癲癇模型小鼠海馬組織AMPKα1的表達(dá)與線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的關(guān)系

周欣鴻，岑麗蘭，顧倩，安苗苗，楊茜

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床病理科，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院病理診斷與研究中心，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000)

癲癇是第四種最常見的神經(jīng)疾病，全世界約有7 000萬人患有癲癇[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有1 000萬癲癇患者，且平均每年還在以40～60萬的速度遞增[2]。癲癇以藥物治療為主，約70%～80%的患者經(jīng)規(guī)律治療后癥狀可得到有效控制，仍有20%～30%為難治性癲癇[3]。難治性癲癇的發(fā)生機(jī)制往往非常復(fù)雜，且治療效果不佳[4]。因此，迫切需要了解癲癇的病理生理學(xué)的分子機(jī)制，并據(jù)此確定癲癇的新治療靶點(diǎn)。最近研究表明，癲癇發(fā)作是由線粒體功能障礙導(dǎo)致[5]，癲癇發(fā)作時(shí)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性顯著降低[6]、復(fù)合物Ⅲ活性顯著降低[7]、復(fù)合物Ⅳ表達(dá)降低并伴有AMPK激活缺陷[8]、細(xì)胞內(nèi)線粒體生成ATP含量減少[9]。導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性喪失、神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并隨后發(fā)展為癲癇發(fā)病機(jī)制。保護(hù)線粒體功能已經(jīng)成為治療癲癇發(fā)病最有效的治療方法之一[10]。尋找與線粒體功能及代謝相關(guān)的癲癇治療靶點(diǎn)為有效治療癲癇提供了全新思路，意義重大。大量證據(jù)表明AMPK在癲癇病理生理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用[11]。AMPK是一種Ser/Thr激酶，它由催化α亞單位、調(diào)節(jié)β和γ亞單位組成[12]，可以調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子參與調(diào)控線粒體生物合成、動(dòng)力學(xué)和線粒體自噬，從而保證線粒體質(zhì)量、維持其正常氧化代謝功能[13]。其中AM-PKα是AMPK能否被激活的最關(guān)鍵因子，它的兩種亞型(AMPKα1和α2)均在大腦中表達(dá)，用于調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)[14]。AMPKα1在其他線粒體功能障礙的神經(jīng)退行性疾病抑郁癥[15]、阿爾茨海默癥[16]中表達(dá)改變，以其為靶點(diǎn)的治療可以緩解認(rèn)知缺陷、減輕線粒體損傷，但AMPKα1在癲癇中的表達(dá)水平及作用機(jī)制在國(guó)內(nèi)外少有研究。因此本實(shí)驗(yàn)采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇小鼠模型，研究癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后不同時(shí)期癲癇小鼠海馬AMPKα1表達(dá)水平、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ酶活性，進(jìn)行相關(guān)性分析，初步探討AMPKα1是否為與線粒體呼吸功能相關(guān)的癲癇有潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所有研究均遵循《中國(guó)衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》，并經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠(6周齡)，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(20～25) g。飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(21±3) ℃，自由飲食飲水，12 h明暗交替。

1.2 主要儀器及試劑 見表1。

表1 主要儀器及試劑

1.3 模型制備 模型組：腹腔注射氯化鋰(3 mEq/kg，美國(guó) Sigma公司)18 h后，腹腔注射毒蕈堿膽堿酯能拮抗劑阿托品(1 mg/kg，美國(guó) Sigma公司)。30 min后腹腔注射匹羅卡品(30 mg/kg，美國(guó) Sigma公司)，SE持續(xù)1 h后注射地西泮(10 mg/kg，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供)終止發(fā)作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇發(fā)作分級(jí)按照Racine評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[17]。實(shí)驗(yàn)小鼠癲癇性發(fā)作≥Ⅳ級(jí)且持續(xù)時(shí)間≥30 min為造模成功。對(duì)照組：生理鹽水代替匹羅卡品，其余處理同模型組。通常在注射匹羅卡品10～30 min左右，可以觀察到實(shí)驗(yàn)小鼠表現(xiàn)持續(xù)性的中度至重度癲癇樣發(fā)作，如上肢抽搐、痙攣、流汗、口吐白沫等現(xiàn)象。其中癲癇模型組有3只小鼠在造模過程中抽搐致死，2只未達(dá)到癲癇發(fā)作級(jí)別，1只未達(dá)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)已死亡。對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)過程中始終無任何發(fā)作跡象及抽搐表現(xiàn)。

1.4 標(biāo)本制備 分別于SE后0 d、2周、6周用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，迅速斷頭取腦，冰上解剖大腦取出海馬，干冰迅速冷凍，置于-80 ℃冰箱保存。左半球海馬標(biāo)本用于AMPKα1表達(dá)水平檢測(cè)，右半球海馬標(biāo)本用于線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性檢測(cè)。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot) 小鼠水合氯醛麻醉后斷頭取腦，冰上分離海馬，根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行海馬蛋白提取。采用BCA 試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行濃度測(cè)定，每孔蛋白上樣量30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、快速封閉液室溫封閉15 min，AMPKα1多克隆抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜；1×TBST 液洗5×5 min；二抗(1∶3000)室溫孵育1 h；1×TBST液洗5×5 min。ECL 發(fā)光液使條帶可視化，Image J 軟件測(cè)量條帶灰度值，以目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白β-actin 灰度值，進(jìn)行歸一化處理。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 海馬組織稱重，按1∶9加入預(yù)冷PBS，勻漿器充分勻漿，離心取上清，將10 μL樣本加入酶標(biāo)孔板底部后加入酶標(biāo)試劑100 μL，封板膜封板37 ℃溫育60 min。洗滌液洗滌孔板5次，每孔加入顯色劑A，再加入顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，459 nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 癲癇慢性期小鼠海馬線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性顯著下降

