牦牛睪丸發(fā)育過程中前動力蛋白2(PK2)的動態(tài)變化

李心蕊，潘陽陽，韓小紅，藺 蕙，張燕燕，王立斌，余四九，崔 燕，徐庚全*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是我國藏區(qū)譽有“高原之舟”和“全能家畜”的畜牧資源，生存在3 000 m以上海拔地區(qū)，具有耐寒耐低氧的生存特性[1]。精子發(fā)育的優(yōu)良決定著公畜的繁殖性能，而睪丸需要攝取更多的氧氣以維持精子的生成，牦牛常年生存的生活環(huán)境致使其睪丸中氧分壓相對較低，迫使睪丸組織對缺氧具有更強的抗逆性[2]。據(jù)報道，高原低氧環(huán)境對雄性生育能力具有抑制作用，不僅會導(dǎo)致多種酶及蛋白降解的能力降低，甚至也會使精子生成數(shù)量減少[3-4]。牦牛長期適應(yīng)環(huán)境維持正常的繁殖力，其抗逆性的原理尚不清楚，有大量學(xué)者對牦牛睪丸的發(fā)育進行研究，以期揭示生殖系統(tǒng)對低氧的適應(yīng)機制。

前動力蛋白2(prokineticin2，PK2)是一種分泌型的小分子蛋白[4]，屬于AVIT蛋白家族成員之一。PK2是由MOLLAY等[5]從蟾蜍的皮膚分泌物中發(fā)現(xiàn)的，因其相對分子質(zhì)量為8 kDa，被命名為Bv8(Bombinavariegate molecular mass-8 kDa)。隨后Bv8的同源蛋白在一些哺乳動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并分別命名為前動力蛋白1(prokineticinl,PK1)和PK2。PK2一直是作為促進腸道收縮的蛋白而為人們熟知[7]。另據(jù)報道，在生理狀態(tài)的人類和小鼠睪丸組織中，PK2基因在精小管中穩(wěn)定強烈表達[4-5]并在促性腺發(fā)育[8]及精子形成的最后階段[9]發(fā)揮作用；也有研究證實，將小鼠的PK2基因敲除后，其生殖器官的質(zhì)量降低，睪丸內(nèi)生精管萎縮，管腔狹小，間質(zhì)稀疏且間質(zhì)細胞較少，精子發(fā)生缺陷[6-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以誘導(dǎo)PK2的表達量上調(diào)[10]，而表達PK2受體的血管內(nèi)皮細胞不斷分裂增殖[11]，因此推測PK2可以通過旁分泌途徑促進睪丸的血管內(nèi)皮細胞增殖以達到調(diào)節(jié)睪丸生精功能的作用。

目前，關(guān)于PK2在高原動物睪丸發(fā)育各階段中的表達情況尚未見報道。本試驗采集發(fā)育不同階段的牦牛睪丸組織，研究PK2的表達情況，為明確牦牛生殖系統(tǒng)低氧耐受適應(yīng)機制提供理論基礎(chǔ)，進而為提高牦牛繁殖力補充資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理樣本來源于甘肅甘南安多屠宰場,選取幼年期(1～2歲)、性成熟初期(2～3歲)、性成熟后期(3～5歲)和老年期(5～7歲)4個階段[12]的健康牦牛各3頭，處死后采集睪丸組織，液氮冷凍，-80℃保存。另取1 cm3組織塊，置于4%多聚甲醛中固定保存。

1.2 主要試劑和儀器PCR儀(Eppendorf,德國)；實時熒光定量PCR儀(Loch1公司,瑞士)；DAB顯色液(ZSGB-bio)；TRIzol試劑(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)；Taq PCR Master Mix(Promeg,美國)；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(寶生物，大連)；山羊抗兔IgG/HRP抗體(Bioss,北京)；兔抗PK2多克隆抗體(Novus Biologicals,上海)；SP試劑盒(Bioss,北京)。

1.3 牦牛總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄按照TRIzol試劑說明書提取不同發(fā)育階段的牦牛睪丸組織總RNA,分光光度計測D450 nm值，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證總RNA的完整性。將RNA稀釋為統(tǒng)一濃度，根據(jù)Go ScriptTMReverse Transcription System說明書反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物，交由上海生工基因科技公司合成(引物信息見表1)。

表1 引物序列

1.5 qRT-PCR檢測牦牛睪丸組織中PK2 mRNA的表達以cDNA為模板擴增牦牛PK2基因。反應(yīng)體系為：2×SYBR?Premix Ex TaqTMEraserTM10 mL,200 mg/L模板cDNA 1 μL,上、下游引物各 0.5 mL,去離子水 8 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min;95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次。試驗重復(fù)4次，繪制熔解曲線和擴增曲線，Ct值通過2-△△Ct方法計算并得到PK2 mRNA的相對表達量，并用SPSS 25.0軟件分析其在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織的表達差異性。

