新城疫、禽流感和禽腺病毒病三聯(lián)嵌合型病毒樣顆粒的構(gòu)建及鑒定

馮嘉軒，陳凱楠，李金斗，丁佳欣，陳銘樺，邵亞男，郭春紅，鄒映雪，丁 壯*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062；2.長春中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)強毒株引起的高度接觸性和致死性傳染病，分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示NDV在我國主要流行的基因型為基因Ⅶ型[1-2]；禽流感(avian influenza，AI)是由正黏病毒科、A型流感病毒屬中不同亞型流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的禽類病毒病，其中H9N2亞型禽流感已高度適應(yīng)禽類，分離率位于AIV各亞型之首[3]；禽腺病毒病(avian adenovirus disease)是由禽腺病毒(fowl adenoviruses，F(xiàn)AdV)引起的危害我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的主要動物疫病之一，其在我國主要流行株是Ⅰ群血清4型FAdV[4]。因此，預(yù)防和控制基因Ⅶ型ND、H9N2亞型AI和4型FAdV病對我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。但傳統(tǒng)疫苗的安全性、免疫原性、疫苗毒株與流行毒株基因不匹配的問題極大地限制了傳統(tǒng)疫苗的免疫保護(hù)效果及應(yīng)用前景，常規(guī)疫苗的升級和換代已成為行業(yè)發(fā)展亟需。NDV HN蛋白、AIV的HA蛋白和FAdV Fiber2蛋白已被發(fā)掘成為亞單位疫苗研發(fā)的靶點[5-7]，但亞單位疫苗無法刺激機體產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，針對胞內(nèi)寄生病毒的防控效力有限，因此提高HN、HA和Fiber2蛋白的免疫原性(尤其是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力)已成為ND、AI和FAdV病新型疫苗研發(fā)的核心突破點。

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒的1個或幾個結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的空心蛋白顆粒，不含有感染性遺傳物質(zhì)，表面可高密度的展現(xiàn)抗原蛋白，能刺激機體產(chǎn)生高效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，是新型疫苗研發(fā)的優(yōu)選靶點。NDV病毒樣顆粒(Newcastle disease virus like particles，ND VLPs)是以NDV的M蛋白為骨架、表面展示HN或F蛋白的有囊膜納米顆粒。已有研究表明，ND VLPs易被樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)識別及加工，經(jīng)TLR4/NF-κB信號通路誘導(dǎo)DC成熟及CCR7-CCL19/CCL21軸促進(jìn)DC遷移[8]，最終將抗原信息遞呈給T細(xì)胞，彌補了亞單位疫苗免疫原性不足的缺點。此外，本團(tuán)隊已開發(fā)并完善了ND VLPs載體平臺，成功將傳染性法氏囊病毒VP2蛋白、綿羊痘病毒P32蛋白和布魯菌BCSP31蛋白等展現(xiàn)在ND VLPs囊膜表面，所構(gòu)建的嵌合病毒樣顆粒疫苗可針對外源靶蛋白產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答并能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫應(yīng)答[9-10]。因此，本試驗擬基于ND VLPs載體平臺，以NDV的HN蛋白、AIV的HA蛋白和FAdV Fiber2蛋白為靶點，研發(fā)一種安全、高效且可“一針多防”的“新流腺”病毒樣顆粒疫苗候選株，以便科學(xué)防控ND、AI和FAdV病。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與載體Sf9昆蟲細(xì)胞、E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、穿梭質(zhì)粒pFastBac1均由本室凍存；rBV-NDV M、rBV-NDV HN和rBV-HA由本實驗室前期構(gòu)建及凍存；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑BamHⅠ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；X-treme GENEHP DNA Transfection Reagent購自瑞士羅氏公司；TransTaq?DNA聚合酶、T4DNA連接酶、羊抗兔IgG(H+L)-FITC抗體和pEASY?-Uni無縫克隆試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG-HRP購自ImmunoWay公司；FBS胎牛血清購自依科賽生物公司；昆蟲培養(yǎng)基Sf-900Ⅱ SFM購自Gibco公司；兔抗Fiber2蛋白多克隆抗體由本實驗室制備并保存。

