lncRNA NEAT1在乳腺癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及作用機(jī)制

司 剛，司 貞，鐘國(guó)南，錢麗華

(1?？谑袐D幼保健院藥學(xué)部，?？?570102；2瓊海市中醫(yī)院藥學(xué)部；3海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院)

乳腺癌(breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，隨著環(huán)境與生活方式的改變，乳腺癌的發(fā)病率急劇上升，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1-3]。目前臨床應(yīng)用的多數(shù)治療策略僅針對(duì)乳腺細(xì)胞，而忽視了對(duì)腫瘤微環(huán)境的改善，但研究表明，腫瘤微環(huán)境在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[4,5]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生存的復(fù)雜環(huán)境，主要由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成[5]。其中巨噬細(xì)胞作為腫瘤間質(zhì)中的重要細(xì)胞群，能通過(guò)呈現(xiàn)特殊的表型特征參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[6-8]。有數(shù)據(jù)表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸，并促使腫瘤細(xì)胞對(duì)多種藥物產(chǎn)生耐藥性等[7-9]。因此，積極探究調(diào)控乳腺癌微環(huán)境中TAMs分化及功能的相關(guān)機(jī)制具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在生物體的生命運(yùn)動(dòng)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期和個(gè)體發(fā)育以及免疫細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用[10,11]。既往研究報(bào)道，lncRNA NEAT1在乳腺癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)呈異常升高現(xiàn)象，且與較高的組織學(xué)分級(jí)和患者不良預(yù)后密切相關(guān)[12-16]。近年來(lái)進(jìn)一步的研究證實(shí)，lncRNA NEAT1可在體內(nèi)外通過(guò)多種途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移[13-16]。而在其他疾病中，lncRNA NEAT1還能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的分化，從而參與調(diào)控疾病的進(jìn)展[17,18]，但在乳腺癌微環(huán)境中高表達(dá)lncRNA NEAT1是否同樣能夠參與調(diào)控TAMs的形成與維持尚不清楚。因此，本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究lncRNA NEAT1在乳腺癌中TAMs的作用，以期進(jìn)一步闡明乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本來(lái)源

選取自2019年10月至2021年1月?？谑袐D幼保健院確診的30例乳腺癌患者的腫瘤組織和30例健康體檢患者的外周血作為臨床樣本。乳腺癌患者的年齡在33～77歲之間，平均年齡為(55.4±9.2)歲。臨床病理學(xué)分析顯示，Ⅰ～Ⅱ期患者21例、Ⅲ期患者9例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者10例。對(duì)照組年齡在37～79歲之間，平均年齡為(58.6±8.4)歲，兩組受試者的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①兩組受試者均為女性患者；②乳腺癌患者術(shù)后診斷診斷為原發(fā)性乳腺癌，且術(shù)前均未接受放療、化療或免疫抑制劑等相關(guān)治療；③兩組受試者均未合并其他組織或臟器的原發(fā)性惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌等相關(guān)疾??；④兩組受試者的臨床資料完整，且患者及家屬知情同意。使用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離乳腺癌組織中的TAMs(TAMs組)和健康體檢患者外周血中的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(PBMC組)，并使用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞在TAMs組與PBMC組中的極化水平及l(fā)ncRNA NEAT1的表達(dá)。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要材料與試劑

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購(gòu)自美國(guó)ATCC菌株保藏中心;人單核巨噬細(xì)胞THP-1與小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；30只6周齡的雌性BALB/c裸鼠購(gòu)自海南藥物研究所有限責(zé)任公司；靶向沉默lncRNA NEAT1基因表達(dá)和陰性對(duì)照的慢病毒載體(LV-shNEAT1與LV-NC,病毒滴度為4×108TU/ml)由江蘇金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建與合成；MTT試劑，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室(0.4 μm與8 μm孔徑)(美國(guó)Millipore公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、Ⅳ型膠原酶、DNase Ⅰ酶、佛波酯(PMA)、青霉素(100 U/ml)與鏈霉素(100 μg/ml)混合溶液、干擾素-γ(interferon γ， IFN-γ),白細(xì)胞介素-4(interlukin-1, IL-4)，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(美國(guó)Sigma公司)；兔抗小鼠TNF-α,人類白細(xì)胞抗原DR(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR),精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)抗體(美國(guó)Abcam公司)；兔抗小鼠CD163、CD206、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(美國(guó)Jackson Immuno-Research公司)；兔抗小鼠E-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；NanoDrop分光光度計(jì)(Thermo Fisher Science公司);光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；RT-PCR儀(iQ型,美國(guó)Bio-Rad公司)；RT-PCR引物由廣州銳博生物科技公司合成。

