DNMT3B對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖和侵襲的影響

夏瑩瑩，李欣雨，時康云，王雯婧，段菲凡，李 強*

(1蚌埠醫(yī)學院生命科學院細胞生物學系，蚌埠 233030；2安徽省癌癥轉化醫(yī)學重點實驗室；*通訊作者,E-mail:2812426235@qq.com)

甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤，患病率正在逐年增加，其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)是最常見的亞型[1]。甲狀腺癌的常規(guī)治療方法包括甲狀腺切除術、放射性碘治療和促甲狀腺激素抑制治療。雖然總體預后相對較好，但仍有一小部分患者出現(xiàn)了淋巴結轉移、復發(fā)以及耐藥等不良癥狀[2]。因此尋找新的診斷標記物對PTC的早期診斷和治療具有重要意義。

DNA甲基化是基因表達調控重要的表型遺傳修飾方式之一，與腫瘤的形成密切相關，DNA甲基化主要由DNA甲基轉移酶(DNA(cytosine-5)-methyl-transferases，DNMTs)所催化[3]。目前，具有催化活性的DNMTs有3種：DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中，DNMT3B是一類重要的甲基轉移酶，具有從頭甲基化的作用。研究表明，DNMT3B在肺癌、前列腺癌、肝細胞癌、黑色素瘤和膀胱癌[4]中顯著高表達。然而DNMT3B在PTC中的作用尚不清楚。因此，本研究在甲狀腺乳頭狀癌細胞株BCPAP中敲減DNMT3B，通過對BCPAP細胞增殖、遷移及侵襲能力的檢測，探究了DNMT3B在PTC中發(fā)揮調控的分子機制，為PTC發(fā)病機制的研究提供新的方向和線索。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人甲狀腺濾泡上皮正常細胞Nthy-ori 3-1和甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC1、BCPAP、K1均購自合肥維三生物科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，si-NC和si-DNMT3B購自廣州銳博生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗、極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、CCK-8溶液、RIPA細胞裂解試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、EpiTect Bisulfite Kit試劑盒、轉染試劑Lipo8000以及cDNA反轉錄試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，實時熒光定量PCR試劑2×Real Star Green Fast Mixture(with ROX Ⅱ)購自GenStar北京康潤生物有限公司，一抗(DNMT3B，DAPK，Bax，RASSF1A，β-肌動蛋白)購自上海艾博抗貿易有限公司，Transwell小室和Matrigel基質膠購自美國康寧(Corning)公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及siRNA轉染

BCPAP細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。實驗分為空白對照組(control組，不進行轉染)、陰性對照組(si-NC組，轉染不能干擾DNMT3B表達的陰性siRNA)和敲減DNMT3B組(si-DNMT3B組，轉染可以干擾DNMT3B表達的siRNA)。轉染對象為處于對數(shù)生長期的細胞，轉染時細胞融合度達到70%，轉染步驟嚴格按照Lipo8000轉染試劑說明書進行，24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測DNMT3B，DAPK，Bax和RASSF1A基因的相對水平

收集甲狀腺濾泡上皮正常細胞Nthy-ori 3-1和甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC1、BCPAP、K1以及轉染后的各組細胞，采用Trizol提取細胞總RNA，各取200 ng的RNA進行反轉錄，隨后進行qRT-PCR檢測，擴增條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，以β-actin為內參對照，最終Ct值采用2-ΔΔCt方法分析，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR amplification

1.4 Western blot實驗檢測DNMT3B、DAPK、Bax和RASSF1A蛋白表達水平

收集甲狀腺濾泡上皮正常細胞Nthy-ori 3-1和甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC1、BCPAP、K1以及轉染后的各組細胞提取總蛋白，取20 μg/孔上樣，于10% SDS-PAGE進行電泳，電泳結束后使用PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入DNMT3B一抗(1 ∶1 000稀釋)，DAPK一抗(1 ∶1 000稀釋)，Bax一抗(1 ∶1 000稀釋)和β-actin一抗(1 ∶1 000稀釋)于4 ℃過夜孵育，TBST洗膜，二抗(1 ∶4 000稀釋)室溫避光孵育2 h，TBST洗膜，采用ECL化學發(fā)光法于凝膠成像儀顯影拍照。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將處于對數(shù)生長期的細胞消化計數(shù)，調整細胞密度為6 000個/孔的細胞懸液，取100 μl接種至96孔板。待細胞密度達到50%時進行轉染，分別在轉染0，24，48，72 h時，向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，2 h后使用酶標儀檢測450 nm時的OD值，繪制生長曲線。每次實驗重復3次，每組設定3個復孔。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

