基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析連翹治療牛乳房炎的作用機制及體內(nèi)驗證

王小榛，劉 暢，宋雪嬌，邢 晨，唐 陽，張岳峰，吳 桐，陳雪英，李艷華，劉艷艷

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

乳房炎是由乳房組織感染引起的炎癥反應(yīng)，已成為奶牛最普遍的疾病[1]，它不僅對人類和動物健康產(chǎn)生影響，而且還會給乳制品行業(yè)帶來相當大的經(jīng)濟損失[2]。微生物感染已成為引起奶牛乳房炎的一個主要因素，其中金黃色葡萄球菌是主要的病原菌之一，其含有多種毒力基因且分布廣泛[3]。抗生素在乳房炎的治療中被廣泛的應(yīng)用，但抗生素耐藥發(fā)生率的增加以及牛奶和奶制品中抗生素殘留的頻繁報道引起了人們的關(guān)注[4]。

中草藥在預(yù)防和治療疾病中發(fā)揮著重要作用。連翹被稱為“瘡家圣藥”，具有消腫散結(jié)、清熱解毒等作用,以連翹為主要成分的隱乳凈已被證實對乳房炎具有一定的治療作用[5]。此外，研究表明連翹的主要臨床作用與其抗炎活性具有一定的關(guān)聯(lián)[6]，因此其具有治療乳房炎的潛力。中藥的有效藥效基礎(chǔ)是由多成分組成的復(fù)雜體系，其作用機制復(fù)雜，難以闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過計算機技術(shù)、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)分析方法可系統(tǒng)而全面地揭示中藥多成分、多靶點、多作用通路關(guān)系[7]。

本試驗通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物體內(nèi)試驗相結(jié)合的手段，通過構(gòu)建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)探索連翹治療乳房炎的藥效物質(zhì)，通過功能注釋分析連翹抗乳房炎的生物學(xué)過程及潛在作用機制。最后通過構(gòu)建金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠乳房炎模型，驗證連翹發(fā)揮治療乳房炎的分子機制,為進一步分析連翹抗乳房炎的藥效物質(zhì)及作用機制闡明提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)、Draw Venn Diagram 軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)、STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)以及GraphPad Prism 8.0軟件等。

1.2 連翹成分及乳房炎靶點預(yù)測通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索連翹的化學(xué)成分,將口服利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)作為篩選條件，進行活性成分及靶點的搜索；在DisGeNET、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫以“mastitis”為關(guān)鍵詞檢索乳房炎靶點,使用在線韋恩軟件Draw Venn Diagram獲得連翹-乳房炎的交集靶點，探索連翹可能作用于乳房炎的潛在靶點。

1.3 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓撲分析通過Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，預(yù)測連翹治療乳房炎的關(guān)鍵藥效成分。

1.4 核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析在STRING數(shù)據(jù)庫輸入連翹和乳房炎的共同靶點，物種設(shè)置為“Bostaurus”，最低閾值為 0.7，獲得相互作用靶點的數(shù)據(jù)，并通過 Cytoscape 3.6.1軟件中Network Analyzer工具進一步分析，根據(jù)Degree值篩選作用核心靶點。

1.5 GO和KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對連翹-乳房炎共同靶點進行GO分析，探究藥物作用的生物學(xué)功能。通過Cytoscape插件ClueGO對共同靶點進行KEGG分析，探究藥物作用通路。

1.6 連翹水提液制備連翹購于中國黑龍江省哈爾濱市中藥市場(批號：201817)，經(jīng)鑒定為連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl，標本存放在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物藥學(xué)系。稱取連翹藥材10 g,加入0.2 L蒸餾水，浸泡60 min,武火煮沸后文火煎3次，每次1 h，過濾，混合3次濾液，減壓濃縮至1 g/mL(生藥材)，即得連翹水提液。依據(jù)2015版中國藥典規(guī)定對連翹水提物的連翹苷及連翹酯苷A進行含量測定[8]。

1.7 試驗動物及分組SPF級哺乳雌性BALB/c小鼠36只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗動物中心提供，動物試驗均經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物委員會批準(許可證號：NEAUEC20)。適應(yīng)1周后，將小鼠隨機分為6組，每組6只，分別為對照組(Control)、乳腺炎模型組(Model)、連翹低劑量組(FF 2.5 g/kg)、連翹中劑量組(FF 5.0 g/kg)、連翹高劑量組(FF 7.5 g/kg)和陽性藥物組(DEX 5.0 mg/kg)。通過將105CFU金黃色葡萄球菌(ATCC,Manassas,VA,United States)注入正常小鼠第4對乳房(從頭部開始計數(shù))進行造模。造模次日開始，分別給予2.5，5.0，7.5 g/kg連翹水煎液進行灌胃治療，每日2次，連續(xù)5 d。5.0 mg/kg地塞米松(DEX)作為陽性對照。末次給藥12 h后處死雌鼠，取乳腺組織。

1.8 病理組織學(xué)觀察收集的部分乳房組織用4%多聚甲醛固定，脫色和石蠟脫水后，對乳房切片(4 μm)進行蘇木精伊紅染色,最后，用光學(xué)顯微鏡對試驗樣品進行觀察。