1.3 方法

1.3.1 乳腺癌組織中TAMs與外周血中巨噬細(xì)胞的分離 參考文獻(xiàn)方法[19]從乳腺癌患者新鮮腫瘤組織中分離TAMs，簡(jiǎn)述如下：滅菌外科剪剪碎分散乳腺癌組織塊，0.3%的Ⅳ膠原酶、DNase Ⅰ與透明質(zhì)酸混合液于37 ℃水浴鍋中消化溶解2 h，加入紅細(xì)胞裂解液以去除紅細(xì)胞，0.125%的胰蛋白酶繼續(xù)攪拌消化45 min后，70目濾網(wǎng)過(guò)濾后，取過(guò)濾液，2 200 r/min離心10 min，取下層沉淀，PBS溶液重懸后，使用等體積的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液利用葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度離心法在室溫下分離上述乳腺癌組織消化液中的巨噬細(xì)胞，離心純化后收集細(xì)胞。外周血中單個(gè)核細(xì)胞的分離：使用含EDTA抗凝管收集健康對(duì)照組的肘靜脈血8 ml，2 200 r/min離心5 min，取底層細(xì)胞沉淀，同樣利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法于室溫下分離PBMC，離心純化后收集PBMC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)與巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo) MCF-7、THP-1和Raw264.7細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%FBS與1%青霉素與鏈霉素雙抗溶液的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1，使用50 ng/ml的PMA刺激THP-1細(xì)胞48 h使其活化為M0型貼壁細(xì)胞。參考文獻(xiàn)方法[20]聯(lián)合使用300 ng/ml LPS與30 ng/ml IFN-γ處理貼壁后的THP-1與Raw264.7細(xì)胞進(jìn)行M1型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)，使用20 ng/ml的IL-4處理上述細(xì)胞進(jìn)行M2型的誘導(dǎo)分化。24 h后使用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞中M2型標(biāo)記分子Arg-1、CD206和CD163與M1型標(biāo)記分子TNF-α和HLA-DR的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行鑒定M1與M2型巨噬細(xì)胞的極化。

1.3.3 慢病感染與細(xì)胞分組 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Raw264.7細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按5×105個(gè)/孔接種至6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，按加入含LV-shNEAT1或LV-NC的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染液，感染指數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為25。將慢病毒轉(zhuǎn)染液與細(xì)胞緩慢充分混勻后，置于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，8 h更換為含10%的RPMI-1640培養(yǎng)液，感染48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)感染效率。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，使用含10%FBS與2 mg/L的嘌呤霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行篩選以建立穩(wěn)定感染LV-shNEAT1或LV-NC的細(xì)胞系。將Raw264.7細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞MCF-7在Transwell(0.4 μm)共培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，并將共培養(yǎng)體系分為3組：LV-NC組、LV-shNEAT1組和control組。其中LV-NC組的Transwell共培養(yǎng)體系中上室為感染LV-NC的Raw264.7細(xì)胞，下室為MCF-7細(xì)胞；LV-shNEAT1組上室為感染LV-shNEAT1的Raw264.7細(xì)胞，下室為MCF-7細(xì)胞；control組上室為未轉(zhuǎn)染的Raw264.7細(xì)胞，下室為MCF-7細(xì)胞；各組共培養(yǎng)體系置于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別用于EdU實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取1.3中的各組Transwell共培養(yǎng)體系中MCF-7細(xì)胞，棄原培養(yǎng)液，每孔加入150 μl終濃度為50 μmol/L的EdU試劑，37 ℃下孵育2 h后，將各組MCF-7細(xì)胞于4%多聚甲醛溶液中固定20 min，然后加入2 mg/ml甘氨酸5 min，PBS充分洗滌后，0.5% TritonX-100透化細(xì)胞10 min。再次用PBS洗滌后，加入終濃度為1 mg/ml的DAPI試劑在室溫下孵育30 min進(jìn)行染核。最后熒光顯微鏡觀察拍照，其中EdU陽(yáng)性(紅色)細(xì)胞表示正在進(jìn)行DNA復(fù)制的增殖期細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種至預(yù)先包被BD基質(zhì)膠的Transwell(8 μm)上室中，下室為接種等密度的感染LV-NC或LV-shNEAT1或未轉(zhuǎn)染的Raw264.7細(xì)胞，并按1.3方法繼續(xù)分為L(zhǎng)V-NC組、LV-shNEAT1組和control組，培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦拭上室未穿出的細(xì)胞，95%酒精于室溫下固定15 min，自然風(fēng)干后，0.1%的結(jié)晶紫染色，PBS沖洗細(xì)胞3次，最后使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA NEAT1和Arg-1、CD206、CD163、TNF-α及HLA-DR的mRNA表達(dá)水平

