發(fā)酵法巖藻多糖的硫酸化及其抗氧化活性研究①

謝愛(ài)卿， 楊海川， 徐興然， 鄒祥

1.西南大學(xué) 藥學(xué)院， 重慶 400715； 2.重慶藥友制藥有限責(zé)任公司， 重慶 401121

巖藻多糖(fucoidan)， 也被稱為褐藻糖膠， 是一種由巖藻糖硫酸酯構(gòu)成的水溶性多糖， 具有廣泛的生物活性， 如抗氧化、 抗病毒及抑制幽門螺旋桿菌等[1]． 巖藻多糖在褐藻中的含量低(大約0.1%)， 存在提取工藝復(fù)雜、 提取率低等限制， 從而影響對(duì)巖藻多糖生理活性的研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)[2]． 微生物來(lái)源的巖藻多糖主要是指含巖藻糖胞外多糖(fucose-containing exopolysaccharide， FucoPol)， 產(chǎn)FucoPol菌株主要來(lái)源于腸桿菌屬和芽孢桿菌屬[3]． FucoPol的分子結(jié)構(gòu)中不含硫酸基， 導(dǎo)致其生物活性不足[4]， 但其優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)基因工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化等手段來(lái)提升產(chǎn)量， 實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).

多糖硫酸化修飾是一種通過(guò)化學(xué)法在多糖的分子鏈上接枝硫酸基團(tuán)的方法． 硫酸化修飾可以增強(qiáng)原多糖的某些活性或產(chǎn)生新的生物活性， 如免疫活性、 抗病毒活性及抗菌活性等， 其中抗氧化活性的增強(qiáng)備受研究者關(guān)注． Xu等[5]對(duì)黑加侖多糖進(jìn)行硫酸化修飾， 體外實(shí)驗(yàn)表明硫酸化黑加侖多糖比黑加侖多糖具有更強(qiáng)的抗氧化活性和a-淀粉酶抑制活性； Liu等[6]對(duì)梭柄松苞菇子實(shí)體多糖(mCVP-1S)進(jìn)行硫酸化改性， 發(fā)現(xiàn)硫酸化實(shí)體多糖具有更好的體外抗氧化活性及抗凝血活性， 并發(fā)現(xiàn)取代度和三螺旋結(jié)構(gòu)是影響其生物活性的重要因素； Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)硫酸化植物乳桿菌胞外多糖顯示出比原始胞外多糖更強(qiáng)的自由基清除活性， 硫酸化胞外多糖可以保護(hù)Caco-2細(xì)胞免受蠟狀芽孢桿菌腸毒素引起的損傷.

本研究以本課題組篩選的Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株發(fā)酵產(chǎn)生的FucoPol為原料[8]， 通過(guò)化學(xué)法進(jìn)行硫酸化修飾， 在分子結(jié)構(gòu)中引入硫酸基團(tuán)， 并對(duì)硫酸化FucoPol(FucoPol-S)進(jìn)行紅外和核磁表征， 測(cè)定硫酸基含量， 以及體外抗氧化活性及細(xì)胞相容性， 為實(shí)現(xiàn)FucoPol的應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑

FucoPol由Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株發(fā)酵產(chǎn)生； Fucoidan， 上海麥克林生化科技有限公司； 氯磺酸、 吡啶、 硫酸亞鐵、 過(guò)氧化氫溶液、 氯化硝基四氮唑藍(lán)、 β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和吩嗪硫酸甲酯均為分析純， 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司； 胎牛血清、 DMEM培養(yǎng)基、 100×青霉素-鏈霉素溶液， 重慶睿宸生物科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)， 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司； 600 MHz核磁共振波譜儀， 瑞士布魯克儀器有限公司； Synergy H1型酶標(biāo)儀， 美國(guó)安捷倫科技有限公司.

1.3 細(xì)胞和菌株

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞株，Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 胞外多糖制備及分離提取

參考Li等[9]方法進(jìn)行FucoPol的發(fā)酵和分離提?。甂osakoniasp. CCTCC M2018092菌株首先在250 mL錐形瓶中培養(yǎng)活化20 h， 菌液轉(zhuǎn)移到15 L種子罐中預(yù)培養(yǎng)13 h， 預(yù)生長(zhǎng)的種子液轉(zhuǎn)移到50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵96 h.

