激動ALDH2抑制程序性壞死減輕膿毒癥小鼠心肌損傷的作用探討

張共鵬，魏艷龍，黃毓慧，李文韜，程志鵬，高琴，王佳慧，葉紅偉

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000；2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233000；3. 蚌埠醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233000)

膿毒癥是指機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的多器官功能障礙[1]，膿毒癥心肌損傷是最常見的器官功能障礙之一[2]，其增加了膿毒癥患者的死亡率，因此尋找有效的預(yù)防和治療方法具有重要意義。本課題組前期已報道程序性壞死(necroptosis)參與高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[3-4]，程序性壞死亦參與膿毒癥誘導(dǎo)的肝、腎損傷[5-6]，但在膿毒癥心肌損傷中的報道較少。線粒體乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)作為一種重要的抗氧化酶參與對抗多種疾病損傷[7]。本課題組前期研究顯示高表達(dá)ALDH2可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌程序性壞死和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用[3-4，8]，另有報道顯示ALDH2可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌功能障礙[9]。那么，激動ALDH2是否減輕膿毒癥心肌損傷中程序性壞死的發(fā)生？因此，本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture，CLP)誘導(dǎo)小鼠膿毒癥心肌損傷，首先觀察程序性壞死是否參與心肌損傷，進(jìn)一步通過Alda-1特異性激動ALDH2，分析其是否通過抑制程序性壞死發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗小鼠RIPK1、RIPK3抗體(上海愛必信生物科技有限公司)；兔抗小鼠ALDH2抗體(Abcam公司，英國)、兔抗小鼠Caspase-8抗體(Affinity公司，美國)、兔抗小鼠GAPDH抗體(上海愛必信生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京蘭杰柯科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠30只(體質(zhì)量18～22 g)(河南斯克貝斯生物科技股份有限公司)。本研究經(jīng)動物倫理委員會許可，動物的護(hù)理和處理嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》進(jìn)行，所有動物都于蚌埠醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及CLP膿毒癥模型建立 小鼠隨機(jī)分為3組，10只/組。各組小鼠手術(shù)前12 h禁食，自由飲水。4%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，掐尾反應(yīng)評估小鼠達(dá)到穩(wěn)定麻醉后，1%異氟烷維持麻醉狀態(tài)至CLP手術(shù)結(jié)束。CLP模型小鼠使用手術(shù)剪在腹白線處逐層剪開表皮、肌層和腹膜(切口長度約1～2 cm)，分離盲腸，于盲腸長度1/2或3/4的位置用4號無蒂絲線進(jìn)行環(huán)形結(jié)扎。隨后在盲腸末端以上約0.5 cm處采用針頭扎穿兩次，擠出內(nèi)容物少許，將盲腸復(fù)位，逐層縫合肌肉及皮膚，術(shù)后立即給予2 mL/100 g生理鹽水補(bǔ)充體液。假手術(shù)(Sham)組小鼠除盲腸不結(jié)扎穿孔外，其余操作同CLP組。CLP+Alda-1組小鼠在進(jìn)行CLP術(shù)前1 h腹腔注射ALDH2特異性激動劑Alda-1(10 mg/kg)[10-12]，其余操作同CLP組。

1.4 HE染色觀察心肌形態(tài)變化 小鼠造模后24 h，麻醉后取新鮮心肌組織，PBS溶液清洗，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，隨后切片(0.5 mm)，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，于光鏡下(Nikon Eclipse E100)觀察小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)變化。

1.5 透射電子顯微鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化 小鼠造模后24 h，立即取心尖組織(約1 mm3)，置入2.5%戊二醛電鏡固定液中，后在1%鋨酸避光室溫固定2 h，脫水、滲透包埋、聚合后超薄切片(70 nm)染色，在透射電子顯微鏡(HITACHI，HT7800，日本)下觀察小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 ELISA法檢測各組小鼠心肌組織TNF-α含量變化 造模后24 h，提取小鼠心肌組織，12 000 r/min 4 ℃低溫離心15 min，取上清液，每組吸取50 μL上清液，按照試劑盒說明步驟操作，最后測量各孔吸光度(A)，計(jì)算各組心肌組織TNF-α含量。

