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    影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)因素的淺析

    2023-01-17 14:19:52劉占艷
    中國畜禽種業(yè) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:移液器量程血凝

    劉占艷

    (山東省濱州市無棣縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心,山東濱州 251900)

    高致病性禽流感、新城疫等疫病對禽類養(yǎng)殖危害巨大,疫苗的免疫是防控該類疫病的主要途徑,鑒于此,可借助檢測抗體的方式實(shí)現(xiàn)對免疫結(jié)果的分析與考核及時掌握群體免疫動態(tài),指導(dǎo)適合本場的免疫程序,以發(fā)揮疫苗的理想保護(hù)作用,達(dá)到最佳的免疫效果。對此,免疫抗體監(jiān)測的準(zhǔn)確性、可靠性、穩(wěn)定性以及代表性對禽流感、新城疫等疾病的控制工作具有重要的意義與價值[1]。

    血凝與血凝抑制試驗(yàn)是當(dāng)前抗體監(jiān)測的主要方法,本方法操作簡單,但疏忽每一步均會直接影響最終判定結(jié)果。因此,為了更好地提高禽流感、新城疫的防控水平,提高抗體監(jiān)測效果的實(shí)效性和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,現(xiàn)對試驗(yàn)的影響因素做以下簡要分析。

    1 樣品采集與處理

    1.1 采樣

    可采集動物血液2~3mL,也可采集禽蛋蛋黃2mL。采集所使用的器具必須在有效期內(nèi),無菌、干燥、清潔;注射器應(yīng)避免交叉使用,每個樣品更換一次注射器或采血針,采血時的環(huán)境溫度最好為20~25℃,禽類一般在翅靜脈采血。

    進(jìn)針要準(zhǔn)確,避免動物淤血導(dǎo)致采集血樣溶血;采血速度要適中,血液從注射器移入離心管時,應(yīng)取下針頭緩慢注入,避免大量氣泡產(chǎn)生。

    采集蛋黃時應(yīng)使禽蛋大頭朝下,小頭朝上,用酒精棉球?qū)⒌皻け砻娌潦酶蓛?,輕輕敲破蛋殼,可直接去掉注射器針頭,吸取蛋黃,過程中盡量避免污染。

    1.2 保存與運(yùn)輸

    采集的活禽血樣可自然或離心析出血清,應(yīng)選擇2000~3000r/min 離心3~5min 避免溶血。分離析出的血清如在5d 內(nèi)檢測的可放4℃冷藏保存;待檢時間超過1 周的,需要冷凍保存。保存樣品需密封并做好標(biāo)記,避免交叉和污染。冷凍保存的血清避免反復(fù)凍融,影響抗體效價。

    蛋黃為防止凝固最好在1~2d 內(nèi)做完。鴨鵝血清有時會出現(xiàn)膠凍樣血清,可用一次性移液管將膠凍樣血清挑到管壁處,擠壓幾下,會得到所需血清;若擠壓后無法析出血清的,可適當(dāng)離心。

    1.3 非特異性凝集和抑制因子的處理

    影響非特異性反應(yīng)的因素很多,鴨鵝血清中常含有非特異性抑制因子,在做試驗(yàn)前有必要去除。消除方法主要有:56℃水浴30min 滅活,受體破壞酶處理法(RDE),高碘酸鹽-胰酶處理法,同種動物細(xì)胞處理法,紅細(xì)胞吸附法等。

    1.3.1 非特異性凝集素的處理

    紅細(xì)胞吸附法:配制20%雞紅細(xì)胞懸液,在清潔、干燥的微量血凝板上,加入50μL 待檢血清和50μL 20%雞紅細(xì)胞懸液混勻,靜置1h 以上,試驗(yàn)時吸取上清液。

    1.3.2 非特異性抑制素的處理

    受體破壞酶處理法(RDE):用25mL 無菌生理鹽水溶解RDE,50μL 血清加200μL RDE 混勻后37℃水浴過液。然后加250μL 檸檬酸鈉56℃水浴加熱30min 以滅活RDE。待冷卻至室溫后將50%紅細(xì)胞50μL和RDE 處理的血清500μL混勻,靜置1h,1000r/min 離心10min 取上清液待檢。

    2 器材選用

    2.1 微量血凝板

    國標(biāo)中選用96 孔V 型微量血凝板。一般血凝板可反復(fù)使用,也有一次性的。每次試驗(yàn)后要仔細(xì)清洗板孔,避免用尖銳物撮孔底導(dǎo)致板孔受損;多次使用后的血凝板應(yīng)按清洗程序清洗;過分磨損的血凝板應(yīng)棄置。

    2.2 微量移液器

    微量液器有單道和多道兩種,試驗(yàn)中都需要用到。微量移液器使用也要掌握好技巧,盡可能減少誤差。

    2.2.1 移液器量程選擇

    移液器的可用量程范圍是移液器最大量程的10%~100%,最佳使用量程范圍是其最大量程的1/3 到其最大量程,可根據(jù)試驗(yàn)所需選擇合適規(guī)格的移液器。