1.3 基因合成及優(yōu)化為提高抗原蛋白的表達(dá)量，根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子偏好性對禽4型腺病毒HB1510株的Fiber2基因(GenBank登錄號：KU587519.1)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在基因起始密碼子前引入促進(jìn)mRNA翻譯的Kozac序列，改造后的序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 引物設(shè)計及合成根據(jù)密碼子優(yōu)化后的序列、pFastBac1序列、NDV NA-1株(GenBank登錄號：DQ659677.1)HN基因胞內(nèi)域及跨膜域序列和柔性肽Linker(G4S)3序列設(shè)計引物，引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.5 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建以rBV-ND HN基因組為模板，利用引物cFiber2-1F和cFiber2-2R擴增HN基因胞內(nèi)域、跨膜域及部分柔性肽序列，命名為cHN-GS；以密碼子優(yōu)化后的Fiber2基因為模板，利用引物cFiber2-3F和cFiber2-4R擴增含有剩余柔性肽序列的Fiber2基因，命名為cGS-Fiber2。采用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切pFastBac1空載體并回收線性化載體，按照無縫克隆試劑盒操作說明書將目的片段與線性載體進(jìn)行連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒rpFastBac1-cFiber2，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂板于含有100 mg/L Amp抗性篩選平板中，挑取單菌落利用cFiber2-1F和cFiber2-4R引物進(jìn)行PCR鑒定，并提取質(zhì)粒利用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定。

1.6 重組桿粒的篩選將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒rpFastBac1-cFiber2轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組桿粒rBmid-cFiber2，涂板于固體LB篩選平板(含100 mg/L X-gal、40 mg/L IPTG、20 mg/L Tet、30 mg/L GM和100 mg/L Kan)中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，挑取純凈白斑，利用M13通用引物和特異性引物(cFiber2-1F和cFiber2-4R)進(jìn)行鑒定；將鑒定正確的菌落再次劃線至固體LB篩選平板中，直至生長出的菌落全為白斑或PCR結(jié)果均為完全同源重組條帶。

1.7 重組桿狀病毒的拯救及鑒定

1.7.1重組桿狀病毒的拯救 參照桿粒提取方法[11]提取重組桿粒rBmid-cFiber2，測定濃度后-80℃ 保存?zhèn)溆?。將Sf9細(xì)胞鋪板于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%左右時開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體如下：將X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent室溫平衡15 min；在1.5 mL離心管中加入100 μL sf-900Ⅱ SFM培養(yǎng)基，加入2 μg的重組桿粒rBmid-cFiber2，重復(fù)混勻后加入6 μL轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫靜置20 min；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物小心滴加入至細(xì)胞孔中，置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96～120 h。收取第1代重組桿狀病毒rBV-cFiber2培養(yǎng)上清，取500 μL 加入至80%細(xì)胞密度的10 cm平板中，96～120 h后收取第2代重組桿狀病毒，按照2%的比例接種至昆蟲細(xì)胞中繼續(xù)盲傳。

1.7.2重組桿狀病毒的鑒定 參照基因組提取試劑盒說明書提取第3代重組桿狀病毒基因組，利用M13通用引物和特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，并利用間接免疫熒光試驗檢測蛋白表達(dá)情況：將Sf9細(xì)胞鋪板于含有細(xì)胞爬片的24孔板中，待細(xì)胞生長至80%～90%時，以MOI=1接種第3代重組桿狀病毒rBV-cFiber2,48 h后棄掉培養(yǎng)上清，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、0.1% Triton X-100通透、1% BSA溶液封閉、孵育兔抗Fiber2多克隆抗體、孵育羊抗兔IgG(H+L)-FITC抗體和DAPI染核后，利用熒光顯微鏡檢測結(jié)果。

1.8 “新流腺”三聯(lián)嵌合型cVLPs的組裝及鑒定將Sf9細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，待細(xì)胞密度生長至3×106/mL時，將桿狀病毒以MOI=5(rBV-M∶rBV-HN∶rBV-HA∶rBV-cFiber2=3∶1∶1∶1)共感染至懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞中構(gòu)建“新流腺”三聯(lián)嵌合型病毒樣顆粒(ND-AI-FAdV4 cVLPs)，72 h后收集細(xì)胞上清，利用蔗糖密度梯度超速離心純化ND-AI-FAdV4 cVLPs。利用Western blot分析ND-AI-FAdV4 cVLPs各組分蛋白表達(dá)情況，利用透射電鏡分析ND-AI-FAdV4 cVLPs形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增擴增含有NDV HN胞內(nèi)域及跨膜域和部分柔性肽序列的cHN-GS(178 bp)及含有剩余柔性肽序列和Fiber2基因的cGS-Fiber2(1 474 bp)，并回收pFastBac1線性化載體(4 673 bp)，電泳結(jié)果表明所擴增的基因與理論值相符(圖1)。

A.cHN-GS擴增及鑒定；B.cGS-Fiber2擴增及鑒定；C.pFastBac1載體雙酶切鑒定。M.DL2000 DNA Marker;A1,B1,C1.擴增產(chǎn)物

