蝦青素對豬卵母細胞體外成熟的影響

許建春，汪浩鑫，自永宏，楊小芬，閆 茜，陳夢佳，石德順，陸鳳花

(廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧530004)

卵母細胞體外成熟是進行體外胚胎生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對胚胎生物技術(shù)的發(fā)展起著重要的作用。目前，卵母細胞體外成熟技術(shù)存在成熟率低和發(fā)育能力差等諸多問題，極大地阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，體外成熟的卵母細胞往往會出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象。這可能是因為在體外培養(yǎng)的卵母細胞對外界環(huán)境變化敏感，且離體培養(yǎng)的環(huán)境與內(nèi)部環(huán)境之間存在一定差異，比如體外環(huán)境產(chǎn)生的活性氧、培養(yǎng)液成分、O2濃度、光照、溫度和pH值等都會影響卵母細胞正常發(fā)育[1-4]。卵母細胞的質(zhì)量與胚胎發(fā)育潛能存在密切聯(lián)系，高質(zhì)量的卵母細胞有利于正常受精及胚胎后續(xù)發(fā)育[5]。在眾多影響卵母細胞體外成熟質(zhì)量的因素中，導(dǎo)致卵母細胞體外發(fā)育能力改變的一個重要因素就是活性氧(ROS)的產(chǎn)生?；钚匝踝鳛橹饕拇傺趸瘎?，可以導(dǎo)致DNA損傷、線粒體功能障礙、脂質(zhì)過氧化等，從而使卵母細胞質(zhì)量下降，阻礙其后續(xù)發(fā)育。因此，如何提高卵母細胞成熟質(zhì)量顯得格外重要。蝦青素是一種紅色的類胡蘿卜素，對多種細胞系具有抗氧化和抗炎作用，可以抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和一些相關(guān)疾病的發(fā)生。蝦青素可以保護線粒體免受內(nèi)源性氧自由基的侵害，保持其氧化還原能力，從而提高其能量產(chǎn)生效率。蝦青素在牛卵母細胞體外成熟中和其他細胞系上的研究有見報道。然而，蝦青素對豬卵母細胞體外成熟效果的影響報道較少。本研究主要通過在豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基中添加一定濃度的蝦青素，以探討其對豬卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育的影響，以期提高卵母細胞的體外成熟效率和囊胚的質(zhì)量，為豬卵母細胞和胚胎體外培養(yǎng)體系的完善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及液體配制組織培養(yǎng)液(TCM199)和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；蝦青素購自成儀睿有限公司；活性氧檢測試劑盒(S0033)和總谷胱甘肽檢測試劑盒(S0052)購自碧云天生物技術(shù)公司；丙二醛檢測試劑盒(WLA048)購自萬類生物；卵母細胞洗液為CCM液(TCM199+5 mmol/L NaHCO3+5 mmol/L Hepes+3%發(fā)情牛血清(OCS))；胚胎培養(yǎng)液(4.75 g TCM-199+13.1 mmol/L NaHCO3+30 mg/L 青霉素+50 mg/L 鏈霉素+2.5 mmol/L Hepes+12.5 mL FBS)，攪拌均勻后調(diào)pH值為7.2～7.4；豬卵母細胞成熟液為PM液；胚胎培養(yǎng)液為NCSU-23液參照文獻[6]配制；離子霉素溶液(胚胎培養(yǎng)液+5 μmol/L 離子霉素)和6-DMAP溶液(胚胎培養(yǎng)液+2 mmol/L 6-DMAP)等均添加60 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，并用0.22 μm微孔濾膜過濾器除菌。微量反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量試劑購自ABclonal公司。

1.2 豬卵母細胞的收集豬卵巢取自南寧市屠宰廠，將其置于盛有25～30℃生理鹽水的保溫瓶中，確保4 h內(nèi)送達實驗室。去除卵巢周圍的脂肪組織后，用注射器抽取直徑2～6 mm卵泡的卵泡液，將卵泡液置于60 mm玻璃皿中，在體視顯微鏡下挑出卵丘卵母細胞復(fù)合體(COCs)，用卵母細胞清洗液清洗干凈，只選取卵丘細胞層完整和胞質(zhì)均勻的卵母細胞進行后續(xù)試驗。

