大腸桿菌裂解性噬菌體生物學(xué)特性及其解聚酶活性驗(yàn)證

呂金暉，于詩筠，喻鑫婷，張雅倩，崔玉軍，黃海龍，米志強(qiáng)*，張加力*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)可引起禽類的大腸桿菌病，呈現(xiàn)局部或全身感染。APEC可以誘發(fā)不同的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為急性敗血癥、輸卵管炎、亞急性心包炎、氣囊炎和肝周炎等等[1]。對于不同的養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖環(huán)境，禽大腸桿菌病的病死率為10%～90%，對禽養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失較大[2]。為了防制養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌感染，養(yǎng)殖戶們經(jīng)常超劑量使用抗生素，致使細(xì)菌耐藥情況不容樂觀。從世界各地關(guān)于畜禽養(yǎng)殖中大腸桿菌耐藥性的報道情況來看，對臨床常見的如氨芐青霉素、復(fù)方新諾明、阿莫西林、鏈霉素、四環(huán)素等都普遍存在耐藥性，并且出現(xiàn)了較多的多重耐藥株[3]。在細(xì)菌耐藥如此嚴(yán)峻的情況下，尋找抗生素替代物迫在眉睫。

噬菌體是能夠感染細(xì)菌的病毒，是自然界中數(shù)量最為龐大的微生物，約為細(xì)菌總數(shù)的10倍[4]。隨著噬菌體治療的興起，許多噬菌體治療Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示噬菌體不存在顯著的不良反應(yīng)問題，但噬菌體制劑的穩(wěn)定性較差，存在噬菌體滴度顯著下降的情況[5]。同時，噬菌體與致病菌共同進(jìn)化也會導(dǎo)致抗菌作用下降等問題[6]。因此，一部分人探索噬菌體治療的方向逐漸偏向了噬菌體編碼的抗菌蛋白。盡管噬菌體編碼的蛋白同樣也只能靶向特定細(xì)菌，但是更具有穩(wěn)定性和安全性，具有一定的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)分離到1株大腸桿菌裂解性噬菌體，對其高通量測序后預(yù)測解聚酶的基因，對該噬菌體解聚酶克隆表達(dá)后用苯酚硫酸法以及解聚酶聯(lián)合血清殺菌試驗(yàn)驗(yàn)證其活性,為抗生素替代物提供了一個新的選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株來源大腸桿菌分離自吉林省長春市某養(yǎng)殖場病雞的肝臟，分離得到的菌株在麥康凱瓊脂鑒別培養(yǎng)基挑選符合大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)的菌落(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌菌落顏色呈粉紅色)純化3次得到APEC，命名為E.coli111。純化后的菌株使用High Pure Viral RNA Kit試劑盒提取大腸桿菌基因組，并進(jìn)行全基因組測序，將拼接后的測序數(shù)據(jù)上傳至Center for Genomic Epidemiology(http://genomicepidemiology.org/)網(wǎng)站SpeciesFinder預(yù)測菌種，SeroTypeFinder預(yù)測大腸桿菌血清型，VirulenceFinder預(yù)測毒力基因。預(yù)測結(jié)果為埃希菌屬(Escherichia)大腸桿菌科(Escherichiacoli)成員，血清型為O78:H4,含有iutA、irp2、iss、fyuA、iroN、ompT等常見的毒力基因。菌種保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)-80℃超低溫冰箱和軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所-80℃超低溫冰箱各1份。

1.2 主要試劑和儀器以及培養(yǎng)基LB 液體培養(yǎng)基和 LB 固體培養(yǎng)基(含瓊脂粉)：胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉(OXOID,英國)、氯化鈉(Solarbio,中國)；麥康凱瓊脂(OXOID,英國)；PBS緩沖液(Solarbio，中國)；0.22 μm微孔過濾器(Pall Corporation,美國)；High Pure Viral RNA Kit(Roche Diagnostics,美國)；Qubit 2.0熒光計(jì)(賽默飛，美國);Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞和 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國)；Ni-NTA-Sefinose Column(Sangon Biotech，中國)；透析袋(Viskase，中國)、濃硫酸(滬試，中國)、苯酚(國藥，中國)。

