低能量激光對衰老牙周膜干細(xì)胞增殖和成骨分化功能的影響

邵 馨，王 爽，郭小梅，夜文敏，孔榮榮，宋 揚(yáng)，吳 凡，王麗穎*

(1西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710004；2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科；3西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院病理科；4空軍第九八六醫(yī)院口腔科；5空軍第九八六醫(yī)院心臟外科；*通訊作者,E-mail:710808434@qq.com)

牙周炎是一種高患病率的口腔疾病，會持續(xù)破壞牙周組織并導(dǎo)致牙齒脫落，所以牙周治療的目標(biāo)是牙周組織的再生[1]。牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)來源于牙周膜組織，是可高度增殖的細(xì)胞，具有向牙周組織分化的潛能[2]，被認(rèn)為是牙周組織再生的種子細(xì)胞。已有研究表明，使用自體PDLSCs治療牙槽骨缺損是安全的，不會產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)[3,4]。

在炎癥、高糖等條件下PDLSCs的多能性會受到損害，成骨分化功能被抑制[5,6]。由于大部分牙周缺損的患者年齡較大，所以衰老對PDLSCs成骨分化以及牙周修復(fù)潛能的影響尤為重要。已有研究表明隨著年齡的增長，PDLSCs的增殖能力和成骨分化潛能降低，這不利于衰老PDLSCs用于牙周組織再生[7]，因此本研究聚焦于如何提高衰老PDLSCs的增殖和成骨分化功能。

低能量激光治療(low-level laser therapy, LLLT)也稱為紅光治療、冷激光、軟激光、生物刺激和光生物調(diào)節(jié)，于20世紀(jì)60年代首次報(bào)道，從那時(shí)起就被用于減輕炎癥和促進(jìn)傷口愈合[8]。有研究表明，LLLT在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化方面起著關(guān)鍵作用[9,10]，本課題組前期研究證實(shí)，LLLT可以在健康和炎癥條件下調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化能力[11]。在眾多激光中，摻釹釔鋁石榴石(neodymium-doped:yttrium-aluminum-garnet, Nd:YAG)激光可有效去除慢性牙周炎患者牙周袋外牙齦上皮的細(xì)菌，被視為提高牙周病療效的方法[12]，本課題組前期研究證實(shí)，Nd:YAG激光能在適宜能量強(qiáng)度范圍上調(diào)PDLSCs的增殖和成骨分化功能[13]。但LLLT對衰老PDLSCs的功能是否具有調(diào)節(jié)作用尚未可知。

因此本研究通過觀察不同照射強(qiáng)度LLLT對衰老PDLSCs增殖和成骨分化功能的影響，旨在尋找增強(qiáng)衰老PDLSCs功能的最佳LLLT照射強(qiáng)度，以期提高衰老PDLSCs牙周缺損修復(fù)能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素(Gibco，美國)，0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)，中性蛋白酶(Roche Diagnostics Gmbh，德國)，Vario免疫磁珠分選器(MASC，德國)，Stro-1抗體(Rnd，美國)，激光治療儀(Fidelis Plus Ⅲ, Fotona，德國)，成骨誘導(dǎo)液(Cyagen，美國)，甲苯胺藍(lán)染色液(北京索萊寶科技有限公司)，堿性磷酸酶(ALP)測試盒(南京建成生物工程研究所)，茜素紅染液(陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司)，鈣比色試劑盒(BioVision，美國)，Pierce蛋白質(zhì)分析試劑盒(Thermo，美國)，Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)，SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)，抗人矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、ALP、骨鈣素(osteocalcin, OCN)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體(Abcam，美國)，ELISA測試盒(R&D Systems，美國)。

1.2 牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)的分離和培養(yǎng)