1.9 熒光定量PCR(qRT-PCR)使用總RNA試劑盒從乳腺組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄至cDNA(天根生化科技有限公司)。采用qRT-PCR方法檢測驗證相關(guān)通路基因的表達，引物由上海生工設(shè)計，2-△△Ct值表示基因相對表達量，引物信息見表1。

表1 引物序列

1.10 ELISA分析小鼠乳腺組織稱質(zhì)量后于冰上研磨(1 g組織/1 mL生理鹽水)，12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)，根據(jù)說明書測定上清液中IL-17A、NF-κB、IκBα、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。在450 nm處讀取D值。

2 結(jié)果

2.1 連翹HPLC分析定量結(jié)果顯示，連翹苷和連翹酯苷A在連翹中的百分比含量分別為1.51%和5.80%，這2種活性化合物的含量均高于2015年版《中國藥典》規(guī)定，說明連翹符合《中國藥典》的要求(圖1)，可用于后續(xù)試驗。

A.連翹苷標準品色譜圖；B.樣品中連翹苷色譜圖；C.連翹酯苷A標準品色譜圖；D.樣品中連翹酯苷A色譜圖

2.2 連翹抗乳房炎的藥效成分及靶點預(yù)測通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選，共獲得23個潛在的連翹成分(表2)和208個成分靶點；通過DisGeNET、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲得167個牛乳房炎靶點。在Draw Venn Diagram在線軟件輸入208個連翹成分靶點、167個牛乳房炎靶點，獲得連翹-乳房炎的交集靶點25個。通過Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(圖2)，通過拓撲參數(shù)Degree值篩選潛在的連翹抗乳房炎的藥效成分。網(wǎng)絡(luò)顯示，槲皮素(quercetin，Degree=19)、木犀草素(luteolin，Degree=10)、漢黃芩素(wogonin，Degree=6)和山奈酚(kaempferol，Degree=5)擁有最高的度值,表明這些成分可能是發(fā)揮抗乳房炎的藥效成分。

圖2 連翹成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

表2 連翹活性成分信息

2.3 PPI分析將25個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得交互靶點的蛋白質(zhì)互作關(guān)系。通過Cytoscape 3.6.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化(圖3)。拓撲參數(shù)Degree值代表每個節(jié)點的重要性，度值與節(jié)點顏色深淺及節(jié)點大小呈正相關(guān)，即節(jié)點越大，顏色越深，其Degree值越大。排名靠前的分別是白介素-6(IL-6,Degree=13),腫瘤壞死因子(TNF,Degree=12),白介素-8(CXCL8,Degree=11),表皮生長因子受體(EGFR,Degree=11)和細胞間黏附分子1(ICAM1,Degree=10)，這些可能是連翹作用于乳房炎的核心靶點。

圖3 核心靶點蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析運用DAVID數(shù)據(jù)庫對25個藥物-疾病交集靶點進行生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)的富集分析，通過富集的基因數(shù)值(Count)大小及P<0.05篩選條目并繪圖。如圖4所示，連翹參與的主要生物過程有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter)、免疫應(yīng)答(immune response)、凋亡過程的負調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)等；細胞組分主要富集于胞外間隙(extracellular space)，質(zhì)膜外(external side of plasma membrane)，胞質(zhì)溶膠(cytosol)等；分子功能主要富集于細胞因子活性(cytokine activity)、序列特異性DNA結(jié)合(sequence-specific DNA binding)、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)等。

圖4 GO富集分析結(jié)果

2.5 KEGG通路分析運用Cytoscape插件ClueGO對25個藥物-疾病交集靶點進行KEGG通路分析，共富集到27條信號通路(圖5)，其中包括6個與炎癥相關(guān)的信號通路，如IL-17信號通路(7.28%)、NF-κB信號通路(6,24%)、TNF信號通路(6,24%)、Toll樣受體信號通路(5,20%)和T細胞受體信號通路(5,20%)，這些途徑可能在連翹治療乳房炎中起關(guān)鍵作用,說明中草藥通過多種靶點和途徑發(fā)揮了巨大的作用。

圖5 KEGG信號通路分析結(jié)果

2.6 乳腺組織形態(tài)學(xué)及病理學(xué)分析與空白組相比，金黃色葡萄球菌感染組的小鼠乳腺管腔結(jié)構(gòu)消失，并伴有更多炎癥細胞浸潤。與模型組相比,7.5,5.0 g/kg FF和5.0 mg/kg DEX 給藥治療可改善乳腺組織形態(tài)，緩解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的炎癥損傷(圖6)。

A.空白組；B.模型組；C.7.5 g/kg FF治療組；D.5.0 g/kg FF治療組;E.2.5 g/kg FF治療組；F.5.0 mg/kg DEX治療組

2.7 IL17/NF-κB信號通路的分子表達與模型組相比，7.5，5.0 g/kg連翹水煎液和5.0 mg/kg DEX干預(yù)能顯著下調(diào)IL-17A、IκBα、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表達水平(圖7)和降低相應(yīng)蛋白含量(圖8)。結(jié)果表明，連翹可通過IL17/NF-κB信號通路激活緩解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳房炎。