2.1 重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定將cHN-GS、cGS-Fiber2和pFastBac1線性化載體進(jìn)行連接構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒rpFastBac1-cFiber2，利用PCR鑒定并采用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定。PCR結(jié)果顯示擴增條帶大小與理論值(1 641 bp)相符(圖2A)；雙酶切結(jié)果顯示目的片段(1 636 bp)和載體片段(4 673 bp)均與電泳條帶相符(圖2B)。

A.rpFastBac1-cFiber2 PCR擴增鑒定；B.rpFastBac1-cFiber2雙酶切鑒定

2.2 重組桿粒篩選及鑒定將重組穿梭質(zhì)粒rpFastBac1-cFiber2轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組桿粒rBmid-cFiber2，利用M13通用引物和特異性引物進(jìn)行鑒定。M13通用引物PCR結(jié)果顯示擴增條帶與理論值(約4 140 bp)相符；特異性引物PCR結(jié)果顯示擴增條帶與理論值(1 641 bp)相符(圖3)。

M.DL5000 DNA Marker；1.M13通用引物PCR擴增；2.特異性引物PCR擴增

2.3 重組桿狀病毒的構(gòu)建及鑒定

2.3.1細(xì)胞病變 將重組桿粒rBmid-cFiber2轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行重組桿狀病毒(rBV-cFiber2)的拯救，盲傳3代，期間觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。結(jié)果顯示，相較于對照組，rBV-cFiber2感染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯皺縮、崩解、脫落等現(xiàn)象(圖4)。

A.對照組Sf9昆蟲細(xì)胞；B.rBV-cFiber2感染組Sf9昆蟲細(xì)胞

2.3.2PCR鑒定 提取第3代重組桿狀病毒基因組，利用M13通用引物和特異性引物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,M13通用引物PCR結(jié)果(約4 140 bp)和特異性引物PCR結(jié)果(1 641 bp)與理論值相符(圖5)。

M.DL5000 Plus DNA Marker；1.M13通用引物PCR擴增產(chǎn)物；2.特異性引物PCR擴增產(chǎn)物

2.3.3間接免疫熒光鑒定 利用間接免疫熒光試驗檢測cFiber2蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示rBV-cFiber2感染組幾乎所有細(xì)胞均能檢測到綠色熒光信號，表明重組桿狀病毒能夠正確表達(dá)目的蛋白(圖6)。

圖6 間接免疫熒光鑒定

2.4 ND-AI-FAdV4 cVLPs的組裝及鑒定

2.4.1ND-AI-FAdV4 cVLPs蛋白組分分析 利用免疫印跡試驗分析ND-AI-FAdV4 cVLPs各組分蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示NDV基質(zhì)蛋白M約為40 kDa，NDV HN蛋白約為70 kDa，AIV HA蛋白約為70 kDa，F(xiàn)AdV4 cFiber2蛋白約為60 kDa，表明ND-AI-FAdV4 cVLPs各組分蛋白均正確表達(dá)(圖7)。

A.M蛋白免疫印跡分析；B.HN蛋白免疫印跡分析；C.HA蛋白免疫印跡分析；D.Fiber2蛋白免疫印跡分析

2.4.2ND-AI-FAdV4 cVLPs形態(tài)分析 利用透射電鏡分析ND-AI-FAdV4 cVLPs形態(tài)，結(jié)果可見大小約為100 nm、外有囊膜和纖突、內(nèi)無核酸的空心納米顆粒(圖8)。

A.NDV活毒株電鏡結(jié)構(gòu)；B.ND-AI-FAdV4 cVLPs電鏡結(jié)構(gòu)

