α-芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突變體合成及其靶點(diǎn)活性

李浩楠，楊奕帥，長(zhǎng)孫東亭，朱曉鵬，羅素蘭

（1.上海兒童醫(yī)學(xué)中心 三亞市婦女兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，海南 三亞 572000;2.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228）

芋螺（Cone snail）是一種肉食性海洋軟體動(dòng)物[1]，其分泌的芋螺毒液包含許多不同化合物的混合物，包括小分子、肽和酶。其中，含有很多種不同成分的神經(jīng)活性毒素肽-芋螺毒素（Conotoxin,CTx）具有廣泛的多樣性，這些具有高活性和靶點(diǎn)選擇性的神經(jīng)小肽大多由6～50個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，富含二硫鍵，以特定的離子通道和受體為靶標(biāo)，作為藥理學(xué)工具和探針，具有較好的開發(fā)前景[2-4]。α-芋螺毒素 (α-conotoxin,α-CTx) 是目前研究最廣泛和深入的CTxs。α-CTx分子質(zhì)量較小，由12～20個(gè)氨基酸殘基連接構(gòu)成，是各種乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）亞型的選擇性拮抗劑[5-6]。α-CTx一般含有4個(gè)半胱氨酸（Cys），根據(jù)二硫鍵的不同連接方式，可組成3種異構(gòu)體，其中，大部分α-CTxs的活性形式為球型。另外，根據(jù)α-CTx半胱氨酸間氨基酸數(shù)量的不同將α-CTx分為：α-3/5、α-4/4、α-4/6、α-4/7等多種亞家族。α-CTx不僅作為分子探針，用以鑒別不同亞型的nAChR，在治療與nAChR相關(guān)疾病時(shí)有著至關(guān)重要的作用[7-9]，并且在成癮、鎮(zhèn)痛等神經(jīng)生理、藥理研究方面也扮演重要角色[10]。

羅素蘭研究團(tuán)隊(duì)從疣縞芋螺中分離得到了一種α-4/7型CTx LvIA，它由15個(gè)氨基酸殘基組成，能夠作用于nAChRs，對(duì)α3β2 nAChR具有較好的的活性（IC50為8.7 nmol·L-1），但是LvIA對(duì)α6/α3β2β3，α3β4和α6/α3β4 3種nAChRs亞型保持一定的高親和力[11-13]。為了提高LvIA的選擇專一性，前期實(shí)驗(yàn)室基于LvIA進(jìn)行了設(shè)計(jì)和改造，獲得了對(duì)應(yīng)的共晶結(jié)構(gòu)，同時(shí)也利用受體突變技術(shù)解析了它與α3β2 nAChR相互作用的分子機(jī)制[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)?1位天冬氨酸（Asp,D）突變成丙氨酸（Ala,A）后對(duì)α3β2 nAChR的活性保持不變，共晶實(shí)驗(yàn)表明，第11位氨基酸影響著LvIA與α3β2 nAChR的結(jié)合作用[16-19]。第11位是否是LvIA的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，今后能否基于該位點(diǎn)對(duì)LvIA進(jìn)行改造，有待深入研究。

本研究基于LvIA前期研究發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵氨基酸信息[20-22]，主要是針對(duì)第11位氨基酸，對(duì)LvIA進(jìn)行進(jìn)一步設(shè)計(jì)改造，分別用精氨酸（Arg,R）和組氨酸（His,H）對(duì)Asp進(jìn)行取代，設(shè)計(jì)了2種新型突變體，考察第11位氨基酸電性和側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)LvIA活性的影響，旨在為L(zhǎng)vIA的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器α-CTx LvIA及其所有突變體線性肽粗品（吉爾生化上海有限公司），色譜級(jí)三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），色譜級(jí)乙腈(Acetonitrile,ACN)（ThermoFisher Scientific公司），N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碘(I2)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、甲酸等分析純?cè)噭◤V州化學(xué)試劑廠），質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)，膠原酶(Collagenase)、乙酰膽堿(ACh)、阿托品(Atropine)（Sigma公司），DNA純化試劑盒（TaKaRa大連有限公司），體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fisher Scientific公司），膠原蛋白酶A（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），圓二色譜檢測(cè)涉及的試劑由華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心提供；Waters 2695制備型高效液相色譜儀，Waters e2695分析型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），島津電噴霧電離質(zhì)譜(Electrospray ionization-mass spectrometer，ESIMS)（美國(guó)格雷斯公司），雙電極電壓鉗系統(tǒng)Axon 900A和Digidata 1550B數(shù)模轉(zhuǎn)換器（美國(guó)Molecular Device公司），ELGA超純水系統(tǒng)（英國(guó)ELGA公司）；分光光度計(jì)(Smart SpecTM plus)（美國(guó)Bio-RAD公司），AlphaImager HP凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple公司）；實(shí)驗(yàn)用非洲爪蟾（美國(guó)Nasco公司）。