取待測(cè)細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒收集細(xì)胞中的總RNA，NanoDrop分光光度計(jì)進(jìn)行定量后，反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板按照SYBR PreMix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸20 s，40個(gè)循環(huán)周期。使用閾值周期(Ct)測(cè)定目標(biāo)基因的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Arg-1、CD206、CD163、TNF-α、HLA-DR及E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白表達(dá)水平

使用RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑提取待測(cè)細(xì)胞中的總蛋白，BCA法進(jìn)行定量，經(jīng)加熱變性后，取約35 μg蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉于室溫下封閉抗體1 h，加入一抗：TNF-α(1 ∶1 000),HLA-DR(1 ∶1 000),Arg-1(1 ∶1 000),CD163(1 ∶1 000),CD206(1 ∶1 000),N-cadherin(1 ∶800),N-cadherin(1 ∶800)、Vimentin(1 ∶500)和Snail(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)二抗，最后加入化學(xué)發(fā)光液于凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.8 裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)

將30只飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境下的雌性BALB/c裸鼠隨機(jī)分為3組：control組、LV-NC組和LV-shNEAT1組。其中control組向裸鼠注射含MCF-7細(xì)胞的PBS懸液；LV-NC組向裸鼠注射聯(lián)合注射感染LV-shNC的Raw264.7與MCF-7細(xì)胞；LV-shNEAT1組向裸鼠注射聯(lián)合注射感染LV-shNEAT1的Raw264.7細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞。其中LV-NC組與LV-shNEAT1組小鼠于右側(cè)前肢腋下經(jīng)皮注射約含1×105/ml個(gè)感染LV-shNC或LV-shNEAT1慢病毒的Raw264.7細(xì)胞與1×106/ml MCF-7的細(xì)胞懸液。control組僅注射同體積約含1×106/ml MCF-7細(xì)胞懸液。每2 d測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)度與寬度，并監(jiān)測(cè)腫瘤體積[=(長(zhǎng)度×寬度2)/2]生長(zhǎng)情況，持續(xù)28 d。28 d后脫頸處死各組小鼠，手術(shù)剝離腫瘤組織，拍照后，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成2 μm厚的連續(xù)切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色與Ki-67的免疫組織化學(xué)染色以觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖情況。

1.9 HE染色檢測(cè)移植瘤組織的病理學(xué)改變與免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Ki-67的表達(dá)

HE染色：取固定于4%多聚甲醛溶液中的腫瘤組織，常規(guī)使用梯度酒精與二甲苯脫水透化，石蠟包埋，并切片(厚約4 μm)后，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精與伊紅染色，隨后再次使用梯度酒精與二甲苯脫水，封片后，倒置顯微鏡下觀察拍照。

免疫組織化學(xué)染色：將腫瘤組織切片于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，微波加熱已修復(fù)抗原后，使用3%的過(guò)氧化氫溶液浸泡以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS充分洗滌后，加入兔抗小鼠Ki-67，4 ℃下孵育過(guò)夜，隨后加入二抗，DAB試劑盒染色，蘇木素復(fù)染，最后使用Image J軟件分析，以累積吸光度值作為指標(biāo)進(jìn)行比較分析。其中細(xì)胞核為藍(lán)色，棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NEAT1在TAMs中的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照人群的PBMC相比，乳腺癌患者的TAMs中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子Arg-1、CD206和CD163的mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子TNF-α、HLA-DR的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；lncRNA NEAT1的檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照人群的PBMC相比，乳腺癌患者的TAMs中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，見圖1)。

與PBMC相比，*P<0.05，**P<0.01圖1 RT-PCR檢測(cè)M1與M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子和lncRNA NEAT1的表達(dá)水平Figure 1 Expression of M1 and M2 macrophage marker molecules and the expression levels of lncRNA NEAT1 by RT-PCR

2.2 lncRNA NEAT1在體外誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞中，與M0型相比，M1型中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但M2型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，且與M1型巨噬細(xì)胞相比，lncRNA NEAT1在M2型中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與RAW264.7來(lái)源的M0型巨噬細(xì)胞相比，M1型中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但在M2型中的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，且與M1型細(xì)胞相比，lncRNA NEAT1在M2型中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01，見圖2)。這提示無(wú)論在人源性或小鼠源性巨噬細(xì)胞中，lncRNA NEAT1在M2型中的表達(dá)均顯著升高，在M1型中的表達(dá)明顯降低。