1.3 噬菌體分離大腸桿菌E.coli111接種至LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3～4 h后，達(dá)到對數(shù)生長期，與待分離的污水混合后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，0.22 μm濾膜過濾培養(yǎng)液后得到噬菌體原液。利用雙層平板法得到單獨(dú)的噬菌體，挑選帶有暈環(huán)的噬菌體(噬菌體尾絲蛋白中解聚酶降解細(xì)菌表面多糖后會在噬菌斑的周圍形成半透明的暈環(huán))進(jìn)行單斑純化，純化后的噬菌體命名為vB_EcoM-P111。

1.4 噬菌體一步生長曲線測定測定噬菌體效價和宿主菌的數(shù)量后將噬菌體和宿主菌按照感染復(fù)數(shù)為0.01的比例進(jìn)行混合，37℃恒溫箱靜置孵育5 min，使噬菌體充分吸附于宿主菌上，隨后10 000 r/min離心2 min去除上清液中未吸附的噬菌體。用等體積的LB液體培養(yǎng)基洗滌1次,棄去上清液，再用等體積的 LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，分別在0,5,10,15,20,30,40,50,60,90,120,150 min時取樣1次，每次取100 μL，用雙層平板法估算不同時間點(diǎn)噬菌體vB_EcoM-P111的數(shù)量。最后，以時間為橫坐標(biāo)，噬菌體數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體vB_EcoM-P111感染大腸桿菌E.coli111的一步生長曲線。

1.5 噬菌體全基因組測序及其解聚酶的預(yù)測用High Pure Viral RNA Kit試劑盒提取噬菌體基因組，Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行全基因組測序。將測序得到的數(shù)據(jù)用SPAdes-3.13.0軟件進(jìn)行拼接,軟件拼接結(jié)束后形成FASTA文件，在CLC Genomics Workbench 3.6.1軟件查看拼接結(jié)果。將拼接的結(jié)果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上進(jìn)行在線比對，將比對結(jié)果為噬菌體基因的序列上傳至RAST(http://rast.nmpdr.org/)網(wǎng)站預(yù)測開放閱讀框(open reading frame,ORF)。在Pfam(http://pfam.xfam.org/)中，通過與pfam蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白的比較，預(yù)測ORF的結(jié)構(gòu)域，找到可能具有解聚酶活性的ORF。預(yù)測結(jié)果表明該噬菌體解聚酶可能為ORF70，命名為Dpo70。

1.6 解聚酶Dpo70的克隆、表達(dá)、純化及活性的初步驗(yàn)證以噬菌體vB_EcoM-P111基因組為模板設(shè)計(jì)引物Dpo70_F(5′-TAGGATCCATGGCAATTTATGACTTAGG-3′)和Dpo70_R(5′-GGCTC-GAGTTAAATTAATCCATAAATTAC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pET-28a質(zhì)粒上。Sanger測序鑒定目的片段是否正確連接后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h 后，挑取單克隆菌落接種至5 mL含有卡納霉素 的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)期(D600 nm=0.4～0.6)時加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)，25℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)18 h。將菌液10 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用PBS緩沖液重懸。重懸后的菌液冰上超聲，10 000 r/min離心5 min后得到含有解聚酶的上清液，0.22 μm的濾膜將上清液過濾，用Ni-NTA-Sefinose Column(Ni-柱)純化濾液。Ni-柱洗脫液裝在截留相對分子質(zhì)量(MWCO)為8 000～14 000的透析袋內(nèi)，用磷酸鹽緩沖液透析24 h，得到純化的解聚酶，-80℃超低溫保存。SDS-PAGE凝膠電泳鑒定純化后的解聚酶Dpo70。

用點(diǎn)板的方式初步驗(yàn)證解聚酶活性，具體步驟如下：挑取大腸桿菌E.coli111單克隆置于LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3～4 h，至D600 nm約為0.4。取500 μL菌液與4.5 mL LB半固體培養(yǎng)基混合均勻，除去氣泡后均勻地倒在LB固體培養(yǎng)基表面。上層半固體凝固后，取2 μL 破碎菌液的上清液滴于細(xì)菌表面，待液體完全吸收后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，若次日平板上有半透明暈環(huán)產(chǎn)生，表明該蛋白具有解聚酶活性。

