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    一種碘代二肽胺的體內(nèi)外評價

    2010-09-23 03:39:48何佳恒羅軍益王關(guān)全劉國平
    核技術(shù) 2010年1期
    關(guān)鍵詞:大白兔端粒放射性

    何佳恒 羅軍益 蹇 源 王關(guān)全 劉國平

    (中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所 綿陽 621900)

    放射性碘標(biāo)記的單克隆抗體(McAb)作為靶向藥物具有許多的優(yōu)點,但單克隆抗體作為診斷和治療癌癥的載體的多數(shù)研究,都建立在動物模型的基礎(chǔ)上,用于治療腫瘤病人的放射性碘標(biāo)記的 McAb很多是不成功的。主要原因有[1]:腫瘤對藥物的吸收率低;藥物全身活動性高;藥物在血液中清除慢;藥物在腫瘤內(nèi)部擴(kuò)散受到限制;McAb與腫瘤結(jié)合不均勻。

    解決放射性核素標(biāo)記單克隆抗體存在問題的途徑,是選擇與單克隆抗體相似、而分子量低的分子,當(dāng)與抗體作用后,能被腫瘤細(xì)胞中的一種特定的酶(端粒體酶)吸附在腫瘤表面。擬合成的放射性藥物具有以下性質(zhì):a) 對正常細(xì)胞具有低毒性;b) 腫瘤中細(xì)胞毒素的高專一吸收性;c) 增加腫瘤中細(xì)胞毒素的分布;d) 能夠?qū)崿F(xiàn)放射性藥物向高細(xì)胞毒素的高轉(zhuǎn)化率;e) 旁觀效應(yīng)。

    小分子肽類放射性藥物對受體有特異親和力,既滿足上述要求且具有以下一些優(yōu)點[2]:a) 肽是許多基本生物功能所必須的物質(zhì);b) 在許多情況下,小分子肽與受體的親和力比抗體和抗體片段更強(qiáng);c) 小分子肽易于合成,易于結(jié)構(gòu)修飾;d) 很少引起免疫反應(yīng);e) 快速的血清除可以提供高的靶/本底比(T/B),特別適于短半衰期核素。

    端粒體酶是能以自身 RNA為模板合成端粒重復(fù)序列的酶,主要存在于生殖細(xì)胞和癌細(xì)胞中,在90%癌細(xì)胞中呈陽性,而在其他細(xì)胞中呈陰性或沒有。含有這種酶的細(xì)胞可逃避進(jìn)行性端??s短,從而獲得無限制生長能力,于是形成腫瘤[3,4]。雖然在末梢淋巴細(xì)胞、腸管上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等具有自我增殖能力的細(xì)胞中,也存在陽性端粒體酶,但其量遠(yuǎn)不及腫瘤中的陽性端粒體酶的量。因此,可選擇一種能親和端粒體酶的化合物與之反應(yīng),使其失活,以達(dá)到治療腫瘤的目的。因此,首先要用能與端粒體酶親和力較強(qiáng)的化合物作為放射性標(biāo)記的載體,二肽就是這樣一種化合物,并且肽的性質(zhì)在很多方面與蛋白質(zhì)有相似之處[2]。此外,肽和蛋白質(zhì)的放射性標(biāo)記技術(shù)也較成熟;考慮到腫瘤中的相關(guān)特定酶,選擇適當(dāng)?shù)陌被岷铣呻囊彩潜容^重要的;另外應(yīng)當(dāng)增加一些輔助結(jié)構(gòu),使碘不處于整個目標(biāo)分子的中心位置,以便進(jìn)行碘標(biāo)記。酪氨酸和甘氨酸二肽被認(rèn)為具有比較好的親和效果。

    前期研究中,我們制備了 p-Boc-Trp-Trp-NH(CH2)6NH-PO(ONH4)-O-Ph131I[5],本工作對它的穩(wěn)定性、親脂性、急性毒性以及在正常小鼠體內(nèi)的分布做了較詳細(xì)的研究,同時成功建立了VX2肝癌單發(fā)腫瘤動物模型,考察了配合物在模型腫瘤部位的分布情況,以探索它作為放射性藥物的可能性。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器

    131I,本所提供;PBS緩沖液,DMEM培養(yǎng)液,10%水合氯醛,安定注射液等生物、化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。實驗所需用水均為二次蒸餾水。