1.3 卵母細胞的成熟培養(yǎng)挑選含有3層及以上卵丘細胞包被的折光性良好的COCs，采用微滴培養(yǎng)體系(含10 IU/mL hCG+10 IU/mL PMSG)并且含有不同濃度蝦青素(0，5，10，20，40 μmol/L)的PM液培養(yǎng)。20～22 h后換成不含激素的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20～22 h至細胞成熟，統(tǒng)計第一極體排出率。

1.4 孤雌胚胎的激活與培養(yǎng)孤雌胚胎采用化學(xué)法激活，成熟的卵母細胞經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶處理，去除周圍包裹的卵丘細胞。挑選排出第一極體和胞質(zhì)均勻的卵母細胞，將裸卵置于5 μmol/L的離子霉素溶液中培養(yǎng)5 min，轉(zhuǎn)移卵母細胞至2 mmol/L 6-DMAP 溶液中繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h，然后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)盤中微滴培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計卵裂率，6～8 d統(tǒng)計囊胚率。

1.5 活性氧染色、總谷胱甘肽含量和丙二醛含量測定根據(jù)統(tǒng)計的第一極體排出率、卵裂率和囊胚率，選出最適處理濃度進行以下試驗。成熟培養(yǎng)后的COCs去除卵丘細胞后，PBS清洗3遍。一部分細胞轉(zhuǎn)移到含10 μmol/L DCFH-DA的PBS中，37℃避光孵育30 min。孵育后將細胞轉(zhuǎn)移至CCM液滴中，熒光顯微鏡下拍照。谷胱甘肽含量的測定參考文獻[7]操作方法進行。丙二醛含量的測定參考試劑盒說明書進行操作。

1.6 囊胚Hoechst33342染色收集第6～7天的囊胚，在不含Ca2+、Mg2+的PBS中清洗2～4遍，4%多聚甲醛(PFA)固定1 h，然后將囊胚轉(zhuǎn)移至10 g/L Hoechst33342染色工作液中，室溫條件下避光孵育10～20 min，孵育結(jié)束后用不含Ca2+、Mg2+的PBS清洗2～4遍，將染料清洗干凈。取載玻片，并在中央滴加約1 μL的抗猝滅劑，放入1枚囊胚，在蓋玻片四周涂上1圈凡士林，壓片，熒光顯微鏡下觀察染色情況，并統(tǒng)計細胞數(shù)。

1.7 實時熒光定量PCR收集對照組和處理組不同時期的早期胚胎，將其分別移入裝有細胞裂解液的EP管中，于-80℃冰箱保存。微量反轉(zhuǎn)錄試驗按照試劑盒說明書進行操作，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用SYBR Green PCR試劑盒進行qRT-PCR檢測，反應(yīng)體系：2×SYBR GreenⅠMaster 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃60 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。引物是根據(jù)GenBank公布的豬胚胎抗氧化酶相關(guān)基因GPX4和SOD1的mRNA序列設(shè)計,引物信息見表1。最終使用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計分析用Image J軟件對細胞活性氧和Hoechst染色的結(jié)果進行量化統(tǒng)計，采用SPASS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，所有試驗至少重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度蝦青素對卵母細胞體外成熟的影響卵母細胞在添加不同濃度(0,5,10,20,40 μmol/L)蝦青素的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)40～44 h后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，蝦青素處理組的第一極體排出率均有顯著提高(P<0.05)，其中10 μmol/L處理組的第一極體排出率顯著高于其他濃度處理組(P<0.05)(表2)。

表2 蝦青素對豬卵母細胞第一極體排出率的影響

2.2 成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度蝦青素對孤雌胚胎發(fā)育效果的影響對不同濃度蝦青素處理的MⅡ期卵母細胞進行孤雌激活處理，培養(yǎng)160～168 h后統(tǒng)計卵裂率和囊胚率(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(0 μmol/L)相比，5，10，20 μmol/L處理組的卵裂率顯著升高(P<0.05)，40 μmol/L處理組的卵裂率有提高但無顯著性差異(P>0.05)；10，20 μmol/L處理組的囊胚率顯著高于對照組(P<0.05)，5，40 μmol/L 處理組的囊胚率有升高，但差異不顯著(P<0.05)；其中10 μmol/L處理組的第一極體排出率和囊胚率顯著高于其他處理組，綜合考慮，我們選擇10 μmol/L的濃度進行后續(xù)試驗。

