嗜酸乳桿菌LA-Y26高密度培養(yǎng)工藝條件優(yōu)化

◆作者：譚文俊，張文，歐豪，潘杰華，向健

◆單位：清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司

嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus）屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，是一種重要的益生菌，其形態(tài)多數(shù)呈現(xiàn)細(xì)長桿狀，分布較雜亂，以單個、成雙或短鏈出現(xiàn)，菌落邊緣較粗糙且不規(guī)則，通常呈中間向兩邊放線狀分布，顏色較透明。嗜酸乳桿菌具有改善腸道健康、調(diào)節(jié)免疫、減輕肥胖、治療腸道疾病等眾多益生功能。眾多試驗研究證明了嗜酸乳桿菌對治療腹瀉和縮短腹瀉時間有一定的功效，能夠很好地定殖于動物腸道，有效抑制致病菌的生長，調(diào)節(jié)宿主的菌群平衡。在其生長過程中會產(chǎn)生對病原菌和腐敗菌有一定的拮抗作用的代謝產(chǎn)物，能夠有效地抑制體內(nèi)有害微生物的生長和繁殖以及毒素的分泌，起到平衡宿主腸道微生物菌群的作用，從而治療由致病菌引起的腹瀉。嗜酸乳桿菌在食品、藥品及飼料添加劑中均有應(yīng)用，市場需求巨大。

本研究通過單因素實驗及正交試驗對嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為嗜酸乳桿菌LA-Y26高密度培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種、試劑和設(shè)備

1.1.1 菌種和試劑

菌種：嗜酸乳桿菌LA-Y26，分離自健康育肥豬腸道菌群，由本實驗室保藏；MRS培養(yǎng)基：按照GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》方法配置；無水葡萄糖：廣州化學(xué)試劑廠；乳糖：阿拉丁試劑（上海）有限公司；甘露糖：阿拉丁試劑（上海）有限公司；麥芽糖漿：廣州雙橋股份有限公司；蔗糖：市售；蛋白胨；大豆蛋白胨；胰蛋白胨；牛肉浸粉；酵母提取粉均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 設(shè)備

電子天平：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1菌種活化

將嗜酸乳桿菌LA-Y26凍干管接入MRS液體培養(yǎng)基中，37.0℃培養(yǎng)20h，活化二代；

1.2.2 種子培養(yǎng)

將活化后的菌種按體積分?jǐn)?shù)5.0%接種到裝有200mL MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37.0℃培養(yǎng)20h。

1.2.3 嗜酸乳桿菌LA-Y26培養(yǎng)基優(yōu)化

以MRS液體培養(yǎng)基為起始培養(yǎng)基，選擇添加量均為10.0g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖、甘露糖作為碳源，進(jìn)行碳源優(yōu)化試驗；選擇添加量均為10.0g/L的大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉作為氮源，進(jìn)行氮源優(yōu)化試驗；選擇添加量為1.0g/L的葉酸、生物素、維生素B1、天冬氨酸、賴氨酸進(jìn)行促生長因子優(yōu)化試驗。在三角瓶中進(jìn)行試驗，37.0℃培養(yǎng)20h進(jìn)行發(fā)酵液活菌計數(shù)，初步確定培養(yǎng)基成分。

在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，選擇最佳碳源、氮源、促生長因子進(jìn)行正交試驗，得到最佳碳源、氮源、促生長因子的最佳添加量。

1.2.4 嗜酸乳桿菌LA-Y26三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

在上述正交試驗基礎(chǔ)上，考察不同接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時間對嗜酸乳桿菌LA-Y26生長情況的影響，確定較優(yōu)的三角瓶培養(yǎng)條件。

1.2.5 嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵罐驗證

在20L規(guī)模發(fā)酵罐進(jìn)行小試試驗，將種子接種至裝有12L培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐中，按照1.2.4最優(yōu)條件進(jìn)行培養(yǎng)，取樣檢測活菌數(shù)，驗證優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果和分析

2.1 嗜酸乳桿菌LA-Y26培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源優(yōu)化結(jié)果

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中主要的能量來源，充足的碳源有利于菌體的生長。由圖1可見，MRS培養(yǎng)基為對照，以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖和甘露糖為碳源的培養(yǎng)基種，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)量分別為2.7×108、4.1×108、3.8×108、3.6×108、4.9×108、3.2×108CFU/mL。以乳糖為碳源的培養(yǎng)基，嗜酸乳桿菌生長狀態(tài)明顯優(yōu)于其他成分的培養(yǎng)基，葡萄糖、蔗糖次之。

圖1 不同碳源對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

氮源是構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料，用于菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物的合成，充足且易于利用的氮源有利于細(xì)胞快速分裂。由圖2可見，MRS培養(yǎng)基為對照，以大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉為氮源的培養(yǎng)基中，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)分別為2.9×108、5.3×108、4.7×108、3.8×108、4.3×108、3.6×108CFU/mL。以大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基，嗜酸乳桿菌生長狀態(tài)明顯優(yōu)于其他成分的培養(yǎng)基，酶水解酪蛋白、乳清粉次之。