取空白對照組、陰性對照組和敲減DNMT3B組中處于對數(shù)生長期的BCPAP細胞，按5×105個/孔細胞接種于12孔板中，待細胞融合度達到80%進行轉染，24 h后，收集上清和細胞于流式管中，流式細胞檢測實驗需要將前述3個組別中每個單獨組別進一步分為分為雙陰組(不加任何染液)、Annexin Ⅴ/FITC單染組和PI單染組以及Annexin Ⅴ/FITC和PI雙染組，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。并對早期凋亡區(qū)域細胞百分比進行統(tǒng)計求平均值。

1.7 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力

將轉染后的各組細胞消化計數(shù)，按6×104個/小室的細胞密度接種于Transwell上室，下室加入完全培養(yǎng)基。24 h后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.25%結晶紫染色30 min，清洗后統(tǒng)計跨膜細胞數(shù)并計算平均值。遷移抑制率(%)=(1-處理組遷移細胞個數(shù)/對照組遷移細胞個數(shù))×100%。

將稀釋好的基質膠(1 ∶100)加入Transwell小室中于37 ℃包被待用，隨后，將轉染后的各組細胞消化計數(shù)，按6×104個/小室的細胞密度接種于Transwell上室，下室加入完全培養(yǎng)基。24 h后用4%多聚甲醛固定20 min，0.25%結晶紫染色30 min，清洗后統(tǒng)計跨膜細胞數(shù)并計算平均值。侵襲抑制率(%)=(1-處理組侵襲細胞個數(shù)/對照組侵襲細胞個數(shù))×100%。

1.8 甲基化特異性PCR檢測

收集轉染24 h的BCPAP細胞，提取細胞總DNA，隨后進行亞硫酸氫鹽修飾處理。該步驟大致如下：用0.2 mol/L的NaOH在37 ℃條件下使得DNA變性10 min，加入30 μl現(xiàn)配的10 mmol/L的氫醌與40.5%亞硫酸氫鈉混勻液，50 ℃避光溫育16 h，隨后用DNA純化柱洗脫，用0.3 mol/L的NaOH室溫孵育5 min，之后用乙醇沉淀，收集并溶于20 μl的水中，隨后取1 μl處理后的DNA進行PCR反應，反應條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，52 ℃，30 s，72 ℃，30 s，45 cycles；72 ℃，10 min；4 ℃，擴增目的基因。反應結束后，取5 μl擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。Image J軟件分析條帶的亮度，通過計算甲基化(methylated, M)與甲基化加上未甲基化(unmethylated, U)的比值即M/(U+M)來衡量DNA的甲基化程度。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 DNMT3B在不同甲狀腺癌細胞系中的表達水平

qRT-PCR和Western blot實驗結果表明，與正常人甲狀腺細胞相比，DNMT3B在TPC-1細胞和K1細胞中的mRNA和蛋白水平較高(P<0.01)，在BCPAP細胞中的mRNA和蛋白水平最高(P<0.01，見圖1)。由于BCPAP細胞中DNMT3B表達量最高，因此選擇BCPAP細胞進行后續(xù)研究。

與Nthy-ori3-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 DNMT3B在不同甲狀腺癌細胞系中的表達水平Figure 1 Expression of DNMT3B in different thyroid cancer cell lines

2.2 qRT-PCR和Western blot檢測細胞中DNMT3B的表達

與control組和si-NC組相比，si-DNMT3B組BCPAP細胞中DNMT3B mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.01，見圖2)。表明si-RNA成功敲減DNMT3B在BCPAP細胞中的表達。

與control組和si-NC組比較，**P<0.01圖2 BCPAP細胞中DNMT3B mRNA及蛋白表達水平Figure 2 Expression levels of DNMT3B mRNA and protein in BCPAP cells

2.3 敲減DNMT3B對BCPAP細胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測細胞增殖的結果顯示，與control組和si-NC組比較，si-DNMT3B組BCPAP細胞在24，48，72 h時OD值明顯減小(P<0.01，見圖3)。表明敲減DNMT3B能夠抑制BCPAP細胞的增殖能力。

與control組和si-NC組比較，**P<0.01圖3 CCK-8實驗檢測敲減DNMT3B后對BCPAP細胞增殖能力的影響Figure 3 Influence of interfering DNMT3B on proliferation of BCPAP cells by CCK-8

2.4 敲減DNMT3B對細胞凋亡的影響

采用流式細胞術對BCPAP細胞凋亡情況分別進行檢測，結果顯示，si-NC組和si-DNMT3B組的早期凋亡細胞比例分別為(6.17±0.69)%，(6.36±0.48)%和(14.46±0.92)%，與control組和si-NC組比較，si-DNMT3B組細胞凋亡增加(P<0.01，見圖4)。

與control組和si-NC組比較，**P<0.01圖4 流式細胞儀檢測敲減DNMT3B對BCPAP細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of interfering DNMT3B on apoptosis of BCPAP cells detected by flow cytometry