與同來(lái)源M0型相比，*P<0.05；與同來(lái)源M1型相比，##P<0.01圖2 RT-PCR檢測(cè)lncRNA NEAT1在體外誘導(dǎo)的M1與M2型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 2 Expression level of lncRNA NEAT1 in M1 and M2 macrophages induced in vitro by RT-PCR

2.3 沉默lncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染LV-shNEAT1的細(xì)胞中l(wèi)ncRNANEAT1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，感染LV-NC的細(xì)胞無(wú)明顯差異(P>0.05，見圖3A)。RT-PCR和Western blot檢測(cè)共培養(yǎng)體系中RAW264.7細(xì)胞中M1型和M2型分子標(biāo)記物的mRNA和蛋白表達(dá)水平的結(jié)果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組RAW264.7細(xì)胞中Arg-1、CD206、CD163的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，而TNF-α、HLA-DR的mRNA和蛋白表達(dá)水平表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；但與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、HLA-DR的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而Arg-1、CD206、CD163的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05，見圖3B、C)。這提示乳腺癌細(xì)胞能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化，而沉默RAW264.7中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)可顯著抑制其向M2型巨噬細(xì)胞的分化能力,并促進(jìn)其向M1型巨噬細(xì)胞分化。

C.Western blot檢測(cè)沉默lncRNA NEAT1的表達(dá)對(duì)各組RAW264.7細(xì)胞分化的影響與RAW264.7巨噬細(xì)胞相比，&P<0.05；與control組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P<0.05圖3 RT-PCR與Western blot檢測(cè)沉默lncRNA NEAT1后對(duì)RAW264.7細(xì)胞極化的影響Figure 3 Effect of silencing lncRNA NEAT1 on the polarization of RAW264.7 cells by RT-PCR and Western blot

2.4 沉默巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組中MCF-7的EdU陽(yáng)性率均顯著升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組中EdU陽(yáng)性率卻明顯降低(P<0.05，見圖4)。

紅色為EdU陽(yáng)性，細(xì)胞核為藍(lán)色圖4 EdU染色檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞的增殖能力Figure 4 The proliferation ability of breast cancer cells in various groups by EdU staining

2.5 沉默巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)能力的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組MCF-7細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組MCF-7細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05，見圖5)。

與control組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P<0.05圖5 Western blot檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)Figure 5 Expression of EMT-associated proteins E-cadherin, N-cadherin, Vimentin and Snail in breast cancer cells detected by Western blot

2.6 沉默巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組MCF-7細(xì)胞侵襲能力均顯著升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組中乳腺癌細(xì)胞侵襲能力明顯降低(P<0.05，見圖6)。

與control組相比，*P<0.05；與LV-NC組相比，#P<0.05圖6 Transwell檢測(cè)各組乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力 (×200)Figure 6 The invasion ability of breast cancer cells detected by Transwell method (×200)

2.7 沉默巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)速度和腫瘤質(zhì)量均顯著升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)速度和腫瘤質(zhì)量均明顯降低(P<0.05，見圖7A)。移植瘤組織的HE染色結(jié)果表明，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組腫瘤細(xì)胞核增大，染色加深，而LV-NC組又較LV-shNEAT1組的變化更為顯著；移植瘤組織中Ki-67染色結(jié)果顯示，與control組相比，LV-NC組和LV-shNEAT1組Ki-67陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)，而與LV-NC組相比，LV-shNEAT1組Ki-67陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05，見圖7B)。

B.各組裸鼠移植瘤組織的HE染色與Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率圖7 沉默巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響Figure 7 Effect of silencing lncRNA NEAT1 expression in macrophages on the growth of breast cancer xenografts

