油酸對延邊牛前體脂肪細胞分化及成脂相關基因表達的影響

尹云厚，張軍芳，郭盼盼，唐 琳，李香子，嚴昌國，金 鑫

(1.貴州民族大學，貴陽 貴州 550025；2.延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002；3.延邊大學 實驗動物中心，吉林 延吉 133002)

肉牛脂肪酸組成對肌內脂肪沉積具有重要影響。油酸是肉牛肌內脂肪組織中含量最豐富、最重要的單不飽和脂肪酸，是發(fā)達國家牛肉品質評定體系中最為重要的評價指標之一。研究表明，油酸作為γ-過氧化物酶體激活物受體(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)的天然配體，能夠激活PPARγ與視黃醇類X受體形成異源二聚體，調控目的基因的轉錄，在調節(jié)脂質代謝和抗氧化方面有別于其他類型的脂肪酸[1-2]。同時，油酸也是PPARγ的內源性活化劑，可以誘導3T3-L1細胞中甘油三酯的積累[3]，通過調控PPARγ來影響脂肪生成和基因下游產物的表達，可作為誘導促進劑調控前體脂肪細胞的增殖和分化[4]。在延邊牛肌內脂肪中，油酸含量越高，肌內脂肪含量也越高。但是，油酸如何調控延邊牛脂肪細胞分化并參與脂肪沉積的相關機制目前尚不清楚。因此，本試驗利用油酸誘導延邊牛前體脂肪細胞分化，通過分析油酸對細胞內脂滴形成、甘油三酯生成及成脂相關基因的表達，研究油酸在脂肪細胞分化過程中的影響；旨在闡明油酸對延邊牛前體脂肪細胞分化的影響及其對成脂相關基因的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞試驗所用的延邊牛前體脂肪細胞由延邊大學東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心鑒定并保存。

1.2 主要試劑澳洲胎牛血清FBS、DMEM高糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶EDTA-triypsin、無鈣鎂磷酸鹽緩沖液、鏈霉蛋白酶、4%多聚甲醛購自Gibco公司；青鏈霉素混合液、油紅O染色試劑盒(G1262)購自Solarbio公司；甘油三酯測定試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；熒光定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；50×電泳液購自沈陽匯佰生物科技有限公司；CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 牛前體脂肪細胞的誘導分化待傳代至第3代的前體脂肪細胞完全匯合后分別進行分化處理，利用分化液(5%FBS/DMEM+油酸100 μmol/L)進行體外誘導分化，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換1次分化液，分別收集處理0，24，48，72，96，120 h的前體脂肪細胞用于下一步試驗，以0 h為對照組。

1.4 生長曲線的繪制待前體脂肪細胞的匯合度達到70%～80%時，用PBS緩沖液輕輕地沖洗3次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，使細胞與胰蛋白酶消化液充分接觸后，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 min，取出后，將細胞按一定比例傳至96孔板中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將20 μL的Cell Titer 96Aqueous One Solution(事先已于室溫中靜置60～90 min)加入到96孔板的每個小孔中，小心混勻，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育3 h，孵育結束后設置好調零孔，用酶標儀檢測各孔D490 nm值，每次取3孔細胞，每隔24 h測定1次，進行MTS測定。

1.5 油紅O染色參考油紅O染色試劑盒說明書進行。

1.6 RNA的提取及熒光定量PCRTRIzol法提取脂肪細胞mRNA后進行cDNA合成。利用預先設計好的引物(表1)，以GAPDH為內參基因進行熒光定量PCR，具體反應體系參考文獻[5]方法進行。

表1 PCR引物序列

1.7 數據分析用Graphpad Prism 6.07統(tǒng)計學軟件對基因的相對表達量進行單因素方差分析和多重比較分析并繪制柱形圖(P<0.05表示差異顯著)。

2 結果

2.1 延邊牛前體脂肪細胞的鑒定利用前體脂肪細胞因子基因Pref-1對所分離出的細胞進行鑒定，結果如圖1所示，分化后Pref-1的表達不斷降低，至分化第6天時，幾乎不表達，因此驗證所分的細胞為延邊牛前體脂肪細胞。

圖1 延邊牛前體脂肪細胞的鑒定

2.2 油酸對延邊牛前體脂肪細胞分化過程中形態(tài)變化的影響分化處理開始后，每隔24 h觀察1次細胞(圖2)?？梢钥闯觯只幚?4 h后，形態(tài)發(fā)生明顯變化，未染色條件下便可觀察到細胞核周圍類似脂滴物質出現；分化72 h時，細胞形態(tài)變化更加明顯，肉眼可見明顯脂滴，說明經油酸處理后的前體脂肪細胞隨著培養(yǎng)時間的延長細胞形態(tài)不斷發(fā)生變化。

2.3 油酸對延邊牛前體脂肪細胞脂滴形成的影響對不同分化時間的細胞進行油紅O染色，結果如圖3所示。分化24 h時便可觀察到細胞核周圍有被染成紅色的圓形脂滴出現,隨著處理時間的延長，脂滴數量不斷增多，大小也不斷增大，待120 h時，脂滴密度和大小也變得更大，細胞邊界也已變得不再清晰。

圖3 不同分化時間油紅O染色效果(×200)

2.4 油酸對延邊牛前體脂肪細胞的甘油三酯濃度的影響油酸處理后24 h開始，細胞內甘油三酯的濃度逐漸升高，各處理組均高于對照組(圖4)，其中，96 h處理組的甘油三酯濃度最高，極顯著高于0，24，48 h組(P<0.05)，120 h開始略下降，但與96 h 處理組無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 油酸處理后不同時間的甘油三酯濃度變化