1.7 Western Blot檢測心肌組織ALDH2、Caspase-8、RIPK1和RIPK3的蛋白表達(dá) 每只小鼠取約50 mg心肌組織，加入10 μL/mg RIPA裂解液和0.1 μL/mg PMSF蛋白酶抑制劑置于冰上裂解30 min后提取組織總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，定量30 μg上樣，電泳(30 min)后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(2 h)，5%脫脂牛奶封閉(2 h)，兔抗小鼠ALDH2抗體(1∶2000)、Caspase-8抗體(1∶2000)、RIPK1抗體(1∶500)、RIPK3抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶6000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，兔抗山羊二抗(1∶8000)孵育2 h，TBST洗膜3次，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(FluorChem M，美國)曝光、顯影。Image J軟件分析各組不同蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌組織形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)變化 HE染色和電鏡結(jié)果顯示，Sham組心肌纖維細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，無壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1)，線粒體排列整齊，膜完整(見圖2)。CLP組心肌細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)水腫，心肌纖維斷裂，排列紊亂，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1)，部分線粒體腫脹變性，嵴斷裂，外膜部分溶解消失，結(jié)構(gòu)不完整(見圖2)。CLP+Alda-1組肌絲排列較整齊，部分炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1)，線粒體損傷減輕，膜較完整，部分線粒體出現(xiàn)嵴斷裂和腫脹(見圖2)。

注：黑色箭頭標(biāo)記炎癥細(xì)胞，紅色箭頭標(biāo)記紅細(xì)胞滲出。圖1 各組小鼠心肌組織HE染色(×400)

圖2 各組小鼠心肌組織透射電鏡圖片(×15000)

2.2 各組小鼠心肌組織TNF-α含量變化 與Sham組相比，CLP組心肌組織TNF-α含量升高(P<0.01)。與CLP組相比，CLP+Alda-1組心肌組織TNF-α含量降低(P<0.05)。見圖3。

2.3 各組小鼠心肌組織ALDH2、Caspase-8、RIPK1和RIPK3蛋白表達(dá)變化 Western Blot檢測各組ALDH2、Caspase-8、RIPK1和RIPK3蛋白表達(dá)，代表性條帶見圖4A。與Sham組相比，CLP組心肌ALDH2蛋白表達(dá)降低(P>0.05)，見圖4B。Caspase-8蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4C。RIPK1、RIPK3蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，見圖4D、圖4E。與CLP組相比，CLP+Alda-1組ALDH2和Caspase-8蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，見圖4B、圖4C，RIPK1和RIPK3蛋白表達(dá)降低(P<0.01或P<0.05)，見圖4D、圖4E。

注：與Sham組相比，**P< 0.01； 與CLP組相比，#P< 0.05。圖3 各組小鼠TNF-α含量的變化

注：各組小鼠心肌組織中代表性的Western Blot條帶(A)，ALDH2(B)、Caspase-8(C)、RIPK1(D)和RIPK3(E) 蛋白表達(dá)的變化。與Sham組相比，*P<0.05，**P<0.01；與CLP組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖4 各組小鼠心肌組織的Western Blot結(jié)果

3 討論

程序性壞死(necroptosis)是一種不同于凋亡及傳統(tǒng)壞死的促炎細(xì)胞死亡方式，屬于可調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[13]，受多種蛋白質(zhì)或激酶的調(diào)控，RIPK1(Receptor Interacting Protein Kinase 1)-RIPK3(Receptor Interacting Protein Kinase 3)-MLKL(Mixed Lineage Kinase Domain like protein)是介導(dǎo)程序性壞死發(fā)生的經(jīng)典通路[14]。程序性壞死可以被激活凋亡的相同死亡配體刺激，其中TNF-α是被研究得最充分的一種，其可以被TNFR1識別，并與泛素化的RIPK1形成復(fù)合物Ⅰ[15]，當(dāng)Caspase-8缺乏或被抑制時，RIPK1與RIPK3結(jié)合，通過分子內(nèi)自磷酸化和反式磷酸化形成RIPK1/RIPK3。RIPK3聚集并磷酸化MLKL形成復(fù)合物Ⅱc，磷酸化的MLKL從細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)膜，MLKL寡聚化導(dǎo)致膜孔形成、膜破裂并最終引起程序性壞死[14]。

