減小，同時(shí)對放射后的腫瘤壞死區(qū)域進(jìn)行免疫分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞株的壞死率有所增高。王雪婷等[27]運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細(xì)胞中TIP47高度表達(dá)，表達(dá)量與生存率呈負(fù)相關(guān)；在遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，N分級與TIP47存在遞增關(guān)系。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)證實(shí)了在體外肺腺癌細(xì)胞A549中，敲除TIP47可以抑制肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲能力。在腎透明細(xì)胞癌組織中，TIP47表達(dá)升高，而且高表達(dá)提示患者預(yù)后較差。此外，在腎透明細(xì)胞癌患者中TIP47的表達(dá)具有性別差異性，男性患者表達(dá)水平遠(yuǎn)高于女性患者，但其性別差異的機(jī)制目前尚不明確[28]?？傊?，TIP47有可能成為一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物，對于評估癌癥嚴(yán)重程度、治療及預(yù)后具有重要意義。

2.6阿爾茲海默病(AD) AD是一種起病隱匿且發(fā)展緩慢的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上常表現(xiàn)為記憶功能障礙、認(rèn)知功能喪失和語言功能下降等，嚴(yán)重影響人們的生活與健康[29]。其發(fā)病機(jī)制可能與腦內(nèi)脂質(zhì)代謝失調(diào)有關(guān)。WEI[30]通過比較AD小鼠與對照組海馬體基因轉(zhuǎn)錄組譜發(fā)現(xiàn)，TIP47在AD小鼠的海馬體中表達(dá)上調(diào)。然而，CONTE等[31]研究表明人體大腦組織中有TIP47表達(dá)，且多表達(dá)于白質(zhì)。TIP47在年長者中的表達(dá)高于年輕受試者，但在神經(jīng)退行性疾病患者中TIP47的表達(dá)與正常組差異性不明顯，提示AD的發(fā)生和進(jìn)展與TIP47關(guān)系不大。然而，目前AD與TIP47相關(guān)研究較少，其結(jié)論有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.7艾滋病 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(HIV)攻擊機(jī)體免疫系統(tǒng)所引發(fā)的一類傳染性疾病。在HIV中包膜糖蛋白Gag和Env的組裝結(jié)合是HIV具有感染性的關(guān)鍵步驟，而TIP47是介導(dǎo)此過程的關(guān)鍵輔助因子[32]。LOPEZ-VERGS等[33]證實(shí)在Juekat T細(xì)胞中，沉默TIP47并不影響細(xì)胞內(nèi)Gag和Env蛋白質(zhì)的合成，但Gag與Env的免疫共沉淀有所減少。這一結(jié)論在原代巨噬細(xì)胞中同樣得到了證實(shí)。值得注意的是，TIP47的沉默可導(dǎo)致HIV-1的復(fù)制受損，且病毒粒子的感染性降低。而在Gag或Env抑制性突變體的細(xì)胞內(nèi)HIV-1病毒復(fù)制減少，且這些突變體已被證實(shí)會(huì)破壞TIP47在HIV復(fù)制過程中Gag和Env相互作用的連接器功能[34]。總之，TIP47在HIV-1感染過程中發(fā)揮著重要作用，極有可能成為抗艾滋病治療及疫苗研發(fā)的新靶點(diǎn)。

綜上所述，TIP47通過調(diào)控脂質(zhì)代謝參與多種疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、代謝性疾病、肝臟疾病、2型糖尿病、PCOS、腫瘤、AD及艾滋病。TIP47在腫瘤性疾病作用的研究中結(jié)論高度一致，對于評價(jià)腫瘤的嚴(yán)重程度、治療效果及預(yù)后有一定指導(dǎo)意義，很可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物。TIP47雖然在動(dòng)脈粥樣硬化、肝臟疾病、2型糖尿病、PCOS、AD及艾滋病作用的研究中有一定矛盾，但不可否認(rèn)的是TIP47在這些疾病中發(fā)揮重要作用，很有希望成為防治這些疾病的新靶點(diǎn)。