    FJ-2021型 γ放射免疫計數(shù)器(國營 262廠);CAPINTEC CRC-15R放射性活度測量儀(Denver Instrument Co.);Helix Apex雙探頭SPECT儀(以色列Elscint Co.);二氧化碳孵化箱,Siemens Sensation 16 CT機(jī),HDI 5000超聲儀,Siemens Axiom Artis FA型 DSA(功率 100 kW),MADRAD Mark V Provix 型高壓注射器均由華西醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供。

    新西蘭大白兔(一級,體重 3–4 kg,雄性);昆明種小白鼠(一級,體重18±2 g,雌雄各半)均由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心動物實驗中心提供;VX2種兔購于華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院,VX2肝癌單發(fā)腫瘤動物模型:自行建立。

    1.2 配體的合成

    通過 7步有機(jī)反應(yīng)合成了二肽分子p-Boc-Trp-Trp-NH(CH2)6NH-PO(ONH4)-O-PhI (化合物7)[6]。合成路線如圖1所示:

    圖1 配體7合成路線圖Fig.1 Synthesis of compound 7

    1.3 配合物的制備

    采用封管法進(jìn)行了碘的標(biāo)記。準(zhǔn)確稱取 8 mg Iodogen溶于8 mL二氯甲烷中,從中取出8 μL涂于 1.5 mL塑料離心管底部,自然風(fēng)干,可見管底Iodogen鋪成一層薄薄的白色沉淀,以此作為反應(yīng)管。

    在反應(yīng)器中,投入 1 mg p-Boc-Trp-Trp-NH(CH2)6NH-PO(ONH4)-O-PhI和5 mg抗壞血酸,加入 5 μL含有 2.5 μg的乙酸銅溶液和 50 μL的Na131I,置于沸水浴中反應(yīng) 15 min,冷卻之后用KHCO3溶液調(diào)pH值到5.5–6.5。再用二氯甲烷萃取,直到水相的放射性不再改變,測定有機(jī)相和水相的放射性,從而計算出其標(biāo)記率約為85%。

    將有機(jī)相中的有機(jī)溶劑蒸干,用生理鹽水溶解測定其放射性做動物實驗。

    1.4 配合物穩(wěn)定性、親脂性的考察

    將標(biāo)記好的配合物放置一定時間后,用生理鹽水溶解,然后用二氯甲烷溶液萃取,再用等體積的生理鹽水進(jìn)行反萃。如此反復(fù)至少3次后,最后比較有機(jī)相和無機(jī)相中放射性計數(shù)的比率。根據(jù)放射性碘的脫落情況以考察配合物的穩(wěn)定性,配合物的脫碘率 K=Cw/Co,Cw為配合物在水相的濃度;Co為配合物在有機(jī)相中的濃度。

    將標(biāo)記好的配合物用生理鹽水緩沖液(pH≈7)稀釋至3 mL,再加入3 mL正辛醇,振蕩離心后,取2 mL下層的水相至測量管中放置測量計數(shù)。在有機(jī)相中再加入3 mL生理鹽水振蕩離心,棄去水相,再在有機(jī)相中加入3 mL生理鹽水振蕩離心,如此反復(fù)不少于5次,最后取2 mL有機(jī)相測量計數(shù)。分配系數(shù)[6]Kow=Co/Cw=No/Nw,Co為配合物在正辛醇相中的濃度,Cw為配合物在水相的濃度,No為正辛醇相中放射性總計數(shù),Nw為水相中放射性總計數(shù)。

    1.5 配合物對外周血象、肝腎功能影響的考察

    由于經(jīng)典LD50(半致死量)測定耗用動物多,無法對每只動物作仔細(xì)檢查,實際上藥物單次劑量急性中毒,動物多死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)功能障礙,并不能很好地顯示出各自的毒性作用特征。再者,急速死亡,各種器質(zhì)性變化尚未及發(fā)展,不能顯示出靶器官的病變:如鹵代甲烷對小鼠的急性毒性試驗,CH3I-碘代甲烷對肝臟毒性很大,比CCl4和 CBr4均大,但動物死于麻醉和急性循環(huán)衰竭,而肝臟損傷卻表現(xiàn)不出來。相反毒性較小,致死較慢的CCl4和CBr4對肝臟毒性表現(xiàn)明顯。所以藥物對肝臟功能的影響是對藥物進(jìn)行評價的一個重要指標(biāo)[7],本工作對配合物對實驗動物的肝臟功能、外周血象的影響都作了考察。