選取西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院外科門診因阻生齒或正畸需要拔除的第3磨牙或正畸牙，要求牙齒完整，無齲病和慢性牙周疾病，本研究經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(No.2020398)，所有患者知情同意。按患者年齡將細(xì)胞分為yPDLSCs組(年輕組，15～25歲，男3例，女3例，共10顆牙)和aPDLSCs組(老年組，40～55歲，男3例，女3例，共8顆牙)。在超凈臺內(nèi)用PBS反復(fù)沖洗牙齒直至牙根無污物，刮除牙根部的牙周膜組織，用3 mg/ml Ⅰ型膠原酶和4 mg/ml中性蛋白酶消化刮除的組織1 h，離心后棄上清，加入含20% FBS、1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，3 d換液1次，待細(xì)胞生長至80%融合率時(shí)用胰蛋白酶消化，按照1 ∶2或1 ∶3比例傳代培養(yǎng)，記為第1代細(xì)胞。選取第2代細(xì)胞與stro-1抗體在4 ℃環(huán)境下反應(yīng)30 min，PBS漂洗后在4 ℃環(huán)境下二抗孵育30 min，PBS漂洗。將激光二級管放在Vario免疫磁珠分選器中，4 ℃條件下分離stro-1陽性細(xì)胞，即PDLSCs。

1.3 低能量激光療法(LLLT)

待上述2組PDLSCs長至80%左右融合率時(shí)將細(xì)胞分為5組，yPDLSCs組(年輕組,不予以激光照射)、aPDLSCs對照組(老年對照組，不予以激光照射)、aPDLSCs 4 J/cm2組(4 J/cm2LLLT處理aPDLSCs細(xì)胞)、aPDLSCs 8 J/cm2組(8 J/cm2LLLT處理aPDLSCs細(xì)胞)和aPDLSCs 16 J/cm2組(16 J/cm2LLLT處理aPDLSCs細(xì)胞)。使用垂直于表面的單探針激光機(jī)頭掃描細(xì)胞，接收激光(Nd:YAG,1 064 nm)照射，照射角度為90°，輸出功率為0.25 W，將照射能量強(qiáng)度調(diào)整為約0～16 J/cm2，隔天照射1次，每次照射20 s，共照射3次。5組細(xì)胞均用于后續(xù)研究，包括克隆形成率的測定，檢測細(xì)胞增殖能力；茜素紅染色、ALP活性和RT-PCR，檢測細(xì)胞成骨分化能力；ELISA檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平。

1.4 PDLSCs克隆形成率的測定

將處于對數(shù)生長期PDLSCs以1×103的密度接種于90 mm培養(yǎng)皿，用含10% FBS、1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d。去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗后用4%多聚甲醛固定30 min，再次漂洗后用甲苯胺藍(lán)染色液染色15 min，棄染色液，漂洗后鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率(colony forming unit-fibroblastic，CFU-F)。

1.5 茜素紅染色和ALP活性共同檢測PDLSCs成骨分化能力

茜素紅染色：將處于對數(shù)生長期PDLSCs以5×104/孔的密度接種于12孔板，待細(xì)胞生長至70%融合率時(shí)，換用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，3 d換液1次。成骨誘導(dǎo)21 d去原培養(yǎng)基，PBS漂洗后4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后用茜素紅染液染色，漂洗后鏡下觀察，成骨結(jié)節(jié)紅染。觀察后進(jìn)行茜素紅染色定量，用鈣比色試劑盒進(jìn)行，根據(jù)已知鈣濃度的稀釋創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較計(jì)算鈣的含量。使用Pierce蛋白質(zhì)分析試劑盒通過雙金雞納酸(BCA)法測定同一樣品中的總蛋白質(zhì)含量，鈣活性被標(biāo)準(zhǔn)化為總蛋白質(zhì)含量，以每毫克總蛋白質(zhì)的鈣含量的微摩爾數(shù)(μmol/mg蛋白)表示。茜素紅染色定量越高，說明形成的成骨結(jié)節(jié)量越多。

ALP活性：將處于對數(shù)生長期PDLSCs以5×104/孔的密度將細(xì)胞接種到12孔板，待細(xì)胞生長至70%融合率時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，3 d換液1次，成骨誘導(dǎo)7 d根據(jù)ALP測試盒說明書進(jìn)行ALP活性測定。棄去原培養(yǎng)基，PBS漂洗后4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，在堿性溶液中培養(yǎng)20 min。使用Pierce蛋白質(zhì)分析試劑盒通過雙金雞納酸(BCA)法測定同一樣品中的總蛋白質(zhì)含量，ALP活性被標(biāo)準(zhǔn)化為總蛋白質(zhì)含量，用每分鐘每毫克總蛋白質(zhì)產(chǎn)生的對硝基苯酚納摩爾數(shù)[nmol/(min·mg蛋白質(zhì))]表示。