2.5 油酸對延邊牛前體脂肪細胞成脂相關基因表達的影響由圖5可以看出，經油酸處理后,各成脂相關基因的表達隨分化時間不同，各自呈現不同變化趨勢，PPARγ基因的相對表達量在誘導開始后顯著上升，至48 h時達到最高值(P<0.05)，隨后緩慢下降，至96，120 h時已顯著低于48 h，但仍顯著高于0 h(P<0.05)；C/EBPα、FABP4和PLIN2基因的相對表達量經油酸處理后先逐漸升高，到96 h 時達到最高(P<0.05)，之后開始略下降，但仍顯著高于對照組(P<0.05)；LPL基因在誘導開始后先顯著下降而后恢復到處理前的水平；C/PT1β和SREBP1基因的相對表達量在油酸處理后不斷升高，到120 h時達到最高(P>0.05)；SCD基因在處理24 h開始顯著下降(P>0.05)，在120 h時達到最低(P<0.05)。結果表明，在延邊牛前體脂肪細胞培養(yǎng)液中加入油酸，對主要成脂相關基因的相對表達量起著不同的調節(jié)作用，且隨著處理時間的不同，各基因的相對表達量呈現出不同的變化趨勢。

圖5 不同處理時間成脂相關基因的表達量變化

2.6 油酸對延邊牛前體脂肪細胞成脂相關基因蛋白表達的影響對誘導48，96 h的脂肪細胞中成脂標志基因PPARγ和C/EBPα的蛋白表達水平進行檢測，如圖6所示，PPARγ基因經油酸處理后，48 h時表達量顯著升高(P<0.05)，在96 h時顯著下降，但仍顯著高于0 h組，表現出誘導后先升后降維持高水平表達的趨勢，而C/EBPα基因在經油酸處理后，蛋白表達量不斷升高，96 h時表達量最高(P<0.05)。Western blot檢測條帶與mRNA表達規(guī)律不完全一致，說明可能存在轉錄后調控的機制。

圖6 成脂關鍵因子的蛋白表達規(guī)律

3 討論

脂肪酸可分為飽和脂肪酸(saturated fatty acids,SFAs)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFAs)。脂肪酸能夠通過調節(jié)PPARs、肝細胞核因子-4a、肝臟X受體和SREBPs等多種轉錄因子和核受體參與調節(jié)脂肪的生成、代謝效率、胰島素作用、物質合成和機體組成等多種生物學功能。有研究表明,脂肪酸可參與脂肪細胞的生理功能的調控和脂肪代謝[4-6]。作為PPARγ的天然激動劑，油酸可作為脂肪細胞分化的誘導促進劑[7]。油酸能調節(jié)PPARγ、LPL及C/EBPα的表達，促進豬前體脂肪細胞的分化，而且其促細胞分化的能力比12碳、16碳和18碳飽和脂肪酸強[4]。

油酸在人體還發(fā)揮著保護心血管、抗炎、抗腫瘤、調節(jié)免疫、改善氧化應激等多種重要功能[8-11]。研究表明，OA是牛肌肉和脂肪組織中含量最豐富的脂肪酸[12-14]，脂肪組織質量的增加伴隨著OA的相應增加[15-16]。日本黑牛的肌肉OA異常高[12,17],其獨特之處在于其在肌筋膜中含有脂肪細胞[18-19]。

大多數關于脂肪細胞分化的研究采用多種誘導物聯合對前體脂肪細胞共同作用，也有研究者探索了前體脂肪細胞和成肌細胞在單一添加物添加作用下的成脂分化，通過檢測脂肪組織分化(C/EBPβ，PPARγ)和脂質代謝(AMPKα，CPT1β，GPR43，SCD)的標志基因來研究脂肪酸對成脂分化的影響[20-23]。有研究表明，PPARγ的表達受到C/EBPβ的強烈促進，從而啟動前體脂肪細胞的分化[24-25]，另外抑制SCD催化活性可降低與脂肪酸合成相關的基因(如脂肪酸合成酶)的活性，同時增加了與脂肪酸氧化相關的基因(如CPT1β)的表達[26-27]。本試驗以100 μmol/L的油酸作為誘導分化劑,研究不同處理時間(0,24,48,72,96,120 h)油酸對延邊牛脂肪細胞分化過程中的脂滴形成、甘油三酯濃度及成脂相關基因表達的影響，結果表明通過油紅O染色，24 h時便可觀察到脂滴形成，且隨著處理時間的增加，脂滴不斷增多、增大，甘油三酯含量也增加；成脂相關基因的相對表達量隨處理時間的不同各自呈現出不同的變化，如PLIN2基因在經油酸處理后表達量顯著升高。油酸處理后SCD基因的表達顯著降低，該結論與已報道的研究結果一致[23]，說明單一添加物油酸即可有效誘導延邊牛前體脂肪細胞成脂分化。該誘導方法簡單易行，可為后續(xù)高通量篩選候選功能基因提供試驗材料。

本試驗結果表明，油酸可誘導延邊牛前體脂肪細胞分化、促進脂滴形成及提高甘油三酯濃度，同時可調控成脂相關基因(PPARγ、C/EBPα、LPL、FABP4、SCD、CPT1β、SREBP1和PLIN2)及蛋白(PPARγ、C/EBPα)的表達。