    取6只大白兔,隨機(jī)分成兩組,每組3只,一組作為對照組,另一組體內(nèi)種入肝癌細(xì)胞株使兔子患有肝癌作為配合物實驗組。實驗組通過耳緣靜脈注射 1 mL相同劑量(~3.56×107Bq)的標(biāo)記物[p-Boc-Trp-Trp-NH(CH2)6NH-PO(ONH4)-O-Ph131I ]。24 h后直接將兩組兔子進(jìn)行活體心臟取血(注意:由于兔血極易凝固,動作要非常迅速,以免影響實驗結(jié)果),對血液標(biāo)本進(jìn)行檢驗,考察配合物對動物外周血象、肝腎功能的影響。

    1.6 配合物在正常小鼠體內(nèi)的分布

    取25只小白鼠,隨機(jī)分成五組,每組5只。每組通過尾靜脈注射0.1 mL相同劑量(~3.56×106Bq)的標(biāo)記物。于不同時間將小鼠斷頭處死,取感興趣臟器稱量,測其放射性,計算每克組織攝入放射性占總注入劑量的百分比(%ID/g)。

    1.7 配合物在腫瘤大白兔體內(nèi)的分布

    1.7.1 兔VX2單發(fā)肝癌模型建立

    種兔麻醉。腹腔注射10%水合氯醛 2.5 mL/kg,安定,5 mg/kg,約10 min動物麻醉。

    備皮。用粗剪刀剪短種兔大腿內(nèi)側(cè)兔毛,8%Na2S涂搽,3 min后用溫水清洗,大腿內(nèi)側(cè)皮膚清洗干凈。

    分離腫瘤。消毒、切開皮膚,分離腫瘤組織,完整剝離腫瘤。切取腫瘤周邊生長旺盛組織,置于PBS緩沖液中,用無菌眼科解剖鑷仔細(xì)剝除血管、腫瘤壞死組織,用PBS緩沖液沖洗,將干凈腫瘤組織置于 DMEM 培養(yǎng)液中,用無菌眼科剪將腫瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊,用2 mL勻漿器將組織勻漿。以上操作在超凈工作臺完成,以保證無菌。

    腫瘤傳代。將細(xì)胞勻漿離心,吸取細(xì)胞并用臺盼藍(lán)染色,觀察細(xì)胞存活情況。用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),DMEM 調(diào)整細(xì)胞濃度,將細(xì)胞濃度調(diào)整為107/mL。吸取細(xì)胞懸液0.2 mL,將細(xì)胞懸液注入兔大腿內(nèi)側(cè)肌肉較厚實處,完成接種。飼養(yǎng)接種后的新西蘭大白兔兩周,腫瘤生長至直徑2–3 cm可供模型制作使用。

    單發(fā)肝腫瘤模型制作。新西蘭大白兔手術(shù)前8 h開始禁食。肌注青霉素10萬U、慶大霉素5 mg。麻醉(同種兔麻醉),腹部備皮(同上)、消毒、切開皮膚、暴露肝臟。將肝臟左外葉提出體外,用眼科剪在左外葉剪一約1 cm的小口,用解剖鑷頭插入肝臟約1 cm深,造成一個隧道,用明膠海綿適當(dāng)止血,選取一塊4–5 mm腫瘤組織塊用解剖鑷小心放入隧道內(nèi),用明膠海綿填堵肝臟裂口。將肝臟放入腹腔,縫皮關(guān)腹。肌注青霉素10萬U、慶大霉素5 mg。觀察動物蘇醒后送動物室飼養(yǎng)。

    腫瘤生長情況影像學(xué)觀察。腫瘤接種于肝臟后飼養(yǎng)兩周后開始行超聲檢查,如超聲不能觀察到腫瘤則行CT、MRI檢查,CT、MRI掃描行4期掃描(平掃、動脈期、門脈期、實質(zhì)期掃描),待腫瘤生長至直徑2–3 cm可供使用。

    1.7.2 分布實驗

    取15只成功建模的大白兔隨機(jī)分成五組,每組3只。每組通過耳緣靜脈注射 1 mL相同劑量(~3.56×107Bq)的標(biāo)記物。于不同時間將大白兔處死,取感興趣臟器稱量,測其放射性,計算每克組織攝入放射性占總注入劑量的百分比(%ID/g)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 配合物穩(wěn)定性和親脂性考察