A.IL-17A；B.IκBα；C.NF-κB；D.TNF-α；E.IL-6；F.IL-1β。與空白組相比，##表示P<0.01；與模型組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01；ns:沒有顯著性差異。下同

A.IL-17A；B.IκBα；C.NF-κB；D.TNF-α；E.IL-6；F.IL-1β

3 討論

乳房炎是牛群中最常見和最嚴重的炎癥性疾病，患畜治療費用巨大[9]。當今抗生素治療依舊是治療奶牛乳房炎的主要方法，但抗生素的濫用不僅會出現(xiàn)藥物殘留，還會對長時間使用患畜奶制品的人類帶來潛在威脅。連翹具有消腫散結(jié)、清熱解毒的作用，對乳房炎具有潛在的治療作用。本試驗通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、動物實驗對連翹治療乳房炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)核心靶點和通路涉及了細胞因子活性、免疫反應(yīng)、細胞凋亡和炎癥反應(yīng)等環(huán)節(jié)。

根據(jù)成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，我們鑒定出11個可能對乳房炎產(chǎn)生巨大治療作用的潛在活性化合物。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)(Degree)分析，槲皮素、木犀草素、漢黃芩素和山奈酚的Degree值排名靠前，表明這些成分可能是連翹治療奶牛乳房炎的主要成分。此外，槲皮素、木犀草素和山奈酚這3種成分已被證實對乳房炎具有顯著治療作用。富含槲皮素的中藥可通過抑制NF-κB的活化，提高Nrf2-ARE的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮治療乳房炎作用[10-11]；木犀草素可通過抑制MMPs表達和NF-κB活化，減輕金黃色葡萄球菌引起的乳房炎的炎癥反應(yīng)[12]；山奈酚可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制乳房炎的炎癥反應(yīng)[13]。這些結(jié)果再次表明，中藥是通過多種成分和多靶點發(fā)揮作用的。

眾所周知，蛋白質(zhì)通過相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[14]，不同的靶蛋白之間存在多種關(guān)聯(lián)，Degree值越高，靶點的潛在作用越大。IL-6、TNF、CXCL8、EGFR、ICAM1排名靠前，可能是連翹治療乳房炎的關(guān)鍵靶點。細胞因子是保護宿主反應(yīng)的重要介質(zhì)，包括防御腫瘤發(fā)生和微生物入侵。但是，特定的促炎細胞因子的產(chǎn)生必須受到嚴格的調(diào)控，以防止這些分子的過度表達，也被稱為“細胞因子風暴”，這可能導(dǎo)致炎癥的增加和組織損傷[15]。在所有細胞因子中，TNF-α和IL-6在細胞因子風暴的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可能與疾病嚴重程度的增加有關(guān)[16]。此外，IL-6被認為是牛乳房炎的標志物[17]。連翹水提物能有效下調(diào)TNF-α和IL-6的mRNA表達和蛋白含量，此結(jié)果在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠乳房炎模型得到了進一步證實。

中草藥通過多種靶點和途徑發(fā)揮作用。結(jié)合GO和KEGG通路富集分析，連翹抗乳房炎的分子機制與細胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、免疫調(diào)節(jié)和凋亡過程密切相關(guān)。在富集到的27條信號通路中，其中的6條通路與炎癥相關(guān)，包括IL-17信號通路、NF-κB信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路和T細胞受體信號通路。在這些炎癥相關(guān)通路的相互作用中，IL-17、TNF和TLRs的激活可觸發(fā)NF-κB的活化[18-20]。因此，我們選擇NF-κB信號通路作為IL-17信號通路的下游驗證通路。IL-17家族是最近被分類為細胞因子的一個子集，在急性和慢性炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[21],IL-17過表達可促進乳房炎組織損傷[22]。IL-17A不僅與TNF-α協(xié)同，在TNF-α誘導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定后誘導(dǎo)基因表達，而且還激活NF-κB級聯(lián)，上調(diào)多種細胞因子和促炎趨化因子表達，以顯示其促炎作用[23-24]。在未激活狀態(tài)下,NF-κB以同源或異二聚體形式與IκBα結(jié)合[25]。此外，經(jīng)金黃色葡萄球菌感染后的奶牛體細胞中IL-17A基因表達增加，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)上清液刺激乳腺上皮細胞其IL-17A基因的表達也增加[26-27]。動物試驗結(jié)果顯示，與模型組比較，7.5,5.0 g/kg連翹顯著下調(diào)IL-17A、IκBα、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白水平，表明連翹可通過IL17/NF-κB信號通路緩解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳房炎炎癥反應(yīng)。

綜上，本試驗運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物試驗相結(jié)合的方法對連翹治療牛乳房炎的分子機制進行初步探究，揭示了中藥發(fā)揮作用的多成分、多靶點、多通路的特點，為治療發(fā)病機制復(fù)雜的牛乳房炎的研究提供新的思路。