非酒精性脂肪性肝病患者髓源性抑制細(xì)胞和白介素-6的初步研究

莊靜華，李明凱，陳式儀，王貸明

（1.汕頭市中心醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東 汕頭 515041；2.中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510000；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與風(fēng)濕科，廣東 汕頭 515041；4.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 汕頭 515041）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無過量飲酒和其他明確的肝損害因素所致的、以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性為特征的臨床病理綜合征。NAFLD 根據(jù)肝臟病理學(xué)形態(tài)的不同，分為非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC） 存在于大多數(shù)癌癥患者中，它是一群位于B細(xì)胞、T細(xì)胞上游的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，包括早期髓系祖細(xì)胞和不成熟的粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。在正常情況下，骨髓中的造血干細(xì)胞分化為未成熟髓樣細(xì)胞，進(jìn)一步分化為成熟的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，但在感染、腫瘤、器官移植或炎癥性疾病等病理狀態(tài)下，未成熟髓樣細(xì)胞分化受阻并失去分化能力，即成為MDSC[2]。MDSC分為單核型MDSC（monocytic-MDSC，Mo-MDSC）和多核型/粒細(xì)胞型 MDSC （granulocytic-MDSC，G-MDSC)。MDSC 與肝臟炎癥、纖維化和肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[3-4]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）被認(rèn)為可抑制氧化應(yīng)激和線粒體功能紊亂，從而保護(hù)肝臟，而肝細(xì)胞與周圍脂肪細(xì)胞也能分泌IL-6，IL-6 又能介導(dǎo)和促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，在NAFLD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。目前MDSC 在NAFLD 患者中的表達(dá)情況研究較少，MDSC 是否影響NAFLD 進(jìn)展為肝細(xì)胞癌也未見相關(guān)報(bào)道。本研究探討NAFLD 患者外周血中MDSC和IL-6的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018—2019 年在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的NAFLD 患者30 例（NAFLD 組）和同期健康體檢者30 名（正常對(duì)照組）。NAFLD 患者均符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）》[1]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）無過量飲酒史（男性飲酒折合乙醇量＜30 g/d，女性＜20 g/d）；（2）具有彌漫性肝細(xì)胞脂肪變的影像學(xué)或組織學(xué)證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）全胃腸外營(yíng)養(yǎng)、病毒性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃缘瓤蓪?dǎo)致脂肪性肝病的特定疾病；（2）伴有感染（慢性乙型肝炎、肺結(jié)核等）、惡性腫瘤、自身免疫性疾?。?型糖尿病、橋本甲狀腺炎、炎癥性腸病等）、嚴(yán)重心肺疾病、嚴(yán)重腎功能不全等。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

抗人HLA-DR-APC 抗體、抗人CD11b-PC5抗體、抗人CD33-PE 抗體、抗人CD14-FITC 抗體及IgG 同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司，IL-6和酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，EPICS XL 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，EnSpire酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離收集所有研究對(duì)象空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血2 mL，置于EDTA 抗凝管中。取100 μL人外周血，加入2 mL流式細(xì)胞分析用溶血素，冰浴10 min，350×g離心5 min；棄上清，加入10 mL 磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞1 次，350×g離心5 min，棄上清后，重懸計(jì)數(shù)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)將新鮮分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL，每管100 μL，加入相應(yīng)的表面標(biāo)記抗體（CD14、CD33、CD11b、HLA-DR），混勻后室溫避光孵育30 min。加入2 mL 的細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，350×g離心5 min，棄上清，加入0.1 mL的細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，在1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以CD11b+CD33+HLA-DR-定義為MDSC，CD11b+CD14-CD33+HLA-DR-定 義 為 G-MDSC，CD11b+CD14+CD33+HLA-DR-定義為Mo-MDSC。采用FlowJo軟件分析MDSC、G-MDSC、Mo-MDSC 占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例。

1.3.3 血清中IL-6的檢測(cè)收集NAFLD組和正常對(duì)照組研究對(duì)象空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血3 mL，置于非抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，吸取血清分裝于無菌管中，按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書的操作步驟檢測(cè)IL-6的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù) 間 距 [M（Q1，Q3）]表 示 ， 組 間 比 較 采 用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)分析判斷MDSC 及其亞型、IL-6 與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶等臨床指標(biāo)的關(guān)系。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD 組和正常對(duì)照組基本的器官功能指標(biāo)和臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的差異情況

NAFLD 組男性15 例，女性15 例，年齡64（50，75），正常對(duì)照組男性14例，女性16例，年齡27（24，41）。NAFLD 組和正常對(duì)照組年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性細(xì)胞百分比、嗜堿性細(xì)胞百分比、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），見表1。

表1 NAFLD組和正常對(duì)照組基本的器官功能指標(biāo)和臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的差異情況（n=30例）

2.2 MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 和IL-6 在NAFLD組和正常對(duì)照組外周血中的表達(dá)情況

與正常對(duì)照組對(duì)比，NAFLD 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 的比例均降低（P值均＜0.05），IL-6 的表達(dá)水平升高（P＜0.001），見表2。

表2 MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC、IL-6在NAFLD組和正常對(duì)照組外周血中的表達(dá)情況［n=30例，M（Q1，Q3）］

2.3 NAFLD 患者外周血MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC、IL-6與臨床實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的相關(guān)性