    2.2.2 移液器使用方法

    設(shè)定移液體積:調(diào)節(jié)旋紐從大量程調(diào)至小量程,若從小量程調(diào)節(jié)至大量程則應(yīng)先調(diào)至超過設(shè)定體積刻度,再回調(diào)至設(shè)定體積,以保證移液器的精確度。

    裝配移液槍頭:將移液槍垂直插入槍頭,左右旋轉(zhuǎn)上緊即可。嚴(yán)禁移液器撞擊槍頭。

    吸液及放液:槍頭尖端垂直浸入液面3mm 以下,吸液前槍頭先在液體中預(yù)潤洗3 次左右。排液時將槍頭口貼到容器內(nèi)壁并保持10~40° 傾斜,平穩(wěn)地把按鈕壓到一擋,停約1s 后再壓到二擋,排出剩余液體。

    2.2.3 注意事項(xiàng)

    當(dāng)移液器槍頭內(nèi)有液體時切勿將移液器水平或倒置放置,以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞。使用完畢,將移液器刻度調(diào)至最大量程,并將其垂直掛在移液槍架上。在日常使用中,應(yīng)避免混用而導(dǎo)致吸取的液體體積不準(zhǔn)或放液不完全,嚴(yán)禁使用移液器吹打混勻液體。

    安裝吸頭應(yīng)穩(wěn)固,避免漏氣和掉落,保證吸取液體液面在同一平行線上。吸頭管嘴避免過深插入液體。吸放的力度要均勻,吸取液體應(yīng)緩慢平穩(wěn),以防液體吸入過快而沖入加樣器內(nèi)腐蝕柱塞造成漏氣或產(chǎn)生氣泡;致使所吸液體數(shù)量不準(zhǔn),而放液時應(yīng)干脆利落。吸頭與移液器最好配對,減少誤差。

    移液應(yīng)選用潔凈、無污染的移液槽,“專液專用”對不同液體應(yīng)標(biāo)識清楚,避免污染,影響試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)后應(yīng)及時清洗干凈,晾干或37℃恒溫箱烘干備用。

    3 試驗(yàn)操作

    3.1 緩沖液

    緩沖液體系在整個血凝及血凝抑制試驗(yàn)過程中需要保持一致性,參照國家標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)選用0.01mol/L pH=7.2 的等滲磷酸緩沖液(PBS)。緩沖液使用HCl和NaOH 調(diào)節(jié)pH,并需要滅菌處理,PBS 一經(jīng)使用,于4℃保存不超過2 周。緩沖液的酸堿度會對滴度造成影響,最好選擇精確度高的pH 計(jì)調(diào)節(jié)pH。

    3.2 1%紅細(xì)胞懸液

    配制紅細(xì)胞懸液應(yīng)采集3 只以上成年SPF 雞或非免疫健康雞,采血量與等量阿氏液混合,減少個體雞只對病毒敏感差異以及自凝現(xiàn)象。洗滌紅細(xì)胞一定要充分,轉(zhuǎn)速1000r/min,離心10min,洗滌3 次。最后一次洗滌后,如果上清液呈紅色,說明有溶血現(xiàn)象,則該紅細(xì)胞懸液不能使用。建議使用與血清來源相同的禽種紅細(xì)胞,以避免產(chǎn)生非特異性凝集[2]。

    1%紅細(xì)胞懸液4℃冷藏保存,使用1%紅細(xì)胞懸液時,應(yīng)輕搖至混合均勻,保證每個孔紅細(xì)胞濃度一致。

    3.3 病毒抗原

    采集血樣時,應(yīng)向場主了解該禽群免疫疫苗的情況,為選擇病毒抗原提供依據(jù)。首先應(yīng)該選擇與禽群免疫疫苗相同亞型株型的病毒抗原;其次選擇與疫苗同一廠家的抗原做檢測,提高檢測的靈敏度。

    病毒抗原試劑應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定保存和使用,為避免感染和反復(fù)凍融,可無菌操作分成小包裝。

    3.4 4 個血凝單位(HAU)抗原

    先對病毒抗原做血凝試驗(yàn),能使紅細(xì)胞完全凝集(100%凝集,++++)的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價,根據(jù)該血凝效價,配制4 個血凝單位(HAU)抗原。(如血凝效價為1:512(29)則4HAU=512/4=128,取12.7mLPBS 加抗原0.1mL 即配成1 : 128 的4HAU 抗原。)

    4HAU 抗原應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,若有2 孔凝集,2 孔不凝集則視為抗原配置正確。為確保4HAU 抗原準(zhǔn)確,應(yīng)對4HAU 抗原做回歸試驗(yàn),否則應(yīng)重新確定血凝效價。如圖1 所示(第5 孔為對照)

