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    子癇前期相關(guān)lncRNA SNHG12對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的影響

    2023-01-15 02:41:02欒麗霞陳國(guó)平惠淑寧王穩(wěn)瑩
    關(guān)鍵詞:子癇胎盤基因

    欒麗霞,楊 洋,陳國(guó)平,惠淑寧,王穩(wěn)瑩*

    (西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710077;西安市人民醫(yī)院,西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心;*通訊作者,E-mail:563694923@qq.com)

    子癇前期(pre-eclampsia,PE)是妊娠期所特有的全身多系統(tǒng)異常的疾病,全世界發(fā)病率高達(dá)5%~8%[1]。但該病確切機(jī)制未明,眾多學(xué)者認(rèn)為胎盤是引發(fā)PE的根源所在[2,3],其中滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)、侵襲功能異常而導(dǎo)致胎盤形成異常,為子癇前期發(fā)生的主要機(jī)制學(xué)說[4,5]。因此,研究影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能的相關(guān)因素,對(duì)于進(jìn)一步揭示子癇前期發(fā)病機(jī)制有一定的意義。

    近年來有研究發(fā)現(xiàn),部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與了PE的發(fā)病過程,并可以調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能[6]。越來越多證據(jù)表明,lncRNA不僅在細(xì)胞凋亡、侵襲以及腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用[7],還可以調(diào)控同為非編碼NRA(non-coding RNA, ncRNA)屬性的miRNA,間接影響下游靶基因從而發(fā)揮相應(yīng)的功能[8,9]。lncRNA-小核仁RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12,SNHG12)在腎透明細(xì)胞癌中可通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)miR-30a-3p,抑制腎癌細(xì)胞的遷移功能[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-3p在子癇前期呈特異性高表達(dá)[11],其靶基因SLUG(又稱Snail 2,鋅指蛋白2)在PE胎盤中病理性低表達(dá),并可影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能[12]。

    lncRNA-SNHG12是否與PE發(fā)病相關(guān),及其能否作為miR-30a-3p的上游因子發(fā)揮“ceRNA樣”作用,進(jìn)而影響下游靶基因SLUG表達(dá)而改變滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能,從而參與PE的發(fā)病,值得探究。本研究分析了SNHG12在重度子癇前期患者(sPE)胎盤組織中的表達(dá)及其可通過調(diào)控miR-30a-3p以及SLUG的表達(dá)影響JEG-3細(xì)胞侵襲功能。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料

    重度子癇前期孕婦(sPE組)和同期健康孕婦(正常組)胎盤組織均收集于2021年3月至2021年10月西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的首次接受剖宮產(chǎn)分娩的患者。根據(jù)既往文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,PE組胎盤組織中l(wèi)ncRNA-SNHG12的相對(duì)表達(dá)量約為0.5,正常組約為0.8,α=0.05,β=0.2,根據(jù)兩均數(shù)比較的樣本量計(jì)算公式得出每組需要16例,考慮標(biāo)本污染等因素,每組納入20例。其中,sPE組的納入依據(jù)第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。排除標(biāo)準(zhǔn):兩組均需排除合并糖尿病、慢性高血壓、心臟病、慢性腎炎以及自身免疫性疾病、血栓性疾病、精神疾病、感染性疾病的患者。本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有納入研究對(duì)象均簽署知情同意書。

    胎盤娩出后,選取胎盤母面剪取約1 cm3胎盤組織,無菌PBS沖洗組織后立即放入液氮中,-80 ℃保存待用。

    1.2 主要試劑及細(xì)胞株

    JEG-3細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫;PCR引物由廣州瑞博生物技術(shù)有限公司合成;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司(大連TaKaRa公司);空質(zhì)粒(pcDNA3.1)和SNHG12(pcDNA3.1-SNHG12)過表達(dá)質(zhì)粒、siRNA(SNHG12抑制序列)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;熒光定量試劑盒購自(天根生化科技(北京)有限公司);lipofectamineTM2000購自美國(guó)Beckman;鼠抗人SLUG、鼠抗人GAPDH一抗、二抗兔抗鼠購自美國(guó)Abcam。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

    JEG-3常規(guī)復(fù)蘇,接種于含10%FBS、1%鏈霉素-青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中;取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期JEG-3細(xì)胞,分為:對(duì)照組(NC)組、過表達(dá)(OE-SNHG12)組、抑制(si-SNHG12)組,按照脂質(zhì)體說明書步驟分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(pcDNA3.1)、SNHG12(pcDNA3.1-SNHG12)過表達(dá)質(zhì)粒、siRNA(SNHG12抑制序列)序列,轉(zhuǎn)染6 h后換液1次,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4 qRT-PCR檢測(cè)胎盤組織中l(wèi)ncRNA-SNHG12及轉(zhuǎn)染后JEG-3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-SNHG12、miR-30a-3p、SLUG mRNA表達(dá)