2.1.1 復(fù)合體Ⅰ的活性 復(fù)合體Ⅰ在SE后0 d(見圖1A)即下降，至SE后2周(見圖1B)和6周(見圖1B)與相應(yīng)對(duì)照組相比，其活性均有降低(P<0.05，P<0.01)。

*P<0.05； **P<0.01。圖1 癲癇0 d、2周、6周組小鼠海馬組ComplexⅠ活性變化

2.1.2 復(fù)合體Ⅲ的活性 復(fù)合體Ⅲ在SE后0 d(見圖2A)與對(duì)照組相比有輕度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.173)，SE后2周(見圖2B)降至對(duì)照水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.541)，至6周(見圖2C)進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。

ns：P>0.05，*P<0.05。圖2 癲癇0 d、2周、6周組小鼠海馬組織ComplexⅢ活性變化

2.1.3 復(fù)合體Ⅳ的活性 復(fù)合體Ⅳ在SE后0 d(見圖3A)與對(duì)照組相比有升高(P=0.010)，SE后2周(見圖3B)降至對(duì)照水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.326)，至6周(見圖3C)進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040)。

*P<0.05，ns：P>0.05。圖3 癲癇0 d、2周、6周組小鼠海馬組織Complex Ⅳ活性變化

2.2 AMPKα1在癲癇6周小鼠海馬組織表達(dá)下調(diào) 采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SE后0 d、2周、6周小鼠海馬組織AMPKα1表達(dá)水平(見圖4A)，結(jié)果顯示與相應(yīng)的對(duì)照組相比0 d(見圖4B)、2周(見圖4C)癲癇小鼠AMPKα1表達(dá)水平未見顯著變化，隨著發(fā)作后的時(shí)間進(jìn)展，AMPKα1表達(dá)水平逐步降低，癲癇6周小鼠海馬組織表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(見圖4D)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048) 。

ns：P>0.05，*P<0.05。圖4 癲癇0 d、2周、6周組小鼠海馬組織AMPKα1表達(dá)水平

2.3 癲癇小鼠海馬組織AMPKα1表達(dá)水平與ComplexⅠ、Ⅲ、Ⅳ活性呈正相關(guān) 本研究發(fā)現(xiàn)癲癇小鼠海馬AMPKα1表達(dá)水平與ComplexⅠ、ComplexⅢ、Complex Ⅳ活性呈正相關(guān)(r=0.763，P=0.017；r=0.730，P=0.026；r=0.671，P=0.048)，見表2。

表2 海馬AMPKα1表達(dá)水平與復(fù)合物Ⅰ、

3 討論

癲癇是臨床上最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，國(guó)內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究。最近研究顯示[18]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體功能障礙可導(dǎo)致癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作亦可引起線粒體損傷。線粒體的基本功能是以ATP形式為細(xì)胞提供能量，它的充足供能對(duì)維持神經(jīng)元的興奮性和生存至關(guān)重要[19]。ATP的產(chǎn)生主要依賴于線粒體呼吸鏈，其包括4種酶復(fù)合體，它們的活性變化能直接或間接地反映其線粒體的呼吸功能變化[20]。典型的呼吸鏈有兩種，其中NADH呼吸鏈由ComplexⅠ-ComplexⅢ-ComplexⅣ復(fù)合體組成，是最重要的電子傳遞鏈[21]。AMPK是調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，它參與調(diào)控線粒體生物合成、動(dòng)力學(xué)和線粒體自噬，從而保證線粒體質(zhì)量、維持其正常氧化代謝功能[13]。AMPKα1是AMPK能否被激活的最關(guān)鍵因子，它在大腦中表達(dá)，用于調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)。AMPKα1是細(xì)胞能量代謝的主要感受器，在低能量條件下，增加ATP的產(chǎn)生，減少ATP的消耗，同時(shí)調(diào)節(jié)線粒體功能，在維持機(jī)體能量代謝平衡中發(fā)揮重要作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過激活A(yù)MPK改善線粒體呼吸活性[23]，而線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ的抑制劑魚藤酮和抗霉素A可激活A(yù)MPK[24]。AMPK與線粒體呼吸鏈活性密切相關(guān)，而AMPKα1是其激活的關(guān)鍵因子，二者之間可能存在緊密聯(lián)系。因此以小鼠匹羅卡品顳葉癲癇為模型，在癲癇持續(xù)狀態(tài)后不同時(shí)期觀察線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性的變化及AMPKα1表達(dá)水平變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合體Ⅰ的活性在SE后0 d即顯著下降，至SE后2周和6周與相應(yīng)對(duì)照組相比，其活性均有顯著性降低。復(fù)合體Ⅲ的活性在SE后0 d與對(duì)照組相比有輕度的升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SE后2周降至對(duì)照水平，至6周則顯著下降。復(fù)合體Ⅳ在SE后0 d與對(duì)照組相比有顯著性升高，SE后2周降至對(duì)照水平，至6周進(jìn)一步下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些數(shù)據(jù)提示SE可導(dǎo)致線粒體呼吸功能損傷且隨時(shí)間進(jìn)展日益加重。本研究還發(fā)現(xiàn)AMPKα1在SE后0 d、2周輕度下調(diào)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，至SE后6周其表達(dá)顯著降低，海馬線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性與AMPKα1表達(dá)水平呈正相關(guān)，即癲癇發(fā)作后AMPKα1表達(dá)水平越低，海馬線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性越低。提示AMPKα1表達(dá)下調(diào)可能與線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性降低密切相關(guān)進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙，AMPKα1可能是與線粒體代謝相關(guān)的未被發(fā)現(xiàn)的癲癇的潛在治療靶點(diǎn)。