腎病綜合征模型大鼠的阿霉素構(gòu)建方法比較

戴淑娟 方 慶

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是由多種病理原因所引起的腎小球疾病中的一組臨床癥候群[1]，其發(fā)病原因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。開拓NS的治療方案，提升NS治愈率以及降低疾病復(fù)發(fā)率，已成為當(dāng)前此類研究關(guān)注的熱點(diǎn)。NS臨床癥狀的特征非常顯著，其典型臨床表現(xiàn)包括大量蛋白尿、高脂血癥、水腫及低蛋白血癥等，其中以大量蛋白尿?yàn)樽罨咎卣鱗1]。因此，在腎病綜合征動(dòng)物模型構(gòu)建的過(guò)程中，最關(guān)鍵的是該模型能夠表現(xiàn)出疾病的典型臨床癥狀。

在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中，作為模擬主要腎病臨床癥狀的動(dòng)物模型方法，阿霉素注射法構(gòu)建的腎病綜合征[2-3]，已得到廣泛認(rèn)可。以往研究[4]提示：阿霉素給藥劑量與給藥頻率的差異，可導(dǎo)致病理狀態(tài)的改變。在造模周期的不同時(shí)間段，一些關(guān)鍵的檢測(cè)指標(biāo)可呈現(xiàn)差異。從關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)指標(biāo)在不同造模周期內(nèi)的變化入手，探討相關(guān)機(jī)制，對(duì)深入探索藥物對(duì)疾病的干預(yù)進(jìn)程具有重要意義。本課題主要研究較長(zhǎng)周期下腎病綜合征大鼠尿水通道蛋白2（AQP2）與一氧化氮（NO）的相關(guān)性，據(jù)此設(shè)計(jì)差異化的阿霉素給藥方法，探討誘導(dǎo)大鼠腎病綜合征模型的制備。根據(jù)以往相關(guān)文獻(xiàn)的造模方法及經(jīng)驗(yàn)，本課題選用尾靜脈注射阿霉素溶液法，總劑量分別為6 mg/kg（單次注射）、7.5 mg/kg（連續(xù)兩次隔周注射）、6 mg/kg（連續(xù)兩次隔周注射），探索構(gòu)建合適的腎病綜合征大鼠模型的方案。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠，健康SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±30）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：2014（皖）-002。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究遵循了國(guó)家制定的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)過(guò)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑 鹽酸阿霉素（批號(hào)：18003012）；BCA試劑盒；氯化鈉注射液（批號(hào)：1701062332）。全自動(dòng)生化分析儀，日本島津公司；德國(guó)Leica RM2135切片機(jī)；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus；DP70數(shù)碼拍照裝置，日本Olympus；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Labsystems 公司，MultiskanMK2。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理 40只雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～230 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將40只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只。正常對(duì)照組大鼠給予1 mL生理鹽水。觀察組單次劑量6 mg/kg組，一次性尾靜脈注射6 mg/kg阿霉素溶液；兩次6 mg/kg組，第一次和第二次分別注射4 mg/kg和2 mg/kg，累計(jì)6 mg/kg，隔周連續(xù)兩次尾靜脈注射；兩次7.5 mg/kg組，第一次和第二次分別注射4 mg/kg和3.5 mg/kg，累計(jì)7.5 mg/kg，隔周連續(xù)兩次尾靜脈注射；誘導(dǎo)腎病綜合征模型。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 分別于造模后2、4、8周收取大鼠24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白。檢測(cè)血液生化指標(biāo)甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）和血清白蛋白（TP）等。8周末處死大鼠，取腎臟標(biāo)本行病理檢測(cè)。腎組織置于4%中性甲醛溶液中24 h后，流水沖洗過(guò)夜，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切成4 μm的切片，按照HE染色試劑說(shuō)明書操作，行HE染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)涉及數(shù)據(jù)以SPSS 22統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)結(jié)果以單因素方差進(jìn)行分析，方差齊性則以LSD法作組間分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四組大鼠形態(tài)體征的觀察比較 采用尿蛋白試紙定性監(jiān)測(cè)大鼠尿蛋白。試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組大鼠食欲旺盛，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量持續(xù)增加，尿蛋白含量沒(méi)有上升；所有模型組大鼠從第3天起陸續(xù)開始出現(xiàn)蛋白尿，之后尿蛋白含量每日逐漸上升。造模4天后，模型組大鼠開始出現(xiàn)腹瀉，第10天最為明顯。造模期間大鼠毛色蓬松無(wú)光澤、精神萎靡、進(jìn)食量下降、活動(dòng)顯著減少、體質(zhì)量明顯減輕、出現(xiàn)眼鼻部血性分泌物、尾巴潰爛等表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，阿霉素注射單次6 mg/kg組有3只大鼠死亡；隔周兩次6 mg/kg組中1只大鼠死亡，而隔周兩次7.5 mg/kg組有2只大鼠死亡。死亡原因可能與嚴(yán)重腹瀉或較強(qiáng)的阿霉素毒性有關(guān)。

