液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)云南省白扁豆中多種農(nóng)殘的質(zhì)量檢測(cè)分析*

鄧淙友，王閩予，羅文安，謝文凱，官永河，吳輝強(qiáng)，曲麗媛

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528244）

豆科植物白扁豆（Dolichos lablab L.,DLL），在中國(guó)和印度等亞非洲地區(qū)廣泛種植。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，白扁豆是經(jīng)典的藥食兩用的農(nóng)作物，其具有一定的健脾理氣，化濕消暑的作用，被用來(lái)治療胃腸道疾病。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，白扁豆提取物被驗(yàn)證具有抗高膽固醇血癥、中毒、胃腸道痙攣、霍亂、嘔吐、腹瀉的作用，也具有其抗糖尿病、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化[1-3]、降血脂、殺蟲(chóng)和抗石活性。市面上銷售的白扁豆以顆粒飽滿、均一，果實(shí)干燥，果皮顏色為白色者為佳，而結(jié)莢率與產(chǎn)量等息息相關(guān)；同時(shí)在種植過(guò)程中，白扁豆常會(huì)產(chǎn)生銹病、葉斑病、蚜蟲(chóng)等病蟲(chóng)害[4]。為保證產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，農(nóng)戶常常施以大量的農(nóng)藥或者肥料以保證白扁豆的產(chǎn)量，而這種農(nóng)藥過(guò)度使用的現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致大量的農(nóng)藥殘留。農(nóng)藥殘留是影響食品安全的最重要問(wèn)題之一，隨著我國(guó)大量農(nóng)藥的禁止，農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)逐漸降低。然而，仍然可以檢測(cè)到一些劇毒的農(nóng)藥。目前，應(yīng)用于農(nóng)殘檢測(cè)的主要方法有：氣相色譜法、高效液相色譜法、電位滴定法、化學(xué)法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法等，但上述方法靈敏度較低很難達(dá)到痕量物質(zhì)監(jiān)測(cè)。隨著GC-MS/MS和UPLC-MS/MS方法的廣泛應(yīng)用，高分辨率質(zhì)譜篩選方法的高靈敏度和可進(jìn)行特異性監(jiān)控的優(yōu)勢(shì)使得其成為未來(lái)農(nóng)藥監(jiān)測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。基于上，本論文采用固態(tài)萃取-UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，通過(guò)離子對(duì)監(jiān)測(cè)方法對(duì)藥典規(guī)定的33種習(xí)用農(nóng)藥建立了監(jiān)測(cè)體系，并對(duì)來(lái)自云南產(chǎn)地的15批白扁豆進(jìn)行多農(nóng)藥殘留檢測(cè)。結(jié)果表明，氧甲拌磷、氨氟靈和鼠立死為主要檢出農(nóng)藥均處于較低的風(fēng)險(xiǎn)水平。

1 材料與方法

1.1 樣品采集信息 共采集源于云南省的15批白扁豆樣品，并經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所進(jìn)行DNA鑒定為為豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟種子。

由圖5可知，不同pH發(fā)酵條件下得到的小麥醬油滋味有明顯差異。相比于自然pH發(fā)酵的醬油，pH 6.5條件下發(fā)酵的醬油鮮味更強(qiáng)，這與其含有更多的谷氨酸有關(guān)。二者在咸味上無(wú)明顯差異，但pH 6.5小麥醬油的苦味更強(qiáng)，自然發(fā)酵醬油則在甜味、酸味上更強(qiáng)。pH 6.5小麥醬油的苦味更加強(qiáng)烈，原因不明。

表1 15批次白扁豆樣品采集信息

1.2 主要儀器 島津LC40-8045三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津有限公司）；ME204E型萬(wàn)分之一分析天平、XP26型百萬(wàn)分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DC12H防腐型12位氮吹儀（ANPEL公司）；MTV-100多管漩渦混合儀（杭州奧盛儀器有限公司）；LXJ-ⅡC型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q超純水裝置（美國(guó)默克公司）

1.3 試劑PRiMEHLB固相萃取柱（美國(guó)Waters公司）；提取試劑包（迪馬科技有限公司，6g無(wú)水硫酸鎂、1.5g醋酸鈉）、乙腈（色譜純：賽默飛公司）、丙酮（分析純：廣州化學(xué)試劑廠）、正己烷（色譜純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、乙酸乙酯（分析純：西隴科學(xué)股份有限公司）、日本島津526種農(nóng)藥混標(biāo)套裝，貨號(hào)：380-03586-A（526種農(nóng)藥混標(biāo)套裝）。乙酸（分析純：西隴科學(xué)股份有限公司）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