1.7 解聚酶Dpo70對大腸桿菌表面多糖(LPS)的降解作用本試驗(yàn)使用水飽和酚(pH6.6)和氯仿提取純化E.coli111大腸桿菌表面多糖，試驗(yàn)方法主要參考文獻(xiàn)[7]改良后的熱水-酚法。試驗(yàn)共分為4組，第1組為150 μL多糖提取物和150 μL PBS緩沖液的混合物；第2組為150 μL多糖提取物與150 μL滅活解聚酶Dpo70(煮沸10 min)的混合物；第3組為150 μL多糖提取物與150 μL 10 mg/L解聚酶Dpo70的混合物；第4組為150 μL 10 mg/L解聚酶Dpo70和150 μL PBS緩沖液。將4組混合液同時在37℃的金屬浴中孵育1 h，將孵育后的4組混合物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，銀染觀察Dpo70對表面多糖的降解作用。

1.8 解聚酶Dpo70特異性降解大腸桿菌表面多糖測定大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，取1 mL 菌液，10 000 r/min離心5 min，棄去上清，沉淀用等體積PBS緩沖液重懸，重復(fù)3次。得到的E.coli111(宿主菌)和E.coli47(非宿主菌)的沉淀重懸于1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/L的解聚酶Dpo70；同時取1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/L的滅活解聚酶Dpo70作為對照蛋白重懸E.coli111的菌體沉淀。各組在37℃金屬浴中孵育1 h后，10 000 r/min離心1 min。將1 mL上清液分別轉(zhuǎn)移至干燥的無菌試管中，分別加入0.5 mL 6%苯酚溶液，立即加入2.5 mL 濃硫酸并混勻，室溫靜置反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，將試管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀測定D490 nm值。

1.9 解聚酶Dpo70輔助血清對大腸桿菌的殺滅作用將健康猴的靜脈血1 000 r/min離心10 min，收集上層血清-80℃保存?zhèn)溆?。將對?shù)期的大腸桿菌E.coli111(D600 nm為0.4～0.6)、解聚酶Dpo70、猴血清以及PBS按照如表1所示的組合混勻。所有試驗(yàn)組均在37℃金屬浴中孵育1 h，隨后進(jìn)行梯度稀釋，各稀釋梯度取2 μL在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)板。待液體完全吸收后，將平板倒置于37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。

表1 解聚酶聯(lián)合血清殺滅宿主菌試驗(yàn) μL

2 結(jié)果

2.1 噬菌體vB_EcoM-P111基本生物學(xué)特性本試驗(yàn)從雞糞中分離得到1株裂解性噬菌體，雙層平板法將噬菌體單斑純化，重復(fù)3次，純化后噬菌體命名為vB_EcoM-P111。該噬菌體可以在含有宿主菌的雙層平板上形成透明噬菌斑，且噬菌斑周圍有一圈半透明暈環(huán)，培養(yǎng)12 h的噬菌斑暈環(huán)直徑為3～3.5 mm(圖1A)。隨著培養(yǎng)時間的延長，噬菌斑暈環(huán)的直徑會變大，培養(yǎng)36 h的噬菌斑暈環(huán)直徑為5.5～6.5 mm(圖1B)。鑒定噬菌體是否能產(chǎn)生解聚酶最直觀的方式就是觀察噬菌斑周圍是否有半透明暈環(huán)。

A.培養(yǎng)12 h噬菌斑形態(tài)；B.培養(yǎng)36 h噬菌斑形態(tài)

2.2 噬菌體的一步生長曲線噬菌體vB_EcoM-P111和大腸桿菌E.coli111以感染復(fù)數(shù)為0.01的比例進(jìn)行混合后，分別在0,5,10,15,20,30,40,50,60,90,120,150 min取樣估算噬菌體數(shù)量，以時間為橫坐標(biāo)，噬菌體數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體vB_EcoM-P111感染大腸桿菌E.coli111的一步生長曲線。如圖2所示，噬菌體vB_EcoM-P111感染大腸桿菌E.coli111的潛伏期小于5 min，在感染25 min后達(dá)到平臺期，平臺期噬菌體的數(shù)量為109～1010PFU/mL。

圖2 噬菌體vB_EcoM-P111一步生長曲線

2.3 噬菌體全基因組測序及其解聚酶的預(yù)測噬菌體vB_EcoM-P111測序結(jié)果經(jīng)SPAdes-3.13.0拼接后，得到1條全長為50 241 bp的環(huán)狀DNA序列。BLAST結(jié)果顯示，與Escherichiaphage P817(Sequence ID：MZ826699.1)最相近，屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)、Drexlerviridae科成員。通過RAST網(wǎng)站預(yù)測得到76個ORF，其中ORF70編碼的蛋白序列含有tail spike N結(jié)構(gòu)域,可能具有解聚酶活性。完整的基因組序列及注釋信息已提交至GenBank，登錄號為OL449681。