1.2 [D11R]LvIA和[D11H]LvIA的合成和氧化折疊設(shè)計(jì)2種LvIA第11位突變體序列送至上海吉爾生化有限公司，使用固相合成法（Fmoc法）進(jìn)行合成（純度為80%～85%）。然后使用制備型RP-HPLC對(duì)合成好的線性肽進(jìn)行純化，使產(chǎn)物的純度達(dá)到95%以上。純化得到的線形肽采用兩步法氧化的方法進(jìn)行氧化折疊，保證形成I-III,IIIV的二硫鍵連接結(jié)構(gòu)。第1步氧化，將純化后的線性肽凍干粉溶于B60(60%乙腈)，緩慢地滴加到鐵氰化鉀反應(yīng)液(K3[Fe(CN)6]10 mmol·L-1,Tris 0.1 mol·L-1,pH7.5)中，室溫充分反應(yīng)45 min，促使其形成第1對(duì)二硫鍵(Cys-2和Cys-8)，線性肽濃度不高于50 g·L-1。利用RP-HPLC純化反應(yīng)后得到單環(huán)產(chǎn)物。將第1步純化后的多肽進(jìn)行第2步氧化。在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，逐滴加入到碘(I2)反應(yīng)液中（7.5 mmol·L-1I2溶液；V水∶VTFA∶VACN=73∶3∶24），反應(yīng)時(shí)間8～12 min,促使其 連接Cys-3和Cys-16形成第2對(duì)二硫鍵，反應(yīng)完畢滴加VC飽和溶液至溶液顏色從紫黑色變成無色，終止I2氧化反應(yīng)，至此，得到包含2對(duì)二硫鍵的LvIA突變體的最終產(chǎn)物。使用RP-HPLC對(duì)氧化折疊產(chǎn)物進(jìn)行純化（溶劑A為0.075%TFA水溶液，溶劑 B為0.05% TFA、90% ACN,梯度洗脫條件：5%～35%），使其純度大于95%，純化得到的氧化折疊產(chǎn)物利用ESI-MS鑒定其分子質(zhì)量，確定LvIA及其突變體是否形成正確的二硫鍵連接方式。凍干保存，用于后續(xù)電生理活性實(shí)驗(yàn)。

1.3 乙酰膽堿受體模型的建立從載入了含（rat，r）α3、β2 2種亞基基因質(zhì)粒的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中提質(zhì)粒，將獲取的質(zhì)粒酶切成線性質(zhì)粒，然后純化此線性化DNA模板，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)純度，并使用Nanodrop測(cè)定濃度。使用T7 RNA polymerase體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將DNA模板轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的RNA使用純化試劑盒進(jìn)行純化，純化的產(chǎn)物cRNA，再使用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并使用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行純度鑒定。選取1只腹部沒有斑點(diǎn)的非洲爪蟾，冰凍1 h麻醉，使用手術(shù)刀將爪蟾的腹部下側(cè)切開，用剪刀將肌肉剪開，取2片蛙卵置于OR-2溶液中，再用胰蛋白酶酶解成單個(gè)蛙卵，至大部分卵母細(xì)胞表面無膜，挑選其中個(gè)體均勻，無血絲，黑白分明的爪蟾卵母細(xì)胞。按照1∶1的比例混合成所需的亞型，保證每個(gè)細(xì)胞的注射量為50.6 nL，注射后的蛙卵置于含抗生素的ND96培養(yǎng)液中（96 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1KCl，1.8 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1HEPES，pH7.1～7.7；抗生素：青霉素、10 mg·L-1鏈霉素和100 mg·L-1慶大霉素），17 ℃培養(yǎng)2～3 d，表達(dá)α3β2受體亞型。

