HPLC-DAD 法同時測定銀翹解毒丸中7 種成分的含量*

李 霞 易徐航 張鈺祺

（萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗所，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

銀翹解毒丸由清代醫(yī)學家吳鞠通所著《溫病條辨》中的銀翹散演變而來，作為風熱感冒的一種常用首選復方制劑，具有辛涼解表、清熱解毒的功效。君藥金銀花-連翹作為清熱解毒經典藥對，具有抗病毒、抗菌、抗內毒素及免疫調節(jié)等作用，特別是抗病毒作用效果更佳[1]。金銀花主要有效成分綠原酸據(jù)報道，其具有抗菌抗炎等藥理作用[2]，木犀草苷具有降血脂、抗病毒等作用，同時木犀草苷是區(qū)別金銀花與山銀花、忍冬藤的主要特征成分，具有較強的呼吸道殺菌作用。連翹的主要活性成分連翹苷和連翹酯苷A，二者含量已被《中華人民共和國藥典》2020 年版一部收載作為重要檢測指標來評價藥材質量優(yōu)劣。臣藥牛蒡子清熱利咽喉，同時疏散風熱，活性成分牛蒡苷具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗菌等多種生物活性[3]。使藥甘草調和諸藥，并與桔梗合用增強解毒利咽散結之功效，常以甘草苷及甘草酸作為指標成分來測定含量。

銀翹解毒丸現(xiàn)行的質量標準為WS3-B-3693-98（蜜丸）、WS3-3693-98-1（小蜜丸和水蜜丸）、WS3-B-2782-97（濃縮丸）以及《中華人民共和國藥典》（濃縮蜜丸）2020年版一部[4]。標準中主要通過顯微鑒別，薄層色譜定性檢測其中多味藥材，濃縮蜜丸質量標準中收載了金銀花中綠原酸的含量檢測項目，但檢測成分單一，不能從整體把控制劑的質量。對其質量控制研究的報道，主要集中在以HPLC 單波長檢測金銀花、連翹、牛蒡子、甘草中一兩味藥材指標成分的檢測[5-8]。中藥成分復雜多樣，建立多指標成分進行含量測定顯得尤其重要。本研究采用HPLC-DAD 法同時測定銀翹解毒丸中7種活性成分含量，主要目的是有效控制制劑質量以及臨床用藥療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（型號：1200 型）-二極管陣列檢測器（安捷倫），CPA225D 十萬分之一電子分析天平（賽多利斯），ME-204 萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多），KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），純水儀（普力菲爾）。

1.2 試藥 乙腈（賽默飛世爾科技）、磷酸（科密歐化學試劑有限公司）均為色譜級，甲醇（湖南匯虹試劑有限公司，批號為2011125.3），水為UP 級。綠原酸（批號為PF200705-11，純度為99.48%），連翹酯苷A（批號為PF200719-02，純度為99.89%），甘草苷（批號為PF200318-04，純度為98.84%），木犀草苷（批號PF200517-08，純度為98.20%），連翹苷（批號為PR200603-11，純度為98.47%），牛蒡苷（批號為PF200907-02，純度為98.15%），甘草酸銨（批號為RJ200104-16，純度為98.63%），以上7 種對照品均由Sanford Chemicals 提供。

陰性藥材均購自市場，均經萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗所藥品室易徐航鑒定為正品。銀翹解毒丸為市售產品，18 批樣品信息見表1。

表1 18 批銀翹解毒丸樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用色譜柱Agilent 5TC-C18（2）250 mm×4.6 mm；流動相A（乙腈）：B（0.3%磷酸），梯度洗脫（0～10 min，10%→20%A；10～20 min，20%→20%A；20～30 min，20%→30%A；30～60 min，30%→100%A；60～65 min，100%→10%A）；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm，340 nm；進樣體積：10 μL；流速：1 mL·min-1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品11.64 mg、連翹酯苷A 對照品11.17 mg、甘草苷對照品9.38 mg、木犀草苷對照品8.83 mg、連翹苷對照品13.01 mg、牛蒡苷對照品12.45 mg、甘草酸銨對照品10.54 mg 分別置于10 mL 量瓶中，制成對照品貯備液，用50%甲醇溶液溶解稀釋制成綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、木犀草苷、連翹苷、牛蒡苷及甘草酸（甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）的質量濃度分別為0.0232、0.0223、0.0185、0.0173、0.0256、0.0244、0.1018 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液 取水蜜丸研碎（蜜丸剪碎），精密稱定約1.2 g，精密加入50%甲醇50 mL 溶解并稀釋，加熱回流30 min，靜置放冷后用50%甲醇補足重量，混合均勻后過濾取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按工藝方法制備缺金銀花、連翹、牛蒡子、甘草陰性樣品，按樣品溶液制備方法制備成缺金銀花、連翹、牛蒡子、甘草的陰性樣品溶液。見圖1。

