斑蘭葉葉部病害病原菌的分離鑒定

茍亞峰，薛 超，高圣風(fēng)，孫世偉*，秦曉威，魚 歡，田 甜，劉世超

斑蘭葉葉部病害病原菌的分離鑒定

茍亞峰1,2，薛 超1，高圣風(fēng)1,2，孫世偉1,2*，秦曉威1,2，魚 歡1,2，田 甜1，劉世超1

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；2. 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南萬寧 571533

斑蘭葉作為一種新興的食品香料備受消費(fèi)者喜愛，其主要食用部位為葉片，但葉部病害成為影響斑蘭葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的首要制約因素。目前，國內(nèi)外關(guān)于斑蘭葉葉部病害的研究鮮有報道，為了對斑蘭葉葉部病害開展有針對性的防治工作，本研究通過調(diào)查斑蘭葉葉部病害發(fā)生流行規(guī)律，明確葉部病害主要發(fā)病時期及病害種類，并對葉部不同病害病原菌進(jìn)行分離鑒定，為推動斑蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐。結(jié)果表明，斑蘭葉葉部病害的發(fā)生主要從每年11月中下旬開始到翌年4月結(jié)束，對這個時期的不同病害通過病原菌的菌落形態(tài)、孢子顯微結(jié)構(gòu)觀察、真菌通用引物ITS1/ITS4鑒定和致病性測定，采用離體葉片和活體盆栽苗2種方式測定分離的28株菌株的致病性，通過柯赫氏法則驗(yàn)證，最終得到9株致病菌BDC4121、BDC11221、BDC4112、BDC21112、XYS211、LSS112、LSS214、LSS213、LSS221。通過產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選發(fā)現(xiàn)致病菌BDC11221在綠豆液體培養(yǎng)基、搖床培養(yǎng)5～7 d產(chǎn)孢，LSS214在PDA培養(yǎng)基28℃下恒溫培養(yǎng)30 d左右產(chǎn)孢，BDC4121、BDC4112、XYS211、LSS112、LSS221、LSS213在PDA培養(yǎng)基28℃下恒溫培養(yǎng)7～10 d產(chǎn)孢；并結(jié)合ITS1/ITS4鑒定和孢子顯微結(jié)構(gòu)觀察，確定9株致病菌主要分布在籃狀菌屬（）、鐮刀菌屬（）、炭疽菌屬（）、附球菌屬（）、擬盤多毛孢菌屬（）、擬莖點(diǎn)霉屬（）、鏈格孢屬（）及屬。下一步將結(jié)合多基因組測序技術(shù)對致病菌進(jìn)行分子鑒定研究。

斑蘭葉；葉斑病病原菌；分離；鑒定

斑蘭葉，學(xué)名香露兜（Roxb.）為露兜樹科（Pandannaceae）露兜樹屬（）多年生熱帶草本香料植物。原產(chǎn)地為印度尼西亞馬魯古群島，目前在泰國、新加坡和印度尼西亞等國均有栽培，我國主要引種栽培于海南省，云南、廣東、福建等省有零星分布[1-2]。其葉有“粽香”香味，被譽(yù)為“東方人的香草”，是深受消費(fèi)者喜愛的一種熱區(qū)天然食品香料[3-4]。葉片富含角鯊烯、亞油酸、草蒿腦等多種活性成分，具有加快新陳代謝、增強(qiáng)細(xì)胞活力、提高人體免疫力的作用，是制作糕點(diǎn)、冰淇淋、清補(bǔ)涼、糖果等食品的純天然原料[5]。此外，斑蘭葉的揮發(fā)油中含有大量的甾醇、2-乙酰-1-吡咯啉、不飽和脂肪酸等，具有一定的保健作用，有非常高的開發(fā)價值，是一種藥食兼用的重要植物資源[6-8]。