1.4 LvIA突變體活性的檢測(cè)將表達(dá)了特定受體的卵母細(xì)胞放置于細(xì)胞槽內(nèi)，將雙電極電壓鉗裝好holder，再把灌注約1/23 mol·L-1KCl溶液的電極針安裝到holder上，將電極針浸入液面，調(diào)零，使其鉗制電壓為70 V,基準(zhǔn)電流低于100 nA，將電壓膜片鉗打開到ON的模式，鉗住細(xì)胞，調(diào)節(jié)程序，每個(gè)Sweep（1 min）的第2秒的時(shí)候灌流系統(tǒng)給予蛙卵細(xì)胞100 μmol·L-1濃度的ACh刺激，其余時(shí)刻持續(xù)使用ND96溶液灌流。使用雙電極電壓鉗系統(tǒng)檢測(cè)和記錄蛙卵細(xì)胞的電流，待電流大小穩(wěn)定以后，逐次加入經(jīng)過梯度稀釋的待測(cè)定活性的LvIA突變體，孵育時(shí)間為5 min，再一次開啟程序，比較蛙卵細(xì)胞加藥前后2次產(chǎn)生電流的的大小差異，計(jì)算反應(yīng)率（Response）。通過非線性擬合方程：Response=100/[1+([toxin]/IC50)nH]×100%進(jìn)行擬合分析，獲取藥物作用的劑量反應(yīng)曲線（IC50值），其中，nH代表Hill系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LvIA突變體合成純化線性肽，使其純度高于95%，用于后續(xù)的氧化折疊反應(yīng)，連接2對(duì)二硫鍵，將所得產(chǎn)物通過HPLC和MS鑒定，具體結(jié)果見圖1-A、B。[D11H]LvIA在乙腈濃度23%時(shí)洗脫，洗脫時(shí)間為14.8 min；而[D11R]LvIA在乙腈濃度為25%時(shí)洗脫，洗脫時(shí)間是14.9 min。通過質(zhì)譜確定了[D11H]LvIA和[D11R]LvIA的相對(duì)分子質(zhì)量，分別為1702.95和1721.99Du，與理論值一致，且均比其線性肽的相對(duì)分子量少了4 Du，說明成功連接了2對(duì)二硫鍵并且末端酰胺化，見圖1-C、圖1-D。

圖1 LvIA突變體的HPLC和MS結(jié)果

2.2 乙酰膽堿受體模型建立提取包含鼠源α3、β2這2種亞基的質(zhì)粒，使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度檢測(cè)。從圖2-A可知，質(zhì)粒條帶清晰，未發(fā)生拖尾情況，超螺旋結(jié)構(gòu)大小在2500 bp左右，符合理論值大小。從圖2-B可知，條帶清晰可見，無彌散現(xiàn)象，超螺旋結(jié)構(gòu)的大小在5000～7500 bp范圍內(nèi)。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定線性質(zhì)粒的質(zhì)量濃度，質(zhì)量濃度皆大于0.2 g·L-1，可以保證后續(xù)試驗(yàn)的濃度要求。制備α3、β2這2種亞基的cRNA，所得RNA的凝膠電泳結(jié)果如圖2-C，圖中有1條明顯的亮帶，大小在750～1 000 bp之間，符合理論值，α3亞基的濃度為0.4 g·L-1，β2亞基的濃度為0.49 g·L-1。將2種亞基按照1∶1的比例混合，顯微注射到酶解好的爪蟾卵母細(xì)胞中(圖2-D)，表達(dá)2～3 d，使用激動(dòng)劑ACh刺激，可以在細(xì)胞膜上檢測(cè)到內(nèi)向電流,電流大小在200～2000 nA范圍內(nèi)，如圖2-E。

圖2 α3β2 nAChR模型的建立

2.3 LvIA突變體活性檢測(cè)分別將LvIA和2種11位的LvIA突變體在表達(dá)α3β2 nAChR的非洲爪蟾卵母細(xì)胞上進(jìn)行電生理活性檢測(cè)。在終濃度為10 μmol·L-1的孵育條件下，LvIA、 [D11R]LvIA和[D11H]LvIA對(duì)α3β2nAChR的 阻 斷率分別為(95.8±2.8)%（n=6）、(9.8±2.5)%（n=7）和(12.4±3.1)%（n=5）（圖3），與野生型LvIA相比，2種11位突變體對(duì)α3β2 nAChR活性幾乎完全喪失。