1.6 RT-PCR檢測Runx2、ALP、OCN的表達(dá)水平

用Trizol試劑盒提取PDLSCs的總RNA，對提取得到的RNA進(jìn)行濃度檢測，根據(jù)濃度確定逆轉(zhuǎn)錄所需的RNA樣本量，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板鏈，采用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s退火和延伸，共40個(gè)循環(huán)。Runx2、ALP、OCN、β-actin引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.7 ELISA檢測細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)水平

使用人TNF-α ELISA試劑盒測定PDLSCs中TNF-α的分泌，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。在鋁箔袋中取出微孔板，每個(gè)孔中添加已配制好的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，室溫孵育2 h洗滌液洗4次，向每個(gè)孔中加入含過氧化氫酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體，室溫培養(yǎng)2 h洗滌，加入顯色劑室溫避光培養(yǎng)30 min，加入終止液，在450 nm處測定各孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果，結(jié)果以pg/106細(xì)胞表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 4 J/cm2和8 J/cm2 LLLT可提高衰老PDLSCs的增殖能力

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與aPDLSCs對照組比較，4 J/cm2組和8 J/cm2組aPDLSCs的克隆形成率明顯升高(P<0.05)，16 J/cm2組細(xì)胞的克隆形成率的變化不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與yPDLSCs組相比，aPDLSCs對照組克隆形成率明顯下降(P<0.01，見圖1)。

與aPDLSCs對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與yPDLSCs組比較，##P<0.01圖1 不同照射強(qiáng)度對PDLSCs克隆形成率的影響Figure 1 The influence of different irradiation intensities on CFU-F of PDLSCs

2.2 8 J/cm2 LLLT可增強(qiáng)衰老PDLSCs的成骨分化能力

茜素紅染色結(jié)果顯示：與aPDLSCs對照組比較，4 J/cm2組和8 J/cm2組aPDLSCs的成骨結(jié)節(jié)形成明顯增多(P<0.05)，16 J/cm2組aPDLSCs的成骨結(jié)節(jié)形成減少(P<0.05)；與yPDLSCs組相比，aPDLSCs對照組的成骨結(jié)節(jié)形成量減少(P<0.01，見圖2)。ALP活性結(jié)果顯示：與aPDLSCs對照組比較，8 J/cm2組aPDLSCs中ALP活性升高(P<0.01)，16 J/cm2組aPDLSCs中ALP活性降低(P<0.01)；與yPDLSCs組相比，aPDLSCs對照組ALP活性降低(P<0.01，見圖2)。RT-PCR結(jié)果顯示：與aPDLSCs對照組比較，8 J/cm2組aPDLSCs的成骨相關(guān)基因Runx2、ALP、OCN表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，16 J/cm2組aPDLSCs的Runx2、ALP、OCN表達(dá)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與yPDLSCs組相比，aPDLSCs對照組成骨相關(guān)基因表達(dá)水平降低(P<0.01，見圖2)。

箭頭表示紅染的成骨結(jié)節(jié)；與aPDLSCs對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與yPDLSCs組比較，##P<0.01圖2 不同照射強(qiáng)度組PDLSCs成骨分化能力Figure 2 The osteogenic differentiation ability of PDLSCs in different irradiation intensity groups

2.3 4 J/cm2和8 J/cm2LLLT可減少衰老PDLSCs TNF-α的分泌

ELISA結(jié)果顯示：與aPDLSCs對照組比較，4 J/cm2和8 J/cm2組aPDLSCs中TNF-α的分泌明顯減少(P<0.05)，16 J/cm2組aPDLSCs中TNF-α的分泌變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與yPDLSCs組相比，aPDLSCs對照組的TNF-α的分泌量明顯升高(P<0.01，見圖3)。

與aPDLSCs對照組細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01；與yPDLSCs組細(xì)胞比較，##P<0.01圖3 不同照射強(qiáng)度組PDLSCs細(xì)胞因子分泌水平Figure 3 Cytokine secretion level of PDLSCs in different irradiation intensity groups