    圖1 4HAU 回歸試驗(yàn)結(jié)果

    配好的抗原室溫下放置不得超過4h,4h 以上再使用時必須做回歸試驗(yàn),確保4HAU 抗原的準(zhǔn)確性和下一步血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的靈敏度。

    4HAU 抗原標(biāo)定:在96 孔V 型板中第1~5 孔均加入PBS 25μL,然后第1 孔加入待檢4HAU 抗原25μL倍比稀釋至4 孔,5 孔作為對照,再在第1~5孔均加入1%紅細(xì)胞懸液25μL混勻。將V 型板放在室溫靜置40min 讀數(shù)。4HAU 抗原以凝集到第2 孔(1:4)為準(zhǔn),若凝集效價高于2 孔則表明配置的工作抗原效價偏高,低于2 孔則表示配置工作抗原效價偏低,根據(jù)凝集結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

    因此每次試驗(yàn)前要根據(jù)待測樣品數(shù)量計(jì)算一下本次試驗(yàn)需要多少4 單位抗原和1%紅細(xì)胞懸液,依據(jù)計(jì)算結(jié)果適當(dāng)配制避免因多配而引起浪費(fèi)。

    3.5 加樣

    在試驗(yàn)中,要向96 孔V 型微量血凝板加樣的過程應(yīng)注意:移液器移取液體體積要準(zhǔn)確一致,要加到板孔底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出;倍比稀釋待檢血清時,吸頭盡量不要離開液面,按壓移液器時要勻速力均,避免產(chǎn)生氣泡影響吸取體積;加入抗原和1%紅細(xì)胞懸液時,要充分混勻,按照低倍到高倍的順序,避免交叉。

    3.6 溫度和時間

    試驗(yàn)前,樣品和試劑均需緩慢恢復(fù)至室溫,充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?;鞚峄蛴谐恋淼难鍢悠窇?yīng)先離心至澄清后再檢測;孵育溫度控制在室溫20~25℃內(nèi),溫度過低反應(yīng)速度變慢,溫度過高時反應(yīng)結(jié)果洗脫。孵育時間也有嚴(yán)格要求,時間過短,反應(yīng)未完全滴度偏低,時間過長,反應(yīng)紅細(xì)胞洗脫導(dǎo)致滴度偏高。孵育時間大約在30~40min,以紅細(xì)胞對照孔完全沉淀前后5min 判定結(jié)果最佳[3]。

    4 控制策略

    為了更好地提高血凝和凝血抑制試驗(yàn)效果,可以采取以下措施進(jìn)行改進(jìn)。

    4.1 數(shù)值處理

    首先,確保血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作過程的合理性,務(wù)必保障每一位檢測人員的操作方式、步驟要符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn),對于不合理操作出現(xiàn)的數(shù)據(jù)均需要重新檢測。

    其次,要明確血凝和血凝抑制試驗(yàn)的誤差處理方式,檢測過程中至少需要2 名專業(yè)人員(1 名檢測、1名審核)對數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取與記錄,讀數(shù)時應(yīng)注意兩點(diǎn):第一是讀取時視線的合理性,將V 型板傾斜成60 度角觀察。第二是讀取時間的合理性,室溫(20~25℃)孵育40min,HA 試驗(yàn)觀察紅細(xì)胞有無淚珠狀流淌,HI試驗(yàn)觀察對照孔的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時讀數(shù)。

    4.2 結(jié)果分析

    在血凝和血凝抑制試驗(yàn)中常見有以下2 種異常情況,需要對異常數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確性分析。

    圖2 完全不凝集

    圖3 完全凝集

    檢測人員需要對異常數(shù)據(jù)的檢測過程、結(jié)果等進(jìn)行全面分析,明確異常數(shù)據(jù)的形成原因,如果異常數(shù)據(jù)屬于檢測失誤導(dǎo)致的,要圍繞這一失誤進(jìn)行總結(jié)反思,對結(jié)果異常的樣本或試劑需要重新檢測。工作人員還要根據(jù)實(shí)際情況采取相應(yīng)方式進(jìn)行處理,保障處理結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    5 小結(jié)

    影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)效果的因素很多,主要涉及樣本采集/處理、試劑配制、儀器的選擇和使用、人員的操作和結(jié)果判定、環(huán)境溫度等。因此,要嚴(yán)格按照規(guī)程認(rèn)真操作。

    在實(shí)際抗體監(jiān)測中,必須全程進(jìn)行嚴(yán)格要求和管理,發(fā)現(xiàn)問題要及時糾正。試驗(yàn)中除要注意試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)外,平時應(yīng)多組織實(shí)驗(yàn)室人員參加省市級實(shí)驗(yàn)室檢測能力比對和兄弟縣市實(shí)驗(yàn)室之間的比對與交流,以助于提高試驗(yàn)質(zhì)量和結(jié)果。只有保障試驗(yàn)結(jié)果的可靠性才能真正做好對疫苗免疫效果評價,做好對禽流感、新城疫等病的預(yù)防工作,為動物疫病防控工作提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

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