圖1 銀翹解毒丸中7 種成分HPLC 色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取各對照品貯備液制成質量濃度綠原酸為11.6 μg·mL-1、連翹酯苷A 為11.2 μg·mL-1、甘草苷為1.9 μg·mL-1、木犀草苷為1.7 μg·mL-1、連翹苷為5.1 μg·mL-1、牛蒡苷為12.2 μg·mL-1及甘草酸銨為10.4 μg·mL-1的混合溶液。分別精密量取1、2、4、8、12、16、20 μL 注入液相色譜儀，測定混合對照品的峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線并計算得線性回歸方程。見表2。

2.3.2 檢測限與定量限 用對照品貯備液進行逐級稀釋測定檢測限與定量限，以3 倍信噪比測得檢測限，以10 倍信噪比測得定量限，各成分檢測限與定量限。見表2。

表2 銀翹解毒丸中7 種成分線性曲線、檢測限和定量限

2.3.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，注入色譜儀，連續(xù)進樣5 次，結果綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、木犀草苷、連翹苷、牛蒡苷及甘草酸銨峰面積的相對標準差（Relative standard deviation，RSD）%分別為0.19%、0.19%、0.19%、0.16%、0.17%、0.46%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取S2 供試品溶液分別于0、2、8、12、24 h 時進樣10 μL，注入色譜儀，測定峰面積，結果樣品在24 h 內穩(wěn)定性良好，綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、木犀草苷、連翹苷、牛蒡苷及甘草酸銨峰面積的RSD%分別為0.40%、1.22%、0.33%、1.69%、0.58%、2.09%、2.45%。

2.3.5 重復性試驗 取S2 樣品6 份，按2.2.2 方法制備溶液，每份連續(xù)測定3 次，測定綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、木犀草苷、連翹苷、牛蒡苷及甘草酸的平均含量分別為0.5363 mg·g-1、3.7127 mg·g-1、0.1431 mg·g-1、0.1114 mg·g-1、1.4897 mg·g-1、0.3873 mg·g-1、0.6124 mg·g-1，RSD%分別為1.48%、0.87%、2.05%、2.26%、1.40%、1.80%、2.95%，結果表明本法重現(xiàn)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 取已測得含量的S2 樣品6 份，每份精密稱取約0.5 g，精密加入綠原酸0.2316 mg、連翹酯苷1.1158 mg、甘草苷0.1854 mg、木犀草苷0.1734 mg、連翹苷0.6405 mg、牛蒡苷0.2444 mg以及甘草酸0.3047 mg，按2.2.2 方法制備溶液，取10 μL 注入色譜儀，進行測定，計算回收率。結果綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、木犀草苷、連翹苷、牛蒡苷及甘草酸平均回收率分別為：97.6%、100.8%、98.7%、99.2%、101.7%、101.8%、96.6%，RSD%分別為2.69%、2.08%、2.52%、1.81%、2.09%、2.31%、1.12%。

2.3.7 樣品含量測定 選取不同生產企業(yè)18 批樣品，按樣品溶液制備方法2.2.2 制備，各平行制備2 份樣品溶液，按上述色譜條件進行測定，采用外標法計算各成分的含量，結果見表3。

由表3 可知，18 批銀翹解毒丸中7 種成分的含量存在明顯差異。同一生產企業(yè)生產的不同批次樣品，7種成分含量大體相當，不同劑型、不同廠家樣品差異性較大，以綠原酸、連翹酯苷A、牛蒡苷的含量差異最為明顯。

表3 銀翹解毒丸中7 種成分的含量測定結果 (mg·g-1，n=2)

3 討論

3.1 提取方法的選擇 對供試品溶液采取不同的處理方法（超聲和加熱回流），提取時間（超聲10、30、60 min 與加熱回流10、30、60 min）等進行考察，結果提取相同時間，加熱回流的處理方法對指標成分的提取效果更好。加熱回流30 min 各指標成分能提取完全，故選取加熱回流30 min 作為供試品溶液的提取方法。

3.2 檢測波長的選擇 經過二極管陣列檢測檢測器（Diode Array Detector，DAD）對對照品溶液在150～450 nm 內進行紫外光譜掃描，并采集光譜圖。綠原酸在240 nm 和327 nm 處有最大吸收，連翹酯苷在280 nm 和327 nm 處有最大吸收，甘草苷、連翹苷、牛蒡苷在230 nm 和280 nm 處均有最大吸收，木犀草苷在250 nm 和350 nm 處有最大吸收，甘草酸銨在250 nm 處有最大吸收，為提高實驗方法的準確性和靈敏度，最終考慮選擇在230 nm 波長下檢測甘草苷、連翹苷、牛蒡苷及甘草酸，在340 nm 波長下檢測綠原酸、連翹酯苷A、木犀草苷。

3.3 流動相的選擇 考察了甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.3%磷酸，乙腈-0.3%磷酸4 種不同的流動相進行梯度洗脫，結果顯示乙腈-0.3%磷酸為流動相洗脫效果最好，各色譜峰峰型，分離效果以及基線平穩(wěn)度最好。故最終以乙腈-0.3%磷酸作為流動相。

4 小結

綜上所述，本研究采用HPLC-DAD 法同時對銀翹解毒丸中7 種成分進行含量測定，該方法具有簡單可行、靈敏度高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，可用于整體全面控制該制劑的質量，以保證產品質量穩(wěn)定和臨床用藥療效。