1.6 IHC檢測牦牛睪丸組織中PK2的定位制作4 μm厚不同發(fā)育階段的牦牛睪丸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滴加3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，沸水浴15 min修復(fù)抗原，按照說明書進行染色，一抗1∶300稀釋，陰性對照組用PBS代替一抗，DAB顯色，樹脂封片后拍照。

1.7 Western blot檢測牦牛睪丸組織中PK2蛋白的表達將-80℃保存的各發(fā)育階段牦牛睪丸組織研磨成粉末，利用裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)提取蛋白樣品，-80℃保存。將蛋白樣品100℃變性10 min，進行SDS-PAGE電泳(10%分離膠與5%濃縮膠)；剪切目的蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜上；PBST洗去多余轉(zhuǎn)膜液后，4℃封閉過夜；4℃一抗孵育8 h；室溫二抗孵育1 h；曝光成像，利用Image J收集灰度值分析其相對表達量并通過SPSS 25.0軟件分析其差異性。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中PK2 mRNA的表達瓊脂糖凝膠電泳顯示，PK2 和β-actinmRNA擴增產(chǎn)物條帶單一且大小與預(yù)期相符(圖1)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，其熔解曲線峰單一，因此引物特異性能夠滿足試驗驗的要求。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，PK2 mRNA在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中均有表達，性成熟后期組和老年期組的表達量高，幼年期組與性成熟初期組表達量低，且差異顯著(P<0.05)，性成熟后期組與老年期組之間表達量無顯著性差異(P>0.05)，同樣幼年期組與性成熟初期組之間表達量也無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

上圖為PK2產(chǎn)物電泳分析；下圖為β-actin產(chǎn)物電泳分析。M.DL2000 DNA Marker；1.幼年期組；2.性成熟初期組；3.性成熟后期組；4.老年期組

1.相同小寫字母之間表示差異不顯著(P>0.05)；2.不同小寫字母之間表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 IHC檢測PK2在不同發(fā)育階段牦牛睪丸中的表達定位IHC結(jié)果顯示，PK2蛋白在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中均有表達，且性成熟初期組、性成熟后期組和老年組的陽性表達細胞種類較幼年組多。在1歲幼年期組中，可觀察到已有少量精子細胞和精子出現(xiàn)，且PK2主要分布在精子細胞及精子中，在其他細胞中幾乎不表達(圖3A)。PK2蛋白在性成熟初期牦牛睪丸中主要表達在精子細胞、精子、初級精母細胞及次級精母細胞中(圖3B)，性成熟后期組與老年期組表達部位與性成熟初期組相同(圖3C，D)，表明隨著性成熟的發(fā)生，PK2陽性表達的生精細胞的種類與數(shù)量增多。

A.幼年期組；B.性成熟初期組；C.性成熟后期組；D.老年期組；E.幼年期組陰性對照；F.性成熟初期組陰性對照；G.性成熟后期組陰性對照；H.老年期組陰性對照。CST.生精小管；RS.精子細胞；LC.間質(zhì)細胞；SC.支持細胞；PS.初級精母細胞；S.精原細胞；SS.次級精母細胞；Sp.精子

2.3 Western blot檢測不同發(fā)育階段牦牛睪丸中PK2蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示，PK2蛋白在各時期組中存在表達差異(圖4)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PK2蛋白在不同發(fā)育階段牦牛睪丸中均有表達，幼年期為低表達，其他3個時期為高表達，其表達趨勢為隨著年齡變化先升高，后維持在高水平表達(圖5)。在幼年期牦牛睪丸中PK2蛋白的表達量顯著低于性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸(P<0.05)，且在性成熟初期、性成熟后期及老年期3組間的表達量差異不顯著(P>0.05)。

1.幼年期組；2.性成熟初期組；3.性成熟后期組；4.老年期組

圖5 PK2蛋白在牦牛睪丸發(fā)育各階段中的表達

3 討論

PK2在哺乳動物睪丸、前列腺組織中均有表達并參與維持其正常的生理功能[13]。XIN等[14]建立了PK2敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除PK2后的小鼠基本上喪失了生育能力，雄鼠的睪丸發(fā)育障礙；MATSUMOTO等[15]提出敲除PK2的雄性小鼠因GnRH分泌異常導(dǎo)致生精小管缺乏管腔、精母細胞和精子細胞缺失；SAMSON等[16]認為,PK2有助于調(diào)節(jié)睪丸內(nèi)外激素的運輸，故PK2的缺失會對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生直接損害，而且也可通過影響激素的分泌及運輸過程使其出現(xiàn)障礙。WECHSELBER等[17]指出，PK2 mRNA的表達主要局限于睪丸，且通過原位雜交表明，其主要表達于第Ⅶ～Ⅸ期的初級精母細胞。鄭加翠[18]指出，PK2蛋白主要表達在人睪丸間質(zhì)細胞中。而在本試驗中發(fā)現(xiàn)1歲幼年期牦牛睪丸中已經(jīng)可以出現(xiàn)各級生精細胞，這與朱俊峰等[19]的試驗結(jié)果相符。IHC結(jié)果顯示，PK2蛋白在幼年期牦牛睪丸內(nèi)主要表達在精子細胞及精子中，而在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸中除在精子中表達外，也在其他各級生精細胞中表達，這與鄭加翠等的研究結(jié)果不一致。LECOUTER等[10]指出，缺氧可誘導(dǎo)PK2的表達量上調(diào)；同時，WECHSELBER等[17]推測，PK2蛋自儲存在精母細胞中，只在成熟精子中發(fā)揮作用，PK2蛋白在不同動物睪丸中表達部位不一致的主要原因可能是由于物種差異引起，但具體的原因仍需進一步研究。