G-MDSC 比例與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （alanine aminotransferase/ aspartate aminotransferase，ALT/AST） 呈 負(fù) 相 關(guān) （r=-0.403，P=0.030）；G-MDSC與體重指數(shù)、AST、ALT、甘油三酯、低密度脂蛋白等其他指標(biāo)間無相關(guān)性（P值均＞0.05）；MDSC、Mo-MDSC、IL-6 與臨床實(shí)驗(yàn)室各檢查指標(biāo)間無相關(guān)性 （P值均＞0.05）。NAFLD 患者外周血中MDSC、Mo-MDSC、G-MDSC 比例與IL-6的表達(dá)水平均無相關(guān)性。見表3。

表3 NAFLD患者外周血中G-MDSC與臨床實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

3 討論

目前，國(guó)際范圍內(nèi)MDSC 與NAFLD 的相關(guān)性研究較少，大多數(shù)以小鼠為研究對(duì)象且尚無定論。在動(dòng)物模型方面，Chen 等[6]發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組小鼠相比，高脂飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生的NAFLD小鼠肝臟組織中MDSC 的比例明顯增加。Yao 等[7]發(fā)現(xiàn)NAFLD 模型小鼠肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的MDSC 比例比正常對(duì)照組高。Li等[8]發(fā)現(xiàn)膽堿缺乏氨基酸限制飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠骨髓中的MDSC比例較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），肝組織中MDSC比例較正常組顯著降低（P＜0.001），外周血中MDSC 的比例與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究發(fā)現(xiàn) NAFLD 患者外周血中MDSC 比例比正常對(duì)照組明顯減少（P＜0.05）。這可能是一種“歸巢現(xiàn)象”，即在NAFLD 的慢性病程中，骨髓產(chǎn)生的MDSC 通過血液被募集到炎癥部位肝臟中，導(dǎo)致外周血中的MDSC 數(shù)量減少，而肝臟中的MDSC 數(shù)量增加。但也不排除其他的可能：（1）由于研究中樣本量小，不能很好地反映樣本總體的情況；（2）可能存在其他機(jī)制，比如在病情很嚴(yán)重時(shí)，MDSC 的生成反而受抑制，從而導(dǎo)致MDSC數(shù)量下降。

本研究中NAFLD 組和正常對(duì)照組外周血中MDSC 均 以 Mo-MDSC 為 主 ， 且 NAFLD 組 的Mo-MDSC和G-MDSC比例皆較正常對(duì)照組明顯減少 （P＜0.05），這提示 Mo-MDSC、G-MDSC 可能都參與了NAFLD的疾病過程，但兩者的功能可能存在差異，G-MDSC 可能發(fā)揮主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)G-MDSC 比例與ALT/AST 負(fù)相關(guān)，而ALT/AST上升常見于NASH患者，且與炎癥程度關(guān)系密切。Cheng 等[9]發(fā)現(xiàn)在高脂飲食和蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)小鼠NASH 模型中，蒼菊清肝降脂湯治療使肝損傷基本恢復(fù)正常，降低了ALT/AST 水平，減輕了肝臟炎癥的嚴(yán)重程度。Mridha 等[10]發(fā)現(xiàn)MCC950 治療使肝組織表達(dá)caspase-1 和IL-1β，血漿中IL-1β、MCP1、IL-6、ALT/AST 水平降低，肝臟炎癥和肝纖維化程度減輕。究竟是G-MDSC 比例的降低影響了疾病的進(jìn)程還是疾病的加重促進(jìn)了G-MDSC 比例的降低呢？如果是后者的話，G-MDSC 比例的降低又進(jìn)一步對(duì)疾病產(chǎn)生了怎樣的影響，是免疫促進(jìn)還是免疫保護(hù)？這都有待進(jìn)一步研究。

炎癥雖然是肝臟疾病的常見原因，但其在NASH 發(fā)病機(jī)制中的作用仍不清楚。有報(bào)道稱，相對(duì)過量的促炎性細(xì)胞因子和相對(duì)缺乏的抗炎細(xì)胞因子之間的不平衡在NASH 的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵的作用[11]。IL-6 可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，與肝臟局部炎癥有關(guān)。IL-6 參與炎癥損傷過程，具有抑制脂肪分解和脂蛋白酯酶活性、促進(jìn)脂肪生成的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者外周血中IL-6表達(dá)水平較正常人明顯增加（P＜0.001），與其他文獻(xiàn)結(jié)果一致，提示了IL-6 可能與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。

研究表明，在炎癥或腫瘤中，機(jī)體中多種細(xì)胞因子能夠影響MDSC 的募集、生長(zhǎng)和分化。γ干擾素、IL-6、IL-10、IL-13 和 TGF-β3 能刺激MDSC 的募集和擴(kuò)增，γ 干擾素、IL-4、IL-13、IL-17和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β則刺激MDSCs 的活化[13]。關(guān)于 NAFLD 中 MDSC 與 IL-6 關(guān)系的研究甚少，目前只有動(dòng)物模型的研究，尚未有關(guān)于人的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MDSC 及其亞型Mo-MDSC、G-MDSC在NAFLD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的比例減少，而IL-6 表達(dá)增加，對(duì)此我們推測(cè)IL-6 可能促進(jìn)MDSC 遷移到靶器官肝臟中，導(dǎo)致外周血MDSC 的比例減少。遺憾的是，并未發(fā)現(xiàn)MDSC 或其亞型與IL-6 相關(guān)，可能是由于本研究中的例數(shù)相對(duì)較少，造成了一定的抽樣誤差，也未能做到以疾病嚴(yán)重程度分組。MDSC 與IL-6之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。