圖3 LvIA及突變體對(duì)于α3β2 nAChR的電流軌跡圖

為了進(jìn)一步確定2種LvIA 的11位突變體對(duì)于α3β2 nAChR的阻斷活性，筆者做了劑量反應(yīng)曲線(圖4)，分別測(cè)定了[D11R]LvIA和[D11H]LvIA對(duì)α3β2 nAChR的IC50值，2種突變體對(duì)于α3β2 nAChR的IC50值分別為8976 nmol·L-1和6390 nmol·L-1（表1），活性與比本體的活性相比，分別降低了574.38%和408.62%。證明當(dāng)?shù)?1位的Asp變化后，LvIA的活性大大降低。

圖4 LvIA及其突變體對(duì)于α3β2 nAChR的濃度反應(yīng)曲線

表1 LvIA 及11位突變體在α3β2 nAChR上的IC50

3 討 論

α3β2 nAChR 是一種十分重要的受體，與疼痛、成癮等生理學(xué)作用密切相關(guān)。LvIA是一種十分重要的α-CTx，作用于α3β2 nAChR，是從疣縞芋螺中發(fā)現(xiàn)并且克隆得到的，對(duì)LvIA構(gòu)效關(guān)系的研究將有益于獲得靶向α3β2 nAChR的相關(guān)分子探針，有助于對(duì)與α3β2 nAChR相關(guān)的藥理學(xué)研究。目前，發(fā)現(xiàn)能夠作用于α3β2 nAChR的α-CTx的有很多，其中，GIC、MII、OmIA和PeIA等具有較強(qiáng)的靶向作用，針對(duì)這些芋螺毒素的突變改造對(duì)于本實(shí)驗(yàn)具有借鑒作用[23-24]。如：在對(duì)α-CTx MII的研究中發(fā)現(xiàn)，MII第11位的谷氨酸（Glu）與α3-β2亞基上帶正電荷的殘基如：(+) K153和(-)K163形成相互作用，促進(jìn)MII與α3β2 nAChR的結(jié)合，11位對(duì)保證MII的活性至關(guān)重要[25]。利用共結(jié)晶技術(shù)對(duì)α-CTx GIC的研究發(fā)現(xiàn)其第7位的Ala、11位的Asn和12位的Asn對(duì)于GIC與受體的結(jié)合具有十分重要的作用，特別是11位的Asn可以通過形成氫鍵與Ac-AChBP相互作用，如果改變11位的氨基酸，會(huì)影響GIC與受體的結(jié)合，11位氨基酸對(duì)于α-4/7型CTxs與受體的結(jié)合起到至關(guān)重要的作用[26]；在PeIA的相關(guān)研究中，也發(fā)現(xiàn)11位氨基酸分別突變?yōu)锳rg和Lys之后，對(duì)α3β2 nAChRs的IC50分別變?yōu)?0.9μmol·L-1和45.4 μmol·L-1，基本喪失了活性[27]，上述結(jié)果都證明了11位氨基酸對(duì)于α-4/7型CTx活性影響顯著。

根據(jù)前期研究，發(fā)現(xiàn)β2亞基上的3個(gè)位點(diǎn)：T59K、V111I、F119Q對(duì)α-CTx LvIA的敏感性有顯著影響，受體突變加電生理結(jié)果表明受體上59、111和119的3個(gè)位置，是與LvIA結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。羅素蘭研究團(tuán)隊(duì)對(duì)LvIA前期研究中，獲得了LvIA與Ac-AChBP的共晶結(jié)構(gòu)。借助共晶結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)α3亞基中的Lys-155可以與LvIA中帶負(fù)電荷的Asp-11形成鹽橋，增加相互作用，說明第11位的Asp對(duì)于LvIA與α3β2 nAChRs的相互作用影響較大，但是將第11位突變成Ala之后活性保持不變，所以本研究希望在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入探究第11位如何影響LvIA對(duì)于α3β2 nAChRs的活性，針對(duì)11位所設(shè)計(jì)的兩個(gè)突變體[D11R]LvIA和[D11H]LvIA，當(dāng)?shù)?1位氨基酸突變成堿性氨基酸Arg和His之后，2個(gè)突變體的活性都極大的降低。結(jié)合前期共晶結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，當(dāng)11位突變?yōu)閴A性氨基酸后，與α3亞基中的Lys-155都為堿性氨基酸，同性相斥，結(jié)合力減弱，造成了LvIA活性的降低。該研究探究了11位的重要作用，為今后基于LvIA的分子設(shè)計(jì)和改造提供了基礎(chǔ)。