    按TRIzol試劑盒進(jìn)行兩組凍存胎盤組織及各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的RNA,隨后測(cè)定RNA質(zhì)量,反轉(zhuǎn)錄成cDNA -20 ℃留存。根據(jù)PrimerBank公布的基因序列設(shè)計(jì)合成lncRNA-SNHG12、miR-30a-3p、SLUG及內(nèi)參β-actin、U6的引物序列,具體序列見表1。

    表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Target gene primer sequences for qRT-PCR

    應(yīng)用比較分析Ct值法,使用2-△△Ct法計(jì)算各組中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。

    1.5 Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組JEG-3細(xì)胞侵襲功能

    將基質(zhì)膠稀釋后涂于Transwell(8 mm)的腔室頂層,將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種于上室(不含F(xiàn)BS的RPMI-1640液),小室下層加入含45 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)24 h后,使用70%乙醇固定侵襲入小室的細(xì)胞,而后0.1%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)對(duì)染色的細(xì)胞取4個(gè)視野進(jìn)行拍照并在顯微鏡下計(jì)數(shù),試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.6 Western blot檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組SLUG蛋白的表達(dá)

    轉(zhuǎn)染后48 h按細(xì)胞裂解液說明書提取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總蛋白,二辛可寧酸方法測(cè)定蛋白含量。取等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,而后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h(室溫)。加入SLUG(1 ∶2 500)或GAPDH鼠抗人一抗(1 ∶2 500),4 ℃過夜。PBST洗膜3次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1 ∶2 000)抗室溫放置2 h,PBST洗膜3次?;瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)后發(fā)光,X片曝光、顯影、定影。目的蛋白的表達(dá)量以SLUG/內(nèi)參GAPDH比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 胎盤組織中l(wèi)ncRNA-SNHG12的表達(dá)情況

    正常孕婦及sPE患者在年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2);根據(jù)既往文獻(xiàn),血壓、尿蛋白也是影響PE嚴(yán)重程度及可能影響SNHG12表達(dá)的指標(biāo)。因所有PE患者均有尿蛋白及血壓升高的情況,而健康患者均沒有,故這兩項(xiàng)指標(biāo)僅描述,不比較。sPE組的lncRNA-SNHG12相對(duì)表達(dá)量低于正常組(0.45±0.06vs0.88±0.12,P<0.001,見圖1)。

    表2 兩組患者基本資料Table 2 Basic information of the objects in two groups

    與正常組比較,***P<0.001圖1 lncRNA-SNHG12在正常與sPE患者胎盤組織中的表達(dá)Figure 1 Comparison of lncRNA-SNHG12 in placental tissue between normal controls and sPE patients

    2.2 lncRNA-SNHG12對(duì)JEG-3細(xì)胞中miR-30a-3p和SLUG的影響

    與對(duì)照組相比,過表達(dá)組中l(wèi)ncRNA-SNHG12表達(dá)水平顯著升高(P=0.001),抑制組中l(wèi)ncRNA-SNHG12表達(dá)水平顯著降低(P=0.005,見圖2)。

    與對(duì)照組比較,***P<0.01圖2 JEG-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后lncRNA-SNHG12的表達(dá)水平Figure 2 Expression levels of lncRNA-SNHG12 in JEG-3 cells after different transfection

    與對(duì)照組相比,過表達(dá)組中miR-30a-3p表達(dá)降低(P<0.001);抑制組miR-30a-3p表達(dá)升高(P<0.001,見圖3)。與對(duì)照組相比,過表達(dá)組中的SLUG在mRNA水平及蛋白水平均升高(P<0.001);抑制組中的SLUG在mRNA水平及蛋白水平均降低(P≤0.001,見圖4)。

    與對(duì)照組比較,***P<0.001圖3 JEG-3細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染后miR-30a-3p的相對(duì)表達(dá)水平Figure 3 Relative expression levels of miR-30a-3p in JEG-3 cells in each group

    與對(duì)照組比較,**P<0.01,***P<0.001圖4 各轉(zhuǎn)染組JEG-3細(xì)胞中SLUG mRNA及蛋白的表達(dá)水平Figure 4 Expression of SLUG mRNA and protein in JEG-3 cells in each group