發(fā)酵結(jié)束后， 發(fā)酵液進(jìn)行部分酸水解降低粘度以便于進(jìn)行后續(xù)的分離提純． 發(fā)酵液使用濃硫酸調(diào)節(jié)pH值至2.0， 在80 ℃下水解4 h． 使用陶瓷膜過(guò)濾除去發(fā)酵液中的菌體和不溶性雜質(zhì)． 使用截留分子量為10 000 g/mol的高分子膜進(jìn)行超濾以進(jìn)一步去除小分子雜質(zhì)． 接著， 通過(guò)Sevag法脫蛋白， 最后通過(guò)透析(截留分子量8 000 g/mol)和凍干得到FucoPol.

1.4.2 硫酸化多糖制備

采用氯磺酸-吡啶法進(jìn)行FucoPol的硫酸化[10]． 在磁力攪拌和冰水浴冷卻的條件下， 將6 mL氯磺酸通過(guò)恒壓滴液漏斗緩慢加入12 mL無(wú)水吡啶中， 在40 min內(nèi)滴加完成， 得到淡黃色固體狀硫酸化試劑.

將500 mg FucoPol粉末加入20 mL甲酰胺， 于室溫下磁力攪拌分散30 min． 加入硫酸化試劑， 于50 ℃反應(yīng)2 h． 冷卻至室溫， 使用4 mol/L NaOH溶液調(diào)整反應(yīng)液的pH值至7.0左右， 使用3倍體積乙醇沉淀硫酸化多糖． 5000 r/min離心5 min后棄去上清液， 使用去離子水溶解沉淀， 流水透析(截留分子量3 500 g/mol)12 h， 去離子水中透析24 h． 透析液凍干后得硫酸化多糖(FucoPol-S).

1.4.3 硫酸化修飾驗(yàn)證

通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和核磁氫譜(1HNMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征． 制備的硫酸化多糖樣品使用常規(guī)方法壓片， 采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描分析(掃描范圍400～4 000 cm-1)； 取5 mg干燥的多糖樣品溶解于0.5 mL氘代水中， 內(nèi)標(biāo)為TMS， 進(jìn)行1HNMR分析.

式中： S為硫酸化多糖中的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m2為硫酸根質(zhì)量， 單位為mg；m1為硫酸化多糖質(zhì)量， 單位為mg.

1.4.4 羥基自由基清除活性測(cè)定

參考Chen等[12]的方法測(cè)定巖藻多糖、 FucoPol-S和FucoPol羥基自由基(·OH)清除活性． 使用去離子水配制不同濃度的樣品溶液． 在96孔板中， 將160 μL樣品溶液與40 μL 9 mmol/L FeSO4溶液和40 μL 8.8 mmol/L H2O2溶液充分混合， 再加入20 μL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液． 混合均勻后， 于37 ℃靜置30 min， 并于酶標(biāo)儀上測(cè)定510 nm處吸光度． 維生素C(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照， 以去離子水替代多糖溶液作為空白， 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔． 計(jì)算·OH清除率：

式中：Y1為·OH清除率；A0為空白孔吸光度；A1為樣品孔吸光度.

1.4.5 超氧陰離子清除活性測(cè)定

式中：Y2為超氧陰離子清除率；A0為空白孔吸光度；A1為樣品孔吸光度.

1.4.6 細(xì)胞毒性測(cè)定

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞在完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充有100 U/mL青霉素、 100 μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)， 并在37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

通過(guò)CCK-8試劑盒測(cè)定FucoPol-S對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性[14-15]． 在96孔板中接種100 μL稀釋至5.0×104個(gè)/mL的細(xì)胞， 每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔． 培養(yǎng)12 h后， 棄去原培養(yǎng)基， 分別用100 μL以完全培養(yǎng)基溶解的FucoPol-S(12.5 μg/mL至50 μg/mL)處理細(xì)胞24 h． 將多糖溶液替換為等體積完全培養(yǎng)基作為空白組． 隨后， 向每個(gè)孔中加入10%CCK-8溶液， 于37 ℃孵育2 h， 使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度． 計(jì)算細(xì)胞活力：

式中：V為細(xì)胞活力；A0為空白組吸光度；A1為多糖實(shí)驗(yàn)組吸光度.

1.4.7 細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定

參考鄒靈秀等[16]的方法進(jìn)行細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建． 在96孔板中接種100 μL以完全培養(yǎng)基稀釋至5.0×104個(gè)/mL的RAW 264.7細(xì)胞， 每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔． 培養(yǎng)12 h， 棄去原培養(yǎng)基， 用100 μL DMEM培養(yǎng)基稀釋的不同濃度H2O2(0～900 μmol/L)處理細(xì)胞12 h． 隨后， 向每個(gè)孔中加入10%CCK-8溶液， 于37 ℃孵育2 h， 使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度． 計(jì)算細(xì)胞活力.