3 討論

ND、AI和FAdV4病是威脅我國家禽養(yǎng)殖業(yè)最主要的動物疫病。ND在我國雞群中主要流行的是基因Ⅶ型強毒株，其中Ⅶd和Ⅶe為優(yōu)勢流行亞型[1-2]，目前使用疫苗毒株主要為基因Ⅱ型，各基因型之間存在抗原差異，疫苗毒株與流行毒株基因型的不匹配限制了疫苗的免疫保護(hù)效果。H9N2已是AI眾多亞型中流行最廣的基因型，并且已突破種間屏障，無需中間宿主也可感染人類[3]，因此預(yù)防和控制H9N2亞型AIV無論是對于促進(jìn)家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展還是維護(hù)公共衛(wèi)生安全均意義重大，但對于預(yù)防H9N2亞型AI主要是采用滅活疫苗，例如以AIV A/Chicken/Guangdong/SS/94株、A/Chicken/Shandong/6/96株和A/Chicken/Shanghai/F/98株研制的滅活疫苗。FAdV4的感染引起的肝炎-心包積液綜合征(hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS)自2015年7月以來在中國多地暴發(fā)，并迅速蔓延至全國各地，已占據(jù)流行主導(dǎo)地位，肉雞的病亡率高達(dá)40%～90%，嚴(yán)重威脅我國家禽養(yǎng)殖業(yè)[12-13]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2021年6月批準(zhǔn)的雞ND、AI(H9亞型)、FAdV(Ⅰ群4型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+YBF13株+YBAV-4株)才填補了我國FAdV疫苗的空白。然而，弱毒疫苗存在毒力返強或疫苗株擴散等生物安全風(fēng)險和滅活疫苗存在免疫原性不足的缺點，與流行毒株基因型相匹配的新型疫苗的研發(fā)已成為農(nóng)業(yè)高效、綠色生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)的核心急需突破。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白例如NDV HN蛋白、AIV HA蛋白和FAdV4 Fiber2蛋白具有開發(fā)成為新型疫苗的潛力[5-7]，但單一抗原成分無法刺激機體產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答，因此提高亞單位蛋白的免疫原性(包括體液免疫和細(xì)胞免疫)決定了新型疫苗是否能夠提供有效保護(hù)。確保蛋白質(zhì)正確折疊和翻譯后修飾(PTM)以及借助高效遞送載體是誘導(dǎo)適當(dāng)免疫反應(yīng)的必要條件。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠保證在高表達(dá)量的前提下，對蛋白質(zhì)進(jìn)行正確修飾，使其天然活性與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的蛋白類似，是新型疫苗研發(fā)的理想表達(dá)系統(tǒng)。鑒于當(dāng)前上市疫苗已不能滿足多種類、多基因型的疫病防控需求，為推動ND、AI和FAdV4病的科學(xué)聯(lián)合防控及進(jìn)一步的種群凈化，研發(fā)一種生態(tài)、高效(可誘導(dǎo)高效的體液及細(xì)胞免疫)且可“一針多防”的新型疫苗至關(guān)重要。

病毒樣顆粒(VLPs)由于本身不含有感染性核酸，可重復(fù)高密度的展現(xiàn)表面抗原，是新型疫苗的研發(fā)熱點。目前多種VLPs的疫苗已上市，包括針對人乳頭瘤病毒(HPV)的疫苗(Cervarix?、Gardasil?和Gardasil9?)和針對乙型肝炎病毒(HBV)的疫苗Sci-B-VacTM等。2017年上市的豬圓環(huán)病毒樣顆?！皥A柯欣”也是獸用VLPs疫苗領(lǐng)域的典型代表。此外，VLPs還可作為遞送外源蛋白的理想載體，可借助自身特性將外源蛋白抗原信息傳遞至抗原遞呈細(xì)胞而促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)。將嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)的刺突蛋白(S)展現(xiàn)在H5N1基質(zhì)蛋白(M1)組裝的VLPs表面而構(gòu)建的嵌合病毒樣顆粒(SM)，與AL/CpG佐劑聯(lián)合使用可刺激動物產(chǎn)生持續(xù)的高水平抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并建立有效的保護(hù)屏障，能保護(hù)小鼠免受SARS-CoV-2小鼠適應(yīng)株的攻擊[14]。ND VLPs同樣也是一種遞送外源抗原信息的良好載體，如將呼吸道合胞體病毒(RSV)的G蛋白與NDV HN蛋白胞內(nèi)域及跨膜域串聯(lián)表達(dá)后，均能正確組裝出展示異源抗原成分的ND VLPs[15]。本團(tuán)隊也開發(fā)并完善了ND VLPs作為疫苗遞送載體平臺，證實ND VLPs能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生比亞單位抗原組分更高的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，例如將布魯菌BCSP31蛋白展現(xiàn)在與ND VLPs表面而組裝的嵌合型VLPs(cVLPs-GPI-BCSP31)，cVLPs-GPI-BCSP31可在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DCs)活化及遷移，提供比BCSP31亞單位疫苗更有效的免疫保護(hù)力[9]。

綜上，鑒于當(dāng)前家禽疫病流行情況及防控需求，本試驗基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和ND VLPs載體平臺，將AI H9N2株HA基因、FAdV4 Fiber2嵌合至ND VLPs載體表面進(jìn)而成功構(gòu)建“新流腺”三聯(lián)嵌合型VLPs(ND-AI-FAdV4 cVLPs)，為ND、AI和FAdV病的綠色、高效且可“一針多防”的VLPs疫苗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。