2.2 四組大鼠尿蛋白的測(cè)定比較 阿霉素注射2周后，三組模型組大鼠24 h尿蛋白較正常對(duì)照組均明顯升高（P＜0.01），表明造模成功。所有模型組大鼠于造模4周時(shí)所測(cè)的尿蛋白含量均明顯高于造模2周時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。在造模8周后，尾靜脈單次注射6 mg/kg組尿蛋白含量開始逐漸下降；隔周兩次6 mg/kg組和兩次7.5 mg/kg組仍呈提升趨勢(shì)，但將兩組第8周與第4周的尿蛋白相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同造模方法對(duì)各組大鼠24 h蛋白尿定量的比較（x± s，mg）

2.3 四組大鼠生化指標(biāo)的測(cè)定比較 與正常對(duì)照組大鼠相比，不同阿霉素給藥方案中模型組大鼠ALB和TP的表達(dá)量下降，含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。單次6 mg/kg組和兩次6 mg/kg組在造模8周時(shí)的大鼠血清TC亦高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而隔周兩次7.5 mg/kg組在造模8周時(shí)的大鼠血清TG、TC、Scr和BUN的表達(dá)量均明顯增加，水平均顯著高于正常對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相較于其他模型組大鼠，隔周兩次7.5 mg/kg組各項(xiàng)血液生化指標(biāo)在造模8周后具有明顯的腎病綜合征特征，且模型穩(wěn)定。見表2。

表2 不同造模方法對(duì)大鼠生化指標(biāo)含量的影響（±s）

表2 不同造模方法對(duì)大鼠生化指標(biāo)含量的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較 ★P＜0.05，★★P＜0.01

組別 n TG(mmol·L-1)TC(mmol·L-1)BUN(mmol·L-1)Scr(μmol·L-1) TP(g·L-1) ALB(g·L-1)正常對(duì)照組 10 0.88±0.12 2.01±0.31 6.08±0.95 45.12±6.93 51.62±4.62 25.25±2.70單次 6 mg/kg組 7 1.12±0.10★ 2.72±0.55★ 8.13±1.35★★ 64.71±10.67★★ 48.00±3.69★ 19.14±1.88★★兩次 6 mg/kg組 9 1.20±0.06★★ 2.86±0.39★ 10.58±2.00★★ 73.67±8.58★★ 45.68±2.29★★ 18.35±1.52★★兩次7.5 mg/kg組 8 1.33±0.15★★ 3.23±0.51★★ 11.57±1.79★★ 85.34±9.19★★ 40.48±1.55★★ 15.48±1.39★★

2.4 四組大鼠腎組織病理改變的比較 光鏡下觀察結(jié)果提示，正常對(duì)照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，形態(tài)學(xué)無(wú)明顯異常；不同造模方法模型組（觀察組）大鼠均見腎小球增大、系膜基質(zhì)增多、毛細(xì)血管堵塞；腎小管擴(kuò)張、有上皮細(xì)胞顆粒變性，蛋白管型多見，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在所有各模型組中，以隔周兩次7.5 mg/kg阿霉素注射組大鼠腎臟組織病變程度最為嚴(yán)重。見圖1。

圖1 不同模型方法各組大鼠腎組織HE染色（＊400）

3 討 論

阿霉素誘導(dǎo)腎病綜合征大鼠模型的機(jī)制主要為直接損傷腎小球上皮細(xì)胞，誘發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等結(jié)構(gòu)和功能紊亂。此外，阿霉素還促使腎小球固有細(xì)胞產(chǎn)生和釋放自由基，進(jìn)一步損傷腎小球結(jié)構(gòu)。采用阿霉素注射法建立腎病綜合征大鼠模型，一般造模5天左右開始出現(xiàn)尿蛋白，10～14天出現(xiàn)大量尿蛋白，4周時(shí)表現(xiàn)為典型的腎病綜合征癥狀。此方法操作簡(jiǎn)單，周期較短，癥狀較為明顯，故阿霉素誘導(dǎo)動(dòng)物模型是目前公認(rèn)的腎病綜合征動(dòng)物制備模型。

現(xiàn)階段，以尾靜脈注射阿霉素誘導(dǎo)腎病綜合征的大鼠模型制備方法較多、給藥方法和劑量[5-9]也不盡相同。本實(shí)驗(yàn)旨在尋找符合課題要求、造模成功率高且大鼠死亡率低的造模方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素用藥方法不同及劑量不同對(duì)大鼠血生化含量和腎組織病理的影響有較明顯差異。通過(guò)對(duì)血生化指標(biāo)觀察后發(fā)現(xiàn)，單次阿霉素注射組（劑量6 mg/kg）較其他模型組對(duì)各項(xiàng)生化指標(biāo)影響較??；且大鼠24 h尿蛋白在造模4周時(shí)升高明顯，但8周時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而兩次隔周注射6 mg/kg模型組與7.5 mg/kg模型組大鼠尿蛋白含量在造模8周后持續(xù)明顯升高，生化含量變化明顯，且大鼠死亡率下降，可能是由于較低劑量的阿霉素劑量多次注射所致。兩次隔周注射7.5 mg/kg模型組在8周實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)腎組織病變程度最為嚴(yán)重，可維持較典型的腎病綜合征特征，可能與總給藥劑量較大、且兩次給藥造成大鼠腎臟持續(xù)性損傷有關(guān)。

綜上所述，兩次隔周尾靜脈注射阿霉素7.5 mg/kg法可作為誘導(dǎo)制備腎病綜合征大鼠模型的方法，并將應(yīng)用于本課題后續(xù)研究中。