近幾年來，斑蘭葉作為一種特色香料，因其純天然的綠色及特殊的香味而受到烘焙、茶飲等食品行業(yè)的青睞。此外，斑蘭葉具有生長期短、耐隱蔽、好采收、易加工、見效快等優(yōu)勢，逐漸成為經(jīng)濟(jì)林下復(fù)合栽培的間作作物而被廣泛推廣和應(yīng)用。通過對海南斑蘭葉種植情況的初步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)每年11月到翌年4月葉部病害嚴(yán)重為害斑蘭葉，從而導(dǎo)致較長一段時間內(nèi)新鮮葉片無法采收，影響經(jīng)濟(jì)收益。目前，有關(guān)斑蘭葉葉部病害的分離鑒定尚未報道，為此，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對斑蘭葉葉部病害的致病菌進(jìn)行分離鑒定，為進(jìn)一步開展斑蘭葉葉部病害綠色防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試病葉分別采自海南斑蘭葉種植區(qū)瓊海市梁中村、陵水市下旺村、萬寧市北大村及中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所斑蘭葉種植基地，將新鮮病葉采回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 常用真菌分離及孢子培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）[9]、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OA）[10]、低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（SNA）[11]。

綠豆液體培養(yǎng)基：稱取30 g綠豆加入1000 mL蒸餾水煮至綠豆開裂，過濾后將液體分裝至250 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 分離病原菌采用方中達(dá)[12]的方法并稍有改進(jìn)。將采集的病葉帶回實(shí)驗(yàn)室用清水洗凈晾干，剪取病健交界處0.5 cm× 0.5 cm大小的葉片小塊，于75%酒精中浸泡30 s后，取出放入滅菌水中沖洗3次，并置于滅菌濾紙上吸干水分，然后將病塊四周邊緣剪掉并倒扣于PDA平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。從培養(yǎng)的菌落周圍挑取不同形態(tài)特征的邊緣單個菌絲轉(zhuǎn)接到PDA（含鏈霉素）平板上繼續(xù)培養(yǎng)，多次純化直至形成單菌落。

1.2.2 病原菌的致病性測定 根據(jù)柯赫氏法則，在1.2.1基礎(chǔ)上，將分離純化的真菌菌落在PDA培養(yǎng)基中、28℃下培養(yǎng)3～5 d后用打孔器切取直徑為5 mm菌餅，采用刺傷和無刺傷2種方式接種到斑蘭葉離體葉片和活體盆栽苗上（6～10片葉），以滅菌PDA菌餅刺傷和無刺傷接種為空白對照，所有處理保濕，定期觀察并記錄發(fā)病情況。從發(fā)病組織中再次分離純化病原菌，并與接種菌株對比，田間癥狀和菌落形態(tài)一致的即可確定為致病菌。

1.2.3 病原菌的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定。將分離的致病菌菌株接種到PDA平板上，置于28℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)；待其產(chǎn)孢后，挑取少量孢子制作玻片進(jìn)行顯微觀察，并測量孢子大小。對于在PDA平板上不產(chǎn)孢的菌株利用產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，再進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

（2）分子生物學(xué)鑒定。將分離的致病菌株接種到PDA平板上，培養(yǎng)5 d后收集菌絲，DNA提取采用真菌DNA提取試劑盒（Biomiga公司，型號BW-GD2416-01）。以提取的真菌基因組總DNA為模板，利用真菌通用引物ITS1（5-TC-CG-TAG-GTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCT-CCG-C-TTATTGATATGC-3），對其rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體（25 μL）：引物ITS1/ITS4各1 μL、2×PCR Master Mix（含染料）12.5 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取4 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化和測序[13]。

將測序所得的DNA序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST對比分析，獲得不同菌株的序列登錄號；利用MEGA12.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，初步確定該菌株的分類地位，采用鄰接法（neighbo-ur--joining, NJ），bootstrap value設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與致病性測定