參考Zhang等[17]的方法進(jìn)行細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)． 在96孔板中接種100 μL以完全培養(yǎng)基稀釋至5.0×104cell/mL的RAW 264.7細(xì)胞， 每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔． 培養(yǎng)12 h， 棄去原培養(yǎng)基， 實(shí)驗(yàn)組用100 μL完全培養(yǎng)基稀釋的不同質(zhì)量濃度的FucoPol-S(0.5～50 μg/mL)和巖藻多糖(0.5～50 μg/mL)處理細(xì)胞24 h． 隨后， 加入100 μL 1.5 mmol/L DMEM培養(yǎng)基稀釋的H2O2溶液， 培養(yǎng)12 h． 空白組以等體積完全培養(yǎng)基替代多糖溶液， 等體積DMEM培養(yǎng)基替代過(guò)氧化氫溶液． 過(guò)氧化氫對(duì)照組以等體積完全培養(yǎng)基替代多糖溶液． 最后， 向每孔加入10%CCK-8溶液， 于37 ℃孵育2 h， 使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度． 計(jì)算細(xì)胞活力.

1.4.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相關(guān)圖片． 實(shí)驗(yàn)結(jié)果是3次及以上分析的平均值， 使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，p<0.05表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸化修飾驗(yàn)證

發(fā)酵液經(jīng)酸水解、 膜過(guò)濾、 透析凍干后得到FucoPol． 500 mg FucoPol硫酸化得到558 mg FucoPol-S， 產(chǎn)率111.6%(圖1)． 通過(guò)比濁法在FucoPol中未檢測(cè)到硫酸基存在， 而測(cè)得FucoPol-S和巖藻多糖硫酸基含量分別為28.2%，20.7%.

圖1 FucoPol硫酸化修飾反應(yīng)

在FucoPol-S的FT-IR光譜中出現(xiàn)了硫酸基團(tuán)的特征吸收帶， 1 258 cm-1附近的條帶歸屬于不對(duì)稱S=O雙鍵的伸縮振動(dòng)， 證明硫酸基團(tuán)成功引入[17]． 800～850 cm-1左右的吸收帶由C-O-S對(duì)稱振動(dòng)引起， 該范圍的紅外吸收可用來(lái)推斷硫酸基團(tuán)在硫酸化多糖中的取代位置， 在含半乳糖單元的多糖中845 cm-1，830 cm-1和820 cm-1位置的條帶分別分配給的C-4硫酸化、 C-2硫酸化和C-6硫酸化[18]． FucoPol-S的紅外光譜中在808 cm-1和832 cm-1出現(xiàn)了吸收峰， 可以推斷FucoPol的硫酸化主要發(fā)生在C-6和C-2位置(圖2).

圖2 FucoPol和FucoPol-S FT-IR光譜圖

在FucoPol-S的1HNMR圖中， 歸屬于巖藻糖甲基的質(zhì)子峰化學(xué)位移值向低場(chǎng)移動(dòng)(由1.29移至1.44)， 提示在巖藻糖單元上發(fā)生了硫酸化修飾[19]． 而化學(xué)位移3.2～4.6之間歸屬于巖藻糖、 葡萄糖、 半乳糖和葡萄糖醛酸的質(zhì)子峰都整體向低場(chǎng)方向發(fā)生了移動(dòng)， 說(shuō)明硫酸化修飾隨機(jī)發(fā)生在各個(gè)單糖單元的羥基上.

2.2 自由基清除活性

羥基自由基(·OH)是人體內(nèi)存在的活性氧之一， 其能輕易地穿過(guò)細(xì)胞膜并與碳水化合物、 蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子發(fā)生反應(yīng)， 是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的主要原因． 因此， 減少·OH對(duì)于人體健康具有重要意義． 采用Fenton試劑產(chǎn)生·OH， 測(cè)定巖藻多糖、 FucoPol-S和FucoPol對(duì)·OH的清除活性(圖3)． 3種多糖的·OH清除率具有濃度依耐性， 半數(shù)抑制質(zhì)量濃度分別為IC50(巖藻多糖)=0.67 mg/mL；IC50(FucoPol-S)=1.82 mg/mL；IC50(FucoPol)>8.00 mg/mL． 當(dāng)質(zhì)量濃度增達(dá)到8.0 mg/mL時(shí)， FucoPol-S的·OH清除率為81.61%， 巖藻多糖的·OH清除率為80.34%， 兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)， FucoPol的·OH清除率為43.37%， 顯著小于FucoPol-S(p<0.05)． 對(duì)比FucoPol-S和FucoPol， 結(jié)果顯示硫酸化修飾顯著增強(qiáng)了巖藻多糖的·OH清除活性， 說(shuō)明硫酸根在清除·OH中起重要作用． 對(duì)比FucoPol-S和巖藻多糖， 結(jié)果顯示FucoPol-S的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度高于巖藻多糖， 但高質(zhì)量濃度時(shí)兩者·OH清除活性相當(dāng)． Wang等[20]研究表明硫酸化多糖可能通過(guò)螯合Fe2+來(lái)減少·OH的產(chǎn)生， 我們推測(cè)高取代度的硫酸化多糖中可用于螯合Fe2+的羥基減少， 可能是高取代FucoPol-S ·OH清除活性略低于Fucoidan的原因.