    2.3 lncRNA-SNHG12對(duì)JEG-3細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響

    侵襲小室(Transwell)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力升高(P<0.001),抑制組細(xì)胞侵襲能力降低(P=0.007,見圖5)。

    與對(duì)照組比較,**P<0.01,***P<0.001圖5 lncRNA-SNHG12對(duì)JEG-3細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 5 Effect of lncRNA-SNHG12 on the invasion ability of JEG-3 cells

    3 討論

    PE常在妊娠20周后發(fā)病,可導(dǎo)致母兒預(yù)后不良[14],其病因尚未明確。目前認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常、氧化應(yīng)激、母-胎界面免疫異常[15]均參與了PE的發(fā)生發(fā)展,而胎盤是這一綜合征發(fā)病的中心機(jī)制。有研究提出滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異??赡軐?dǎo)致胎盤“淺著床”,最終誘發(fā)了PE的發(fā)生[16]。諸多研究表明,PE胎盤組織中存在差異表達(dá)的ncRNA(包含lncRNA、微小RNA等),這些ncRNA可介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞功能,最終參與PE發(fā)病過程[17,18]。lncRNA-SNHG12可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲進(jìn)而參與膠質(zhì)瘤、腎癌、結(jié)腸癌等腫瘤的進(jìn)展[19,20]。本研究顯示,lncRNA-SNHG12在PE患者胎盤組織中較正常孕婦明顯降低(P<0.05)。我們推測(cè)SNHG12可能參與了PE的發(fā)生過程,但仍需進(jìn)一步探究其具體機(jī)制。

    lncRNA與微小RNA(microRNA,miRNA)作為ncRNA的重要組成部分,在參與機(jī)體功能甚至腫瘤的生長(zhǎng)中均發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[21]。且lncRNA可作為microRNA“分子海綿”發(fā)揮“ceRNA”作用。已有多項(xiàng)研究證實(shí),SNHG12可以作為“ceRNA”多種miRNA并調(diào)節(jié)其下游靶標(biāo)的功能或表達(dá)。在胃癌中SNHG12可通過對(duì)miR-199a-5p發(fā)揮ceRNA作用,從而上調(diào)Argo2的表達(dá)[22];在腎透明細(xì)胞癌中l(wèi)ncRNA-SNHG12與miRNA-30a-3p之間的負(fù)向調(diào)控關(guān)系已經(jīng)證實(shí)[23]。本研究向人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞(JEG-3)中分別轉(zhuǎn)染SNHG12過表達(dá)及抑制序列,結(jié)果顯示:在JEG-3中過表達(dá)及抑制SNHG12后,miRNA-30a-3p出現(xiàn)負(fù)性表達(dá)(P<0.05)。與Zhou等[23]的研究具有一致性。

    SLUG作為Snail轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員,能夠參與腫瘤的發(fā)生過程[24]。SLUG與miRNA-30a-3p在3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)內(nèi)的種子序列可互補(bǔ)結(jié)合,兩者之間具有負(fù)性調(diào)控關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-3p可通過靶向SLUG抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)對(duì)胚胎著床產(chǎn)生一定影響[25]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-SNHG12與PE發(fā)病相關(guān)。且在人滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3中,miR-30a-3p的表達(dá)受到lncRNA-SNHG12的負(fù)調(diào)控。在此基礎(chǔ)上行侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)SNHG12后JEG-3細(xì)胞侵襲能力升高;反之,JEG-3細(xì)胞侵襲力降低(P<0.05)。SNHG12過表達(dá)可增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力,但具體機(jī)制未明。課題組前期發(fā)現(xiàn),PE患者胎盤組織中存在病理性高表達(dá)的miR-30a-3p,故我們對(duì)其靶基因SLUG進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)抑制SNHG12表達(dá),SLUG在mRNA及蛋白水平均減低(P<0.05)。我們猜測(cè)lncRNA-SNHG12可能通過“串聯(lián)網(wǎng)絡(luò)”負(fù)性調(diào)節(jié)miR-30a-3p,從而影響下游靶基因SLUG的表達(dá)抑制EMT進(jìn)程。這可能是導(dǎo)致PE滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能降低的機(jī)制之一。

    綜上所述,本次研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-SNHG12在sPE患者胎盤組織中表達(dá)下調(diào),并可能引起滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力失常,最終誘發(fā)PE的發(fā)生。本研究為探究PE的發(fā)病機(jī)制及診斷方法提供了新的視角。

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