2.4 解聚酶的克隆、表達(dá)及純化結(jié)果以噬菌體vB_EcoM-P111為模板，Dpo70_F和Dpo70_R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶在2 000～3 000 bp之間，與ORF70堿基序列預(yù)測長度(2 406 bp)基本一致(圖3A)。通過雙酶切將目的片段連接到pET28a質(zhì)粒上，Sanger測序確定目的片段已正確連接到質(zhì)粒上。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)解聚酶Dpo70大量表達(dá)，超聲破碎細(xì)菌后解聚酶Dpo70釋放至上清液中。Ni-NTA-Sefinose Column(Ni-柱)純化解聚酶Dpo70，SDS-PAGE凝膠電泳鑒定超聲后蛋白上清液和純化解聚酶Dpo70的蛋白條帶(圖3B)。點(diǎn)板法初步驗(yàn)證解聚酶活性結(jié)果如圖3C，解聚酶Dpo70可以在宿主菌E.coli111的半固體平板上形成半透明的暈環(huán)，表明該蛋白具有解聚酶活性。

A.PCR擴(kuò)增Dpo70基因；B.解聚酶Dpo70的表達(dá)與純化；C.解聚酶Dpo70蛋白活性初步驗(yàn)證。M1.DNA Marker；A1.Dpo70基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M2.蛋白Marker；B1.含重組質(zhì)粒pET28a-Dpo70的BL21(DE3)超聲后含蛋白上清液；B2.Ni-柱純化的解聚酶Dpo70

2.5 硝酸銀染色觀察解聚酶Dpo70降解大腸桿菌表面多糖水飽和酚提取過夜培養(yǎng)大腸桿菌表面多糖在液體中呈現(xiàn)淺黃色，SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)過硝酸銀染色可在泳道上看到棕色條帶。未處理的表面多糖和滅活解聚酶Dpo70處理過的表面多糖在SDS-PAGE凝膠的中上部，蛋白Marker 50～40 kDa 中間有明顯的較寬條帶；解聚酶Dpo70處理過的表面多糖則被降解，在SDS-PAGE凝膠的中下部分有較寬的條帶；解聚酶Dpo70由于上樣量小于30 ng，沒有條帶產(chǎn)生(圖4)。以上結(jié)果表明，大腸桿菌表面多糖可以被解聚酶Dpo70降解，并可以通過銀染的SDS-PAGE凝膠顯示。

M.蛋白Marker；1.未處理的表面多糖；2.表面多糖+滅活解聚酶Dpo70；3.表面多糖+解聚酶Dpo70；4.未處理解聚酶Dpo70

2.6 苯酚硫酸法檢測解聚酶Dpo70降解大腸桿菌表面多糖解聚酶Dpo70和PBS重懸的E.coli111(宿主菌)和E.coli47(非宿主菌)在37℃孵育，通過苯酚硫酸法鑒定大腸桿菌表面多糖的降解情況。大腸桿菌表面多糖被解聚酶降解后，會釋放多糖至上清液中，通過離心可將其釋放的多糖與菌體進(jìn)行分離，濃硫酸水解上清中的多糖并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚生成橙黃色化合物，橙黃色化合物在D490 nm處有吸收峰，可通過光密度值來判斷上清中糖的相對濃度。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)制作柱狀圖(圖5)，從柱狀圖中可以看出解聚酶Dpo70可特異性的降解E.coli111(宿主菌)表面的多糖D490 nm值為0.759±0.017，并釋放至上清液中，而對于非宿主菌(以E.coli47為例)，解聚酶Dpo70則不能降解其表面的多糖D490 nm值為0.121±0.001。同時，滅活的解聚酶對于E.coli111(宿主菌)表面多糖也不會產(chǎn)生降解作用(D490 nm值為0.116±0.001)，排除了E.coli111自身釋放表面多糖的可能性，以上結(jié)果表明解聚酶Dpo70對于E.coli111(宿主菌)表面多糖的降解作用是特異的(P<0.000 1)。