    穩(wěn)定性研究表明配合物的體外穩(wěn)定性較好,扣除131I自身衰變率,放置兩天后的脫碘率為10.7%,放置三天后脫碘率為12.5%。脫碘率較文獻(xiàn)[8]報道的其它碘標(biāo)記肽化合物有所降低。

    親脂性的考察結(jié)果為 Kow=738214/20932≈35.27。

    脂水分配系數(shù)與生物體內(nèi)肝臟對該配合物的攝取存在正相關(guān)[9,10]。Kow≈35.27表明配合物是親脂性的,這樣它不易在骨頭上聚集,而傾向于在脂肪組織上濃集,比如說肝、腸等器官。這與我們后面的動物體內(nèi)分布實驗結(jié)果一致。

    表1 放置48–72 h后的穩(wěn)定性Table 1 Stability of p-Boc-Trp-Trp-NH(CH2)6NH-PO(ONH4)-O-Ph131I after 48–72 h placement

    2.2 配合物對大白兔的外周血象、肝腎功能的影響(表2)

    通過直接心臟取血的方式進(jìn)行的配合物對大白兔肝腎功能、外周血象的影響考察結(jié)果表明,配合物對大白兔的外周血象和肝腎功能均無影響,各項指標(biāo)都在正常范圍內(nèi),說明配合物的毒性不大。

    表2 配合物對肝腎功能的影響和治療前后外周血象指標(biāo)Table 2 Effect of the compound on function of liver and kidney and on peripheral hemogram

    2.3 配合物在動物體內(nèi)的分布

    單塊組織包埋法直接接種是 VX2兔肝癌單發(fā)腫瘤造模最為理想的方法,具有簡便、成模率高、腫瘤大小及成模時間易于估計的特點。其總體死亡率與正常兔的死亡無差別。3周后腫瘤直徑為2.6 cm±0.4 cm,單發(fā)成模率為86%。

    圖2是腫瘤觀察情況,圖A顯示在10×20倍光鏡下VX2腫瘤細(xì)胞呈巢狀,圖B中活體解剖顯示肝左葉有直徑約2.5 cm的腫瘤,腫瘤呈魚肉樣,表面有較多血管分布。根據(jù)觀察結(jié)果,腫瘤的模型建立是成功的。

    圖2 腫瘤觀察圖片F(xiàn)ig.2 Photograph of the tumour.

    由圖3的配合物在正常小鼠體內(nèi)的分布情況可以看到配合物在血中和腎臟中清除速度較快,這提示配合物的血清除較快,主要經(jīng)過腎臟排除體外。在肝臟和肺部組織滯留相對較多,但在24 h后分別下降到 0.372%和 0.302%,不會對正常肝臟和肺造成輻射損傷。在其它組織中攝取都偏低。

    圖4表明配合物在大白兔體內(nèi)主要通過血液和腎臟代謝,與正常小鼠體內(nèi)的代謝方式一致。除了代謝器官,配合物主要還是濃集于偏脂肪組織,在我們希望的目標(biāo)靶向組織—腫瘤中濃集率較高,在48 h時雖然只有3%左右的攝取率,但是相對于所有臟器來說,是最高攝取值,可以做進(jìn)一步的實驗,降低動物體內(nèi)的脫碘率,提高標(biāo)記物的體內(nèi)穩(wěn)定性,延長標(biāo)記物在腫瘤組織的滯留時間,以獲得更好的治療效果。

    圖3 配合物在正常小鼠體內(nèi)的分布Fig.3 Tissue distribution of compound in normal mice (n=5).

    圖4 配合物在腫瘤大白兔主要臟器的分布Fig.4 Tissue distribution of compound in tumor rabbit (n=5).

    3 結(jié)論

    對 p-Boc-Trp-Trp-NH(CH2)6NH-PO(ONH4)-OPh131I的生物性質(zhì)作了詳細(xì)研究。配合物比較穩(wěn)定且毒性較低。成功建立了VX2肝癌單發(fā)腫瘤動物模型,配合物在動物模型以及在正常小鼠的體內(nèi)分布趨勢比較一致,配合物比較傾向于濃集于脂肪組織,在腫瘤組織中的滯留量相對較高,表現(xiàn)出作為腫瘤治療藥物的潛在可能性,但清除較快,可以作進(jìn)一步的研究,提高標(biāo)記物的體內(nèi)穩(wěn)定性,以延長配合物在靶向組織中的濃集時間。

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