從斑蘭葉葉部病害中共分離出28株病原菌，通過針刺法接種斑蘭葉離體葉片和活體盆栽苗2種方法對分離的28株病原菌進(jìn)行致病性測定，通過柯赫氏法則驗(yàn)證，結(jié)果表明，有9株致病菌株，分別編號為BDC4121、BDC11221、BDC4112、BDC21112、XYS211、LSS112、LSS214、LSS213及LSS221。從致病菌在盆栽苗上的癥狀可以看出，菌株BDC4121在葉片上出現(xiàn)紅褐色病斑，病斑中心黑褐色；BDC11221出現(xiàn)水漬狀橢圓形病斑；BDC4112出現(xiàn)黑色病斑，病斑背面黃色；BDC21112出現(xiàn)黃褐色不規(guī)則形病斑，病斑背面附著灰色霉；XYS211出現(xiàn)黑色病斑，病斑背面灰色；LSS112出現(xiàn)黃色病斑，病斑橢圓形褐色，邊緣黃色褪綠圈，中心灰色；LSS214出現(xiàn)灰色不規(guī)則病斑，中心黑色；LSS213出現(xiàn)褪綠斑，病斑背面灰色并附著黑色霉斑；LSS221出現(xiàn)不規(guī)則病斑，病斑邊緣明顯黃色圈，背面中心出現(xiàn)水漬癥狀（圖1）。

圖1 9株致病菌在班蘭葉上的致病性測定結(jié)果

將9株致病菌在PDA培養(yǎng)基上于27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，觀察各致病菌菌落生長情況，菌落形態(tài)見表1。

2.2 致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定

通過觀察9株致病菌在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢情況，發(fā)現(xiàn)菌株BDC21112在SNA培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d產(chǎn)孢；BDC11221在綠豆液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)5～7 d產(chǎn)孢；LSS214在PDA培養(yǎng)基28℃下恒溫培養(yǎng)30 d產(chǎn)孢；BDC4121、BDC4112、XYS211、LSS112、LSS221及LSS213在PDA培養(yǎng)基28℃下恒溫培養(yǎng)7～10 d產(chǎn)孢，孢子形態(tài)見圖2。

表1 斑蘭葉9株致病菌在PDA培養(yǎng)基的菌落形態(tài)

A：BDC4121；B：BDC11221；C：BDC4112；D：XYS211；E：BDC21112；F：LSS112；G：LSS221；H：LSS213；LSS214未拍到孢子形態(tài)圖。

2.3 致病菌分子生物學(xué)鑒定

利用真菌通用引物ITS1/ITS4，分別以分離純化的9株致病菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，利用ITS1/ITS4引物9株菌株均可擴(kuò)增到500 bp左右的DNA片段。將獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST對比發(fā)現(xiàn)，9株菌株的ITS序列與模式菌株相似度達(dá)到100%，其中BDC4121為籃狀菌屬（），BDC11221為鐮刀菌屬（），BDC4112、XYS211為炭疽菌屬（），BDC21112為附球菌屬（），LSS112為擬盤多毛孢菌屬（），LSS214為擬莖點(diǎn)霉屬（），LSS221為鏈格孢屬（），LSS213為屬（表2）。

表2 NCBI中9株致病菌ITS序列的BLAST比對結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析，發(fā)現(xiàn)斑蘭葉葉部病害主要致病菌分布在籃狀菌屬（）、鐮刀菌屬（）、炭疽菌屬（）、擬盤多毛孢菌屬（）、擬莖點(diǎn)霉屬（）、鏈格孢屬（）及屬是我國首次報道引起斑蘭葉葉部病害的病原菌。鑒于斑蘭葉主要食用部位是葉片，主要經(jīng)濟(jì)價值在葉片的開發(fā)利用上，因此，下一步將結(jié)合多基因組序列鑒定技術(shù)對致病菌進(jìn)行分子鑒定，以明確具體種類，為斑蘭葉葉部病害精準(zhǔn)防治奠定基礎(chǔ)，對斑蘭葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