圖5 苯酚硫酸法檢測解聚酶Dpo70特異性降解大腸桿菌表面多糖

2.7 解聚酶Dpo70輔助血清對大腸桿菌的殺滅作用宿主菌E.coli111經(jīng)過高通量測序，得到的測序結(jié)果拼接后上傳至Center for Genomic Epidemiology網(wǎng)站(http://genomicepidemiology.org/)預(yù)測其毒力基因。結(jié)果顯示，大腸桿菌E.coli111含有iss毒力基因，該基因會使菌株具有抗血清補(bǔ)體溶菌作用的能力。如圖6A所示，本試驗(yàn)所用的E.coli111同時與解聚酶Dpo70和25%血清混合物經(jīng)37℃孵育1 h后，存活的宿主菌E.coli111的數(shù)量幾乎為零，表明在解聚酶Dpo70的輔助下25%血清對于大腸桿菌E.coli111的殺滅作用基本上達(dá)到了100%；而解聚酶Dpo70與宿主菌E.coli111對照組(圖6B)、宿主菌E.coli111在與25%血清對照組(圖6C)經(jīng)37℃孵育1 h后，宿主菌E.coli111的存活數(shù)量與宿主菌E.coli111對照組(圖6D)基本持平。

圖6 解聚酶Dpo70提高血清對大腸桿菌的殺滅作用

3 討論

噬菌體是一類可以感染細(xì)菌等微生物的病毒，具有很強(qiáng)的專一性。噬菌體存在的意義在于調(diào)控菌群的數(shù)量，裂解性噬菌體可以控制其宿主菌的過度擴(kuò)張。溶源性噬菌體通過將自身DNA整合到細(xì)菌染色體來改變宿主菌的遺傳信息，從而進(jìn)行耐藥或毒力基因的傳遞[8]。裂解性噬菌體感染的第一步使噬菌體尾相關(guān)蛋白(tail fiber 或者 tail spike proteins簡稱TSPs)與宿主菌上的受體特異性結(jié)合，大多數(shù)情況下，噬菌體只感染特定血清型的宿主菌[9]。噬菌體吸附宿主菌后，將基因組注入宿主菌體內(nèi)，利用宿主菌的原料合成自身基因組和蛋白并完成組裝，最后由裂解酶將宿主菌細(xì)胞壁水解，釋放出子代噬菌體[10]。而溶原性噬菌體將自身基因組作為原噬菌體整合到宿主染色體中，進(jìn)行同步復(fù)制，部分RNA噬菌體可能以游離的低拷貝的質(zhì)粒形式存在[11]。噬菌體除了這2種常見的生存方式，還有慢性感染(子代噬菌體顆粒通過宿主菌的膜不斷排到環(huán)境中，但不會破壞宿主菌)、持續(xù)感染模式(噬菌體顆粒產(chǎn)生并積累在宿主的細(xì)胞質(zhì)中，不釋放到細(xì)胞外環(huán)境中)和偽溶源性感染(噬菌體發(fā)育處于停滯階段，未整合的噬菌體基因組在宿主菌分裂時不對稱的傳給子代細(xì)菌)等不同的感染模式[11]。但是目前關(guān)于噬菌體及其衍生物在對抗耐藥菌方面主要集中在裂解性噬菌體身上。

革蘭陰性菌的表面不僅有外膜，有些細(xì)菌表面還有一層較厚的莢膜多糖，其中的多糖成分可以保護(hù)細(xì)菌免受各種不利的外界的因素[12]，并且使其逃避免疫系統(tǒng)的吞噬和補(bǔ)體的殺滅作用。例如，部分大腸桿菌基因組中含有iss毒力基因。iss基因編碼的外膜蛋白會導(dǎo)致表面排斥，使菌株具有抗血清補(bǔ)體溶菌作用的能力，同時與大腸桿菌毒力有一定相關(guān)性[13]。編碼解聚酶的裂解性噬菌體在平板上感染宿主菌時，分泌的解聚酶就會降解細(xì)菌表面的多糖，由于其分泌量較大并且可以在瓊脂中擴(kuò)散，在培養(yǎng)基平板上就以半透明暈環(huán)的形式表現(xiàn)出來，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，解聚酶擴(kuò)散速度大于噬菌體生長的速度，半透明暈環(huán)的直徑也會隨之增大。而裂解性噬菌體編碼的解聚酶Dpo70和宿主菌E.coli111在37℃孵育后，解聚酶Dpo70降解宿主菌E.coli111表面多糖產(chǎn)生的還原糖可以被苯酚硫酸法識別到。另一方面，解聚酶Dpo70降解宿主菌E.coli111表面多糖后相當(dāng)于脫去了細(xì)菌表面的“保護(hù)罩”，雖然解聚酶不能直接對宿主菌產(chǎn)生殺滅作用，但是可以大幅度提高血清對其的殺滅作用。