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在幼年期及性成熟初期牦牛睪丸中PK2 mRNA表達水平較低，而在性成熟后期及老年期牦牛睪丸組織中表達水平較高，表明其mRNA表達水平與性成熟程度密切相關(guān)。有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生2周后，睪丸開始產(chǎn)生初級精母細胞，此時僅能檢測到少量PK2 mRNA的表達[17]；而出生3周后的小鼠睪丸開始出現(xiàn)粗線期晚期和雙倍體期的精母細胞，此時睪丸中PK2 mRNA表達水平顯著升高，此后一直處于高水平表達[17]，這與本研究結(jié)果趨勢相符。本試驗結(jié)果表明，PK2蛋白在不同階段牦牛睪丸中表達趨勢與其mRNA表達趨勢大體相同，即在幼年期低表達，性成熟后期及老年期高表達。值得注意的是在性成熟初期時PK2蛋白表達量已經(jīng)達到較高水平，而PK2 mRNA在同時期仍處于較低水平。近年來基因組計劃研究表明，基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中絕大多數(shù)為非編碼RNA，按功能可分為調(diào)節(jié)性非編碼RNA及非調(diào)節(jié)性非編碼RNA[20]。LncRNA作為非編碼RNA的一種，可通過堿基互補配對抑制或者上調(diào)mRNA的表達水平，從而參與機體生理與病理過程的調(diào)節(jié)[21]。楊花等[22]提出，在性成熟前后湖羊的 53 個差異表達 lncRNA 對雄性生殖和睪丸發(fā)育具有潛在作用。何其杰等[23]發(fā)現(xiàn)，存在于大足黑山羊睪丸支持細胞中的1ncRNA WNT3-IT，可以通過正向調(diào)控支持細胞中WNT3的表達，調(diào)節(jié)支持細胞在G0/G1期增殖活性，進而影響支持細胞的增殖能力，并在睪丸發(fā)育后期的精子發(fā)生與支持細胞分化過程中起重要作用。在性成熟初期牦牛睪丸組織中PK2 mRNA與蛋白可能與WNT3蛋白存在相同或類似的生理作用，但具體的機制仍需進一步確定。

LECOUTER等[10]以腺病毒為載體，將PK2遞送到小鼠睪丸導(dǎo)致了明顯的血管生成反應(yīng)。PK2已被確定為是一種有效的血管生成因子，可以通過Gaq/Ga13信號通路促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，并在一定程度上調(diào)節(jié)睪丸的生殖功能[18,24]；由于PK2基因的表達模式與睪丸的成熟密切相關(guān)[17]，且在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸中精子與血管生成趨于穩(wěn)定[25]，PK2在性成熟后期及老年期的高表達量在此得到了驗證。此外，WECHSELBER 等[17]提出 PK2可能在減數(shù)分裂和精子形成前的最后一次DNA復(fù)制中起自分泌或旁分泌信號分子的作用；LI等[6]指出,PK2/PKR1信號通路在生理條件下與精子發(fā)生有關(guān)，并推測PK2可能在精子成熟時進行蛋白水解并釋放，同時參與精子形成最后階段的生理過程。由此推測PK2在牦牛睪丸的發(fā)育過程中起著重要作用，但其具體參與的生理過程及其機制仍需進一步的探索。

PK2在各發(fā)育階段的牦牛睪丸組織中均有表達，且在幼年期牦牛睪丸中主要表達在精子細胞及精子中，在性成熟初期、性成熟后期及老年期牦牛睪丸中也表達于初級精母細胞和次級精母細胞中。PK2蛋白及mRNA表達量隨牦牛年齡變化而呈現(xiàn)先升高并維持在較高水平的趨勢，即在幼年期處于低表達水平，而在性成熟后期及老年期的牦牛睪丸組織中維持在高表達水平，僅在性成熟初期中其mRNA與蛋白的表達量不同，提示PK2參與了牦牛睪丸的發(fā)育過程，促進了精子的發(fā)生，為后期研究其在牦牛睪丸中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。