本研究分離的各類致病菌已有相關(guān)報道。擬盤多毛孢屬（）是一類重要的植物致病菌，主要分布在全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國大多分布于南方。國內(nèi)有報道橡膠葉斑病由一種擬盤多毛孢屬真菌引起，棒狀擬盤多毛孢（）為葡萄葉斑病的主要致病菌等[14-16]。此外，籃狀菌屬（）、附球菌屬（）常作為內(nèi)生菌存在于植物中，也可作為病原菌侵染少數(shù)植物[17]。黃鈜琳等[18]研究發(fā)現(xiàn)高粱附球菌（）會引起茶葉葉斑病。擬莖點(diǎn)霉屬（）病原菌地域分布廣泛，引起植物的葉枯、枝枯、爛莖、潰瘍及果腐等嚴(yán)重病害，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，該屬種類繁多、形態(tài)特殊、地理位置分布廣泛，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)，可引起作物、蔬菜、果樹等植物的嚴(yán)重病害，然而，目前對該屬病害的研究基礎(chǔ)相對薄弱[19]。鏈格孢屬（）致病菌可侵染多種農(nóng)作物，引起黑斑病、褐斑病、輪斑病等。炭疽菌在世界上廣泛存在，由其引起的炭疽病常有報道，由于該屬的形態(tài)學(xué)特征具有較強(qiáng)的可變性，不同菌株的生物學(xué)特性存在一定差異。海南橡膠樹炭疽病是橡膠樹上一種重要葉部病害，主要是由膠孢炭疽菌復(fù)合群和尖孢炭疽菌復(fù)合群病原菌引起[20]。鐮刀菌是一種能夠引起植物枯萎病和根腐病的土傳病原真菌，被列為世界十大植物病原真菌之一，對作物具有嚴(yán)重的破壞性[21]。據(jù)報道，屬致病菌會引起紫花苜蓿根腐和冠腐病[22]。因此，下一步將結(jié)合其他作物上該類病害的發(fā)生為害特征開展斑蘭葉葉部病害的防治研究。

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GOU Yafeng1,2, XUE Chao1, GAO Shengfeng1,2, SUN Shiwei1,2*, QIN Xiaowei1,2, YU Huan1,2, TIAN Tian1, LIU Shichao1

1. Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning, Hainan 571533, China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533, China

a new food flavor, is loved by consumers. The main edible part is leaves. Leaf diseases have become the primary restrictive factor affecting the development ofindustry. There are few reports on the research of leaf diseases on. In order to control the pathogens causing leaf diseases, this study investigated the occurrence and epidemic of leaf diseases, defined the main incidence period and disease types, isolated and identified the pathogens of different leaf diseases, and it would provide technical support for promoting the development ofindustry. The occurrence of leaf diseases mainly began from the middle and late November of each year to the end of April of the next year. The pathogenicity of 28 isolated pathogens was determinedleaves andpotted seedlings. Through the observation of pathogen colony morphology, spore microstructure, universal identification of fungal primers ITS1/ITS4 and pathogenicity determination, strains BDC4121, BDC11221, BDC4112, BDC21112, XYS211, LSS112, LSS214, LSS213 and LSS221 were finally obtained through Koch’s rule verification. Through the screening of sporulation medium, BDC11221 was found to produce spores in mung bean liquid medium and shaking table for 5?7 days, LSS214 to spores in PDA at 28℃ for about 30 days, and BDC4121, BDC4112, XYS211, LSS112, LSS221 and LSS213 to produce spores in PDA at 28℃ for 7?10 days. Combined with ITS1/ITS4 identification and spore microstructure observation, the pathogens were in,,,,,,andThe pathogens will be clarified with multigenome sequencing technology.

; pathogen of leaf diseases; isolation; identification

S567.239

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.015

2022-01-26；

2022-06-01

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 321MS092）。

茍亞峰（1980—），女，碩士，副研究員，研究方向：熱帶香料飲料作物主要病蟲害生物防治。*通信作者（Corresponding author）：孫世偉（SUN Shiwei），E-mail：sunshw@126.com。