3 討論

牙周病中骨組織和軟組織的丟失是逐漸增加的，并且在很大程度上不可逆，所以缺失牙周組織的再生是利用組織工程技術(shù)治療牙周缺損的目標(biāo)[14]。干細(xì)胞是組織工程的重要組成部分，然而微環(huán)境的變化會影響干細(xì)胞對牙周再生的作用。

已有相關(guān)研究顯示衰老對干細(xì)胞功能的影響。Zhang等[15]探究年齡對PDLSCs再生潛能的影響，發(fā)現(xiàn)衰老供體來源PDLSCs干細(xì)胞表面標(biāo)記物Stro-1表達(dá)明顯減少，增殖能力、遷移能力以及成骨分化能力下降。Wu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，衰老來源PDLSCs細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，包括膠原蛋白Ⅰ型、纖黏蛋白、整合蛋白β1等分泌顯著減少，制備的細(xì)胞膜片基質(zhì)不足，成骨能力和裸鼠體內(nèi)類骨質(zhì)形成能力均明顯下降。本研究結(jié)果顯示，相對于yPDLSCs，aPDLSCs的克隆形成率降低，成骨結(jié)節(jié)減少，ALP活性和成骨相關(guān)基因水平降低，說明衰老會抑制PDLSCs的增殖能力和成骨分化能力，與上述研究結(jié)論一致。

LLLT可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的成骨分化功能。Yamauchi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，650 nm高功率紅色發(fā)光二極管照射可激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2，從而促進(jìn)PDLSCs的增殖、成骨分化和礦化。Santinoni等[18]研究證實(shí)，LLLT可刺激間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致骨再生增強(qiáng)。本課題組[13]前期研究顯示LLLT在2～6 J/cm2時(shí)可促進(jìn)PDLSCs的增殖和成骨分化，在8 J/cm2時(shí)，LLLT可顯著抑制PDLSCs的成骨分化。本研究探討了LLLT與衰老PDLSCs增殖和成骨分化的關(guān)系。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4 J/cm2和8 J/cm2可顯著增強(qiáng)衰老PDLSCs的增殖。茜素紅染色、ALP活性、RT-PCR結(jié)果顯示，8 J/cm2可顯著增強(qiáng)衰老PDLSCs的成骨分化。前期研究對象為健康的PDLSCs，本次為衰老的PDLSCs，兩者的結(jié)果差異說明，不同微環(huán)境會影響LLLT對PDLSCs作用效果。

LLLT只有在適宜劑量應(yīng)用才有治療效果，具有雙相劑量反應(yīng)，即相同波長條件下低劑量的LLLT往往比高劑量的更有效，對組織的刺激和修復(fù)有更好的效果[19]。在本次研究中，4 J/cm2和8 J/cm2LLLT作用PDLSCs克隆形成率升高，成骨結(jié)節(jié)增加，ALP活性和成骨相關(guān)基因水平升高，然而16 J/cm2LLLT對細(xì)胞的作用顯示為相反的結(jié)果，說明LLLT對PDLSCs的作用也存在雙相劑量反應(yīng)。

Avci等[20]研究發(fā)現(xiàn)，LLLT可以通過降低炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)來抑制炎癥反應(yīng)。本課題組[13]前期研究顯示，2～8 J/cm2LLLT刺激PDLSCs中TNF-α和IL-β1的分泌。在本研究中，ELISA結(jié)果顯示，4 J/cm2和8 J/cm2的激光會使PDLSCs中炎癥細(xì)胞因子TNF-α水平下降。不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與細(xì)胞處于不同的微環(huán)境有關(guān)，在前期研究中，PDLSC是健康的，TNF-α和IL-β1的表達(dá)較少，而在以往研究和本次研究中，組織或細(xì)胞處于炎癥或衰老狀態(tài)，炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)率偏高。

綜上所述，衰老會降低PDLSCs的增殖和成骨分化水平，適宜強(qiáng)度的LLLT可以增強(qiáng)衰老PDLSCs的增殖能力和成骨分化潛能，這可以為應(yīng)用衰老PDLSCs修復(fù)牙周組織缺損提供參考。