2.5 敲減DNMT3B對BCPAP細胞遷移和侵襲能力的影響

敲減DNMT3B后，Transwell實驗結果顯示，與control組和si-NC組比較，si-DNMT3B組BCPAP細胞遷移和侵襲率顯著降低(P<0.01，見圖5)。表明敲減DNMT3B能夠增強BCPAP細胞的遷移及侵襲能力。

與control組和si-NC組比較，**P<0.01，橫線代表50 μm圖5 Transwell實驗檢測敲減DNMT3B后對BCPAP細胞遷移及侵襲能力的影響Figure 5 Effect of interfering DNMT3B on migration and invasion of BCPAP cells by Transwell assay

2.6 敲減DNMT3B對細胞凋亡相關基因表達的影響

采用熒光定量PCR和Western blot檢測敲減DNMT3B對細胞凋亡相關基因mRNA的蛋白水平表達的影響。熒光定量PCR結果顯示，與control組和si-NC組比較，敲減DNMT3B組細胞凋亡相關基因DAPK，Bax和RASSF1A mRNA的表達增加。Western blot結果顯示，與control組和si-NC組比較，敲減DNMT3B組細胞凋亡相關基因DAPK，Bax和RASSF1A蛋白的表達增加(P<0.01，見圖6)。

與control組和si-NC組比較，**P<0.01圖6 敲減DNMT3B對細胞生長及凋亡相關基因表達的影響Figure 6 Effects of interfering DNMT3B on cell growth and expression of apoptosis-related genes

2.7 敲減DNMT3B對細胞凋亡相關基因甲基化的影響

采用甲基化特異性PCR檢測敲減DNMT3B對細胞凋亡相關基因甲基化的影響，結果發(fā)現(xiàn)，與si-NC組比較，si-DNMT3B組細胞凋亡相關基因DAPK、Bax和RASSF1A啟動子區(qū)域的甲基化水平減少(見圖7)。

與si-NC組比較，**P<0.01；M代表著甲基化，U代表著未甲基化圖7 甲基化特異性PCR檢測敲減DNMT3B對細胞生長及凋亡相關基因甲基化影響Figure 7 Effect of interfering DNMT3B on methylation of cell growth and apoptosis-related genes detected by methylation specific PCR

3 討論

DNA甲基化是最重要的表觀遺傳學修飾之一，而異常的CpG島甲基化是人類腫瘤的一大特征，大量細胞DNA高甲基化可能導致基因組和染色體趨向不穩(wěn)定，引起抑癌基因失活并導致癌癥的發(fā)生[5]。DNA的低甲基化與DNA甲基化轉移酶表達異常有關，其中DNMT3B的高表達并伴隨著抑癌基因的高甲基化沉默已被證實與肝癌[6]、結腸癌[7]等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。然而，DNMT3B的高表達與PTC的發(fā)生是否相關還未得到證實，且具體分子機制尚不清楚。本研究探究DNMT3B在體外對PTC細胞增殖及侵襲遷移的影響，采用si-RNA技術敲減DNMT3B后，用DNMT3B-siRNA轉染BCPAP細胞，發(fā)現(xiàn)細胞增殖及侵襲遷移能力明顯下降，凋亡率明顯增加。說明敲減DNMT3B能夠抑制PTC細胞的增殖和侵襲轉移，促進其凋亡，與其他關于DNMT3B對于癌癥作用的研究結果相似[8,9]。表明DNMT3B可能是PTC早期診斷的一個關鍵性標記物。

RASSF1A、DAPK和Bax是重要的凋亡相關基因，它們的高表達可以明顯抑制許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且研究表明這3個基因的啟動子上存在明顯的甲基化修飾[10]。本研究結果顯示敲減DNMT3B可以顯著減少RASSF1A、DAPK和Bax這3個基因的啟動子甲基化水平，促進了這3個基因的表達，從而抑制了PTC細胞的增殖遷移和侵襲，這為其他腫瘤中探究DMNT3B是否具有類似調控機制提供了依據(jù)。同時，研究其他抑癌基因的甲基化修飾和表達有望為PTC發(fā)生發(fā)展的機制研究提供新的方向。且其他的甲基化修飾基因乃至不同類型的表觀修飾(如m6A，乙?；?基因是否也具有相似的作用同樣值得研究。

綜上所述，敲減DNMT3B能夠有效抑制PTC細胞的增殖和侵襲遷移能力，并能促進細胞的凋亡，其機制可能與DNMT3B通過DNA甲基化調控細胞凋亡相關基因DAPK、Bax和RASSF1A的表達有關。本研究為PTC的治療提供了理論基礎，DNMT3B有望成為PTC新的診斷和治療靶點，但關于DNMT3B影響PTC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制有待進一步研究。