圖3 ·OH清除活性比較

圖清除活動(dòng)性比較

2.3 細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用不同質(zhì)量濃度的FucoPol-S處理RAW 264.7細(xì)胞24h后， 結(jié)果顯示50 μg/mL及以下均未顯示出細(xì)胞毒性， 說(shuō)明FucoPol-S具有較好的生物安全性(圖5).

圖5 FucoPol-S對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

用濃度遞增的過(guò)氧化氫溶液處理RAW 264.7細(xì)胞12 h后， 其細(xì)胞活力逐漸降低， 當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到0.9 mmol/L時(shí)， 細(xì)胞活力降至25.59%． 其中， 當(dāng)濃度為0.7 mmol/L時(shí)， 細(xì)胞活力為54.86%． 基于該結(jié)果， 后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用0.7 mmol/L過(guò)氧化氫處理12 h作為細(xì)胞氧化損傷條件.

細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)中， 比較了不同質(zhì)量濃度的FucoPol-S和巖藻多糖對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞活力喪失的保護(hù)作用(圖6)． 結(jié)果顯示， 當(dāng)使用5 μg/mL FucoPol-S或50 μg/mL巖藻多糖時(shí)， 均能顯著的提升細(xì)胞活力， 其中FucoPol-S以更低質(zhì)量濃度達(dá)到和巖藻多糖相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用． 據(jù)報(bào)道， 細(xì)胞抗氧化能力與硫酸化多糖自由基清除活性高度相關(guān)[22]， FucoPol-S在低質(zhì)量濃度表現(xiàn)出細(xì)胞抗氧化活性可能與其較低的超氧陰離子半數(shù)抑制質(zhì)量濃度有關(guān)． 同時(shí)注意到， 當(dāng)FucoPol-S質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加時(shí)， 細(xì)胞活力再度降低， 這可能與高質(zhì)量濃度抗氧化物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān).

圖6 FucoPol-S和Fucoidan對(duì)H2O2處理的RAW 264.7細(xì)胞活力影響

3 結(jié)論

以Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株發(fā)酵產(chǎn)生的FucoPol為原料， 采用氯磺酸-吡啶法進(jìn)行硫酸化改性， 制備了一種硫酸基含量為28.2%的硫酸化巖藻多糖， 硫酸基團(tuán)在各單糖單元的醇羥基上均有分布． 使用非選擇性硫酸化方法， 大多數(shù)硫酸根基團(tuán)與多糖中空間位阻較小的C-6伯羥基相連， 硫酸基接枝位置對(duì)生物活性也具有一定的影響[23]． 硫酸化修飾往往能增強(qiáng)多糖的的抗氧化活性[24]， 可能的機(jī)制是在多糖分子中引入硫酸基團(tuán)引起O-H鍵的解離能減弱， 增加硫酸化多糖的供氫能力[25].

FucoPol-S對(duì)細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用． 在進(jìn)一步的細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)中， FucoPol-S顯示出良好的細(xì)胞相容性， 并能顯著減少過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞活力降低， 且FucoPol-S能以低質(zhì)量濃度(5 μg/mL)達(dá)到與高質(zhì)量濃度巖藻多糖(50 μg/mL)相當(dāng)?shù)募?xì)胞抗氧化效果． 說(shuō)明在低濃度下即可對(duì)細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)生保護(hù)作用.

綜上所述， 以發(fā)酵法經(jīng)硫酸化修飾的的FucoPol-S對(duì)比褐藻來(lái)源的Fucoidan在超氧陰離子自由基清除及低濃度細(xì)胞抗氧化方面具有明顯優(yōu)勢(shì)， 且原料具有廉價(jià)易得的優(yōu)勢(shì)， 在未來(lái)抗氧化功能食品及保健制品開(kāi)發(fā)中具有廣泛應(yīng)用前景.