程序性壞死參與多種疾病的發(fā)生，其在膿毒癥心肌損傷中作用如何？本研究采用使用最廣泛的膿毒癥動物模型——CLP法誘導(dǎo)小鼠膿毒癥心肌損傷。觀察CLP后24 h小鼠心肌結(jié)構(gòu)變化[16-19]。結(jié)果顯示，與Sham組相比，CLP干預(yù)24 h后小鼠心肌纖維排列紊亂、斷裂、間質(zhì)水腫，且有炎癥細(xì)胞浸潤；心肌線粒體腫脹、嵴斷裂，提示膿毒癥可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞及線粒體損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥心肌損傷的發(fā)生與炎癥因子風(fēng)暴進(jìn)一步激活相關(guān)信號通路相關(guān)，其中TNF-α發(fā)揮重要作用[20]。降低TNF-α的含量可減輕膿毒癥心肌損傷[21]。TNF-α還可以誘導(dǎo)程序性壞死的發(fā)生。因此本研究檢測了膿毒癥小鼠心肌TNF-α含量，結(jié)果顯示與Sham組相比，CLP組心肌TNF-α的含量顯著增加。TNF-α可誘導(dǎo)程序性壞死的發(fā)生，那么膿毒癥心肌損傷中是否有程序性壞死的發(fā)生？本研究進(jìn)一步檢測了與程序性壞死密切相關(guān)的RIPK1、RIPK3和Caspase-8蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Sham組相比，CLP組RIPK1、RIPK3蛋白表達(dá)增高，Caspase-8蛋白表達(dá)降低，提示程序性壞死參與膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷。

線粒體是調(diào)節(jié)程序性壞死[22]、細(xì)胞凋亡[23]等不同細(xì)胞死亡的關(guān)鍵。線粒體損傷可能是膿毒癥心肌損傷中的關(guān)鍵因素[24]，減輕線粒體功能障礙對于維持心肌正常功能活動至關(guān)重要，并且可能為膿毒性心肌病提供可行的保護(hù)措施[25]。促進(jìn)線粒體關(guān)鍵酶——ALDH2的表達(dá)可減輕線粒體損傷，保護(hù)心肌、肝臟和神經(jīng)細(xì)胞等免受損傷[26-29]。SHEN C等[30]已報道ALDH2缺乏時，小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生RIPK1/RIPK3/MLKL介導(dǎo)的程序性壞死。本研究結(jié)果顯示CLP組心肌細(xì)胞線粒體損傷；基于線粒體及ALDH2在心肌損傷中的作用，給予Alda-1激動ALDH2表達(dá)分析心肌損傷改變。結(jié)果顯示，雖然與Sham組相比，CLP組心肌ALDH2蛋白表達(dá)降低不顯著，但給予Alda-1干預(yù)后，與CLP組相比，CLP+Alda-1組心肌ALDH2蛋白表達(dá)增加，心肌形態(tài)和線粒體結(jié)構(gòu)有所改善，TNF-α含量降低，程序性壞死通路中的關(guān)鍵蛋白RIPK1、RIPK3表達(dá)降低，Caspase-8蛋白表達(dá)增加，提示激動ALDH2可通過減少TNF-α的釋放、抑制程序性壞死，以減輕膿毒癥心肌損傷，ALDH2如何調(diào)控程序性壞死還有待進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，程序性壞死參與膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷、激動ALDH2發(fā)揮心肌保護(hù)作用可能與抑制程序性壞死有關(guān)。