圖2 不同氮源對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.1.3 促生長因子優(yōu)化結(jié)果

嗜酸乳桿菌依賴于培養(yǎng)基提供某些生長必需的維生素、氨基酸，在培養(yǎng)基中添加促生長因子，可提高氮源利用率，促進(jìn)嗜酸乳桿菌生長。由圖3可見，MRS培養(yǎng)基為對照，添加量為1.0g/L的葉酸、生物素、維生素B1、天冬氨酸、賴氨酸時，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)分別為3.0×108、4.7×108、5.5×108、4.2×108、6.1×108、5.6×108CFU/mL。以天冬氨酸為促生長因子時，嗜酸乳桿菌生長狀態(tài)明顯優(yōu)于其他成分的培養(yǎng)基，賴氨酸、生物素次之。

圖3 促生長因子對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.2 正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，選擇乳糖、大豆蛋白胨、天冬氨酸進(jìn)行三因素三水平正交試驗，考察碳源、氮源及促生長因子對嗜酸乳桿菌LA-Y26生長的影響。由表1可見，乳糖、大豆蛋白胨及天冬氨酸的影響順序為乳糖＞天冬氨酸＞大豆蛋白胨，較優(yōu)組合為乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，按照最優(yōu)組合進(jìn)行三角瓶培養(yǎng)試驗，發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)35.7×108CFU/mL。

表1 嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

2.3 嗜酸乳桿菌LA-Y26三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 接種量優(yōu)化

根據(jù)上述正交試驗最優(yōu)結(jié)果配置培養(yǎng)基，分別按1.0%、3.0%、5.0%、10.0%接種量接種，37.0℃培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計數(shù)。由表2可見，當(dāng)接種量在3.0%時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)37.5×108CFU/mL。

表2 不同接種量對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.2 初始pH值優(yōu)化

根據(jù)上述試驗結(jié)果，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0，按3.0%接種量接種，37.0℃培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計數(shù)。由表3可見，當(dāng)初始pH值在6.0時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)42.7×108CFU/mL。

表3 不同初始pH值對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.3 培養(yǎng)溫度優(yōu)化

根據(jù)上述試驗結(jié)果，按初始pH值6.0，3.0%接種量接種，調(diào)整培養(yǎng)溫度為28.0℃、32.0℃、37.0℃、42.0℃，培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計數(shù)。由表4可見，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37.0℃時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)43.9×108CFU/mL。

表4 不同培養(yǎng)溫度對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.4 轉(zhuǎn)速優(yōu)化

根據(jù)上述試驗結(jié)果，按初始pH6.0，3.0%接種量，培養(yǎng)溫度37.0℃，調(diào)整轉(zhuǎn)速為0、50、100、200r/min，培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計數(shù)。由表5可見，當(dāng)轉(zhuǎn)速為50r/min時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)63.1×108CFU/mL。

表5 不同轉(zhuǎn)速對失算乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.5 嗜酸乳桿菌LA-Y26生長曲線

根據(jù)上述試驗結(jié)果，按初始pH6.0，3.0%接種量，培養(yǎng)溫度37.0℃，轉(zhuǎn)速50r/min，間隔2h取樣檢測發(fā)酵液OD600nm及活菌數(shù)，考察嗜酸乳桿菌LA-Y26最佳培養(yǎng)時間。由圖4可見，隨培養(yǎng)時間不斷增加，發(fā)酵液的OD600nm值和活菌數(shù)同步呈上升趨勢，培養(yǎng)6h嗜酸乳桿菌LA-Y26進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)20h后進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液的OD600nm及活菌數(shù)均呈略微下降趨勢，因此嗜酸乳桿菌LA-Y26最佳培養(yǎng)時間為20h。

圖4 嗜酸乳桿菌LA-Y26生長曲線及活菌數(shù)

2.4 20L發(fā)酵罐試驗結(jié)果

在20L發(fā)酵罐中，配置MRS培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基，按照相同的優(yōu)化條件培養(yǎng)嗜酸乳桿菌LA-Y26。結(jié)果表明，使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)，嗜酸乳桿菌LAY26在20L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)82.1×108CFU/mL，約為MRS培養(yǎng)基的40倍。

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，實現(xiàn)了嗜酸乳桿菌LA-Y26的高密度培養(yǎng)，優(yōu)化后培養(yǎng)基為乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，吐溫80 1.0mL/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，檸檬酸三銨2.0g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.05g/L；培養(yǎng)條件為初始pH6.0，接種量3.0%，溫度37.0℃，轉(zhuǎn)速50r/min，培養(yǎng)時間20h。在20L發(fā)酵罐中進(jìn)行多次驗證試驗，發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)82.1×108CFU/mL，約為MRS培養(yǎng)基的40倍。按優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行多次500L、1000L發(fā)酵罐試驗，結(jié)果表明，發(fā)酵液活菌數(shù)比優(yōu)化前水平有大幅度提升。

參考文獻(xiàn)：（略）