1.4 溶劑配制 對(duì)照品貯備溶液的制備精密稱取適量的農(nóng)藥對(duì)照品，分別用乙腈配制成濃度為1g/L的對(duì)照品的溶液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證 精密量取上述各對(duì)照品貯備液適量，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，線性系數(shù)（r）均在99%以上，檢出限范圍在0.0002～0.03（mg/kg）之間，可滿足標(biāo)準(zhǔn)定量范圍0.005～0.1（mg/kg）的測(cè)定。以白扁豆藥材作為空白基質(zhì)，進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別取6份樣品進(jìn)行測(cè)定，加樣回收率均在70.3%～127.4%之間，RSD均在24.6%之內(nèi)，基本滿足白扁豆中中農(nóng)藥殘留分析的要求，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)排除明顯的眼底疾病對(duì)視網(wǎng)膜厚度的影響,術(shù)前CV較大,CAT較厚的白內(nèi)障患者在術(shù)后獲得更好的視力,而CST因其變異程度較高,誤差較大,本研究未發(fā)現(xiàn)其與白內(nèi)障術(shù)后最佳矯正視力的相關(guān)性。所有因素包括年齡都會(huì)影響黃斑視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維的厚度,即黃斑視網(wǎng)膜厚度。這會(huì)進(jìn)一步影響黃斑部視網(wǎng)膜功能,最終影響中心矯正視力。這些細(xì)微的變化往往不會(huì)被肉眼或其他檢查發(fā)現(xiàn)。因此SD-OCT術(shù)前對(duì)黃斑部視網(wǎng)膜厚度的測(cè)量,包括CV和CST的測(cè)量可以在術(shù)前對(duì)白內(nèi)障術(shù)后的最佳矯正視力有一定的預(yù)估作用,從而為選擇人工晶狀體提供可靠有力的依據(jù)。[4]OCT可以作為在黃斑區(qū)視網(wǎng)膜功能和術(shù)后視力的準(zhǔn)確評(píng)估的重要方法。

1.6 LC-MS/MS檢測(cè)條件

生態(tài)建設(shè)涉及多行業(yè)多部門,強(qiáng)化地方生態(tài)建設(shè)部門的組織體系,加強(qiáng)多部門的協(xié)調(diào)統(tǒng)一,形成合力,在統(tǒng)一規(guī)劃的基礎(chǔ)上，使各部門的生態(tài)建設(shè)投資按照“渠道不亂，用途不變，各投其資，各記其功”的原則，各司其職，各盡其責(zé)，集中投入，對(duì)水土流失進(jìn)行規(guī)?；C合治理。建議成立京津冀生態(tài)建設(shè)協(xié)調(diào)管理機(jī)構(gòu)。

1.4.3 基質(zhì)混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取6份空白基質(zhì)，每份3.0g，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4mL，臨用前用已經(jīng)配制成濃度分別為5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L與400μg/L的系列基質(zhì)混合對(duì)照品溶液。

1.6.2 質(zhì)譜條件 以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；離子源為電噴霧離子源，依據(jù)表3選擇正離子或負(fù)離子掃描模式。監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，各化合物保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)的參考值見(jiàn)表3。為提高檢測(cè)靈敏度，可根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測(cè)各農(nóng)藥。

1.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密移取上述各對(duì)照品貯備液適量，用含0.05%醋酸的乙腈分別制成濃度為l00μg/L和1000μg/L的混合對(duì)照品溶液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 梯度洗脫表

1.6.1 色譜條件[5]以十八烷基硅烷鍵合核殼硅膠為填充劑（柱長(zhǎng)15cm，內(nèi)徑為3mm，粒徑為2.7μm）；以0.05%甲酸溶液（含10mmol/L甲酸銨）為流動(dòng)相A，以0.05%甲酸的甲醇溶液（含10mmol/L甲酸銨）為流動(dòng)相B，按下表2進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為35℃，流速為0.4ml/min。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)藥質(zhì)譜條件的摸索 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，對(duì)522種農(nóng)藥進(jìn)行質(zhì)譜方法開(kāi)發(fā)，通過(guò)檢測(cè)定量和定性離子對(duì)進(jìn)行快速分析策略進(jìn)行樣品測(cè)定。定性離子對(duì)具有該農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特征性片段；定量離子對(duì)的響應(yīng)值和穩(wěn)定性均符合相應(yīng)要求。并同時(shí)根據(jù)該農(nóng)藥的最佳錐孔電壓和離子對(duì)的碰撞能，具體篩選出來(lái)離子對(duì)見(jiàn)表3，幾個(gè)代表性農(nóng)藥質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