表3 蝦青素對豬孤雌激活胚胎發(fā)育的影響

2.3 成熟液中添加10 μmol/L蝦青素對MⅡ期卵母細胞抗氧化能力的影響為了解蝦青素對卵母細胞抗氧化能力的影響，我們對MⅡ期的卵母細胞進行了活性氧染色、丙二醛和谷胱甘肽檢測(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，10 μmol/L處理組卵母細胞的活性氧水平和丙二醛含量極顯著降低(P<0.01)，谷胱甘肽含量顯著升高(P<0.05)。

A.活性氧染色(標(biāo)尺：200 μm)；B.總谷胱甘肽含量檢測；C.丙二醛含量檢測。**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.4 成熟培養(yǎng)液中添加10 μmol/L蝦青素對孤雌囊胚細胞數(shù)的影響使用10 μmol/L蝦青素處理卵母細胞40～44 h后，對成熟的卵母細胞進行孤雌激活，使用Hochest33342染色法統(tǒng)計囊胚細胞數(shù)。結(jié)果如圖2所示，10 μmol/L處理組的囊胚細胞數(shù)極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖2 蝦青素處理對囊胚細胞數(shù)的影響(標(biāo)尺：200 μm)

2.5 成熟培養(yǎng)液中添加10 μmol/L蝦青素對胚胎發(fā)育過程中抗氧化酶相關(guān)基因表達的影響實時熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖3)，與對照組相比，GPX4基因在10 μmol/L處理組中MⅡ期卵母細胞中的表達顯著升高(P<0.05)，在囊胚期的表達也有升高。SOD1基因在10 μmol/L處理組中MⅡ期卵母細胞、4-細胞和囊胚期的表達極顯著高于對照組(P<0.01)。

*表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

體外培養(yǎng)系統(tǒng)的氣相環(huán)境對卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育起著關(guān)鍵的作用。氧氣作為體外培養(yǎng)系統(tǒng)氣相環(huán)境的因素之一，對胚胎新陳代謝和發(fā)育很重要。在體外20%氧氣濃度遠遠高于體內(nèi)的低氧環(huán)境，過高的氧氣濃度會產(chǎn)生高濃度的活性氧和其他自由基，對卵母細胞造成氧化應(yīng)激[8]。ROS是細胞內(nèi)活性含氧化合物的總稱，作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信使，參與了多種增殖和分化等細胞活動，但當(dāng)ROS產(chǎn)生超過細胞的抗氧化能力時則會造成氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體損傷，可導(dǎo)致酶類失活、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、ATP消耗和線粒體功能紊亂。研究表明，氧化應(yīng)激與卵母細胞質(zhì)量下降、體外受精率降低和妊娠率降低有著密切聯(lián)系[9-12]。針對這一問題，科研人員通過在培養(yǎng)基中添加酶類或非酶類的抗氧化劑，能夠有效降低卵母細胞氧化應(yīng)激損傷，提高卵母細胞的成熟質(zhì)量和后續(xù)的胚胎發(fā)育[13-15]。蝦青素是一種類胡蘿卜素，主要來源于藻類和微生物，具有很強的抗氧化活性。此外蝦青素還具有抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用[16-17]。然而，蝦青素是否影響卵母細胞的體外成熟和胚胎發(fā)育卻鮮有報道。本試驗通過在成熟液中添加不同濃度的蝦青素，處理44 h后發(fā)現(xiàn)其可以提高卵母細胞的第一極體排出率、分裂率和囊胚率，其中以10 μmol/L蝦青素處理組效果顯著，說明適當(dāng)濃度的蝦青素有利于豬卵母細胞的體外成熟和后續(xù)的胚胎發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素處理可降低組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性[18]。與其他的抗氧化劑相比，蝦青素有更強的去除自由基能力，同時還可有效降低過氧化氫刺激引起的細胞凋亡[19-20]。本試驗結(jié)果表明，10 μmol/L 蝦青素可以極顯著降低卵母細胞內(nèi)的活性氧水平和丙二醛含量，顯著提高總谷胱甘肽的含量，進一步說明了蝦青素能夠降低卵母細胞內(nèi)活性氧水平，改善卵母細胞的成熟質(zhì)量。

總之，在豬卵母細胞體外成熟液中添加適量的蝦青素能有效降低卵母細胞內(nèi)活性氧水平和丙二醛含量，提高總谷胱甘肽含量并促進抗氧化酶相關(guān)基因的表達，進而提高卵母細胞成熟的質(zhì)量及其后續(xù)孤雌胚胎的發(fā)育能力。