1.5 供試品制備 取適量供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號(hào)篩）后，精密稱取約3.0g供試品與15mL的1%冰醋酸溶液混合均勻后，放置30min后，精密加入乙腈15mL與內(nèi)標(biāo)溶液100μL，快速渦旋振蕩5min，加入7.5g的無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉混合粉末（4:1），快速渦旋振蕩3min，冰水浴10min，離心（4000r/min）5min，棄去沉淀物。取上清液9mL，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無(wú)水硫酸鎂900mg，N-丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300mg，硅膠300mg，石墨化炭黑90mg）中，快速渦旋振蕩5min，離心（4000r/min）5min，精密吸取上清液5ml，氮吹至約0.4mL，加乙腈定容至lmL，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

表3 522種農(nóng)藥質(zhì)譜信息（節(jié)選）

圖1 代表性農(nóng)藥質(zhì)譜圖

1.4.1 內(nèi)標(biāo)貯備溶液的制備 精密稱取適量的氘代倍硫磷對(duì)照品，用乙腈配制成濃度為1000mg/L的內(nèi)標(biāo)貯備溶液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在高速公路橋梁施工項(xiàng)目中，伸縮縫的焊接過(guò)程非常關(guān)鍵，要從U形鋼筋加固開(kāi)始，有效減少預(yù)埋筋和異型鋼筋梁加固的不匹配問(wèn)題，確保錨桿和梁端預(yù)埋件焊接拉力和伸縮型鋼筋管理焊接整體壓力的一致性，從而維護(hù)管理項(xiàng)目的基本水平。需要注意的是，技術(shù)部門為了有效對(duì)后期牢固性和焊縫的飽滿性進(jìn)行約束，就要整合電焊固定效果，確保在一定程度上維護(hù)技術(shù)結(jié)構(gòu)。

體育課程內(nèi)容分為課內(nèi)和課外兩部分，對(duì)于課內(nèi)的內(nèi)容體育教師可以自行把控，但是對(duì)于課外的體育鍛煉就是處于愛(ài)莫能助的狀態(tài)。在運(yùn)動(dòng)手環(huán)的幫助下，課外鍛煉也變得可控。通過(guò)運(yùn)動(dòng)手環(huán)的GPS定位功能，能夠?qū)W(xué)生的課外鍛煉進(jìn)行全面情況了解，活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)范圍、活動(dòng)距離、心率情況等一概能夠掌握。

表4 農(nóng)藥含量測(cè)定方法學(xué)結(jié)果

續(xù)表

2.3 云南不同產(chǎn)地的白扁豆農(nóng)藥殘留樣品測(cè)定 分別將15批白扁豆的樣品進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析，具體結(jié)果如表所示。在白扁豆中，藥典規(guī)定的522農(nóng)藥中有18種被檢測(cè)出殘留，分別涵蓋了殺蟲(chóng)劑、除草劑、殺菌劑、有機(jī)殺螨劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和殺鼠劑[6]，其中：氧甲拌磷（殺蟲(chóng)劑）在各批次中均有檢出，氨氟靈（除草劑）在13批次的白扁豆中均有檢出，鼠立死（殺鼠劑）在其中9批次的白扁豆中均有檢出，檢出的農(nóng)藥殘留情況如表5所示。

表5 15批次白扁豆中農(nóng)藥殘留分布情況

2.4 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 農(nóng)藥殘留主要影響食品藥品的安全性，《中華人民共和國(guó)食品藥品安全法》規(guī)定食品的生物性、化學(xué)性和物理危害性進(jìn)行評(píng)估以作為其膳食安全性指標(biāo)。在我國(guó)，白扁豆種植廣泛，年產(chǎn)量和銷量逐步上升，2020年白扁豆年產(chǎn)達(dá)17.4萬(wàn)噸，云南省為白扁豆的中國(guó)主產(chǎn)地之一，也是主要出口產(chǎn)地之一，為準(zhǔn)確評(píng)估云南省白扁豆的膳食風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)市面上采集到的來(lái)自于云南的15批白扁豆樣品進(jìn)行測(cè)定，被主要檢測(cè)出的氨氟靈對(duì)人和牲畜低毒，甲拌磷屬于高毒農(nóng)藥。GB2763-2016中指出甲拌磷的每日允許攝入量（ADI值）為0.0007mg/kg b.w，按照最大殘留限值0.01mg/kg計(jì)算，一個(gè)體重60kg的健康成年人，每日攝取大于4.2Kg的白扁豆才可能存在安全風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)農(nóng)藥特征離子對(duì)建立了藥典規(guī)定的522種習(xí)用農(nóng)藥的檢測(cè)方法，該方法靈敏度高檢測(cè)迅速，可以滿足白扁豆中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)需求。同時(shí)應(yīng)用該方法檢測(cè)了來(lái)自來(lái)自云南省的15批白扁豆樣品的農(nóng)藥殘留，并針對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為白扁豆的食品藥品監(jiān)督管理體系的建立奠定了理論依據(jù)。