3 討論

最近的研究證實(shí)lncRNA在腫瘤的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，這對(duì)未來(lái)新治療靶點(diǎn)的研發(fā)具有重要啟示意義[10]。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者已報(bào)道，lncRNA NEAT1參與乳腺癌的增殖與侵襲，但其在TAMs的極化與維持中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)體內(nèi)外水平，系統(tǒng)探究了lncRNA NEAT1在調(diào)控乳腺癌TAMs極化和功能中的作用，進(jìn)一步解析了lncRNA NEAT1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，為臨床的應(yīng)用研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。如前所述，巨噬細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)中的一個(gè)重要群體，其能通過(guò)經(jīng)典激活的M1型和交替激活的M2型來(lái)改變其功能，以參與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[6-8]。M1巨噬細(xì)胞通過(guò)表達(dá)促炎因子(如TNF-α)參與炎癥反應(yīng)，而在實(shí)體腫瘤微環(huán)境中，外周血單核細(xì)胞通過(guò)血管滲入腫瘤組織主要分化為M2型，即TAMs，并分泌相關(guān)細(xì)胞因子如白介素-4(interlukin-4,IL-4)或IL-10，以促進(jìn)血管生成、基質(zhì)合成和免疫逃逸[6,7]。研究表明，在腫瘤發(fā)展的初級(jí)階段，外周血單核細(xì)胞通過(guò)血管滲入腫瘤組織并極化為M1型巨噬細(xì)胞，并通過(guò)產(chǎn)生TNF-α、活性氧等發(fā)揮吞噬與促炎作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。但在腫瘤發(fā)展的中晚期，腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β，通過(guò)抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的激活，來(lái)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[6-9]。在本研究中，課題組通過(guò)檢測(cè)M1型標(biāo)志分子TNF-α、HLA-DR和M2型標(biāo)志分子Arg-1、CD206、CD163來(lái)評(píng)估乳腺癌患者腫瘤組織中的M2型巨噬細(xì)胞比例，結(jié)果證實(shí)，與正常對(duì)照人群的PBMC相比，乳腺癌組織中的M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平顯著升高。這與既往研究結(jié)果一致，均提示乳腺癌微環(huán)境能夠誘導(dǎo)外周血M0型單核巨噬細(xì)胞向M2型極化，即TAMs主要以M2型巨噬細(xì)胞為主。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在TAMs中，lncRNA NEAT1表達(dá)水平明顯升高。結(jié)合之前國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道的lncRNA NEAT1在乳腺癌組織中存在異常高表達(dá)的現(xiàn)象[12-16]，上述結(jié)果并不意外。同時(shí)，為進(jìn)一步研究lncRNA NEAT1在人源性與小鼠源性的M2型巨噬細(xì)胞中的高表達(dá)水平，課題組在體外誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞系THP-1與小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的M1與M2型分化，結(jié)果再次表明，lncRNA NEAT1在M2型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著增加，而M1型中的表達(dá)水平明顯降低。這進(jìn)一步說(shuō)明lncRNA NEAT1參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的M1與M2型極化。

M2型巨噬細(xì)胞，也稱為交替激活的巨噬細(xì)胞，可通過(guò)IL-4、IL-13或TGF-β誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化形成[20]。M2巨噬細(xì)胞可通過(guò)釋放抗炎因子(如IL-10和TGF-β)、免疫抑制因子(如前列腺素E2、Arg-1、生長(zhǎng)抑素)等來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、EMT與侵襲能力[21,22]。最新研究報(bào)道，lncRNA NEAT1可在多種疾病中調(diào)控巨噬細(xì)胞的M2型分化，如Zhang等[23]在脈絡(luò)膜新生血管中發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可通過(guò)發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性RNA的功能來(lái)抑制miRNA-148a-3p的作用，從而靶向調(diào)控人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)的表達(dá)，誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，從而參與脈絡(luò)膜新生血管的形成，而下調(diào)lncRNA NEAT1則可抑制M2巨噬細(xì)胞的體內(nèi)外活動(dòng)改善疾病的進(jìn)展。在膠質(zhì)細(xì)胞的活化中，Liu等[18]學(xué)者報(bào)道，lncRNA NEAT1在小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞中顯著高表達(dá)，而敲除該基因的表達(dá)能通過(guò)削弱其對(duì)miR-224-5p/IL-33軸的抑制，上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1、CD206、CD163與細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TGF-β的表達(dá)水平。而Gao等[24]在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)lncRNA NEAT1可通過(guò)抑制miR-214的表達(dá)，從而解除后者對(duì)CD276的負(fù)向調(diào)控作用，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化。上述文獻(xiàn)提示lncRNA NEAT1可正向促進(jìn)或誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的分化。但在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷中，Wang等[17]則報(bào)道敲除lncRNA NEAT1基因可通過(guò)miR-125a-5p/腫瘤壞死因子受體6(TRAF6)/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子活化激酶1(TAK1)軸促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，從而改善LPS誘導(dǎo)的炎癥。這說(shuō)明，lncRNA NEAT1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響可能在不同疾病中的作用存在差異。本實(shí)驗(yàn)在小鼠源性巨噬細(xì)胞RAW264.7中，利用慢病毒沉默lncRNA NEAT1表達(dá)探究其對(duì)乳腺癌微環(huán)境中巨噬細(xì)胞分化的影響，結(jié)果表明，與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)RAW264.7向M2型分化，但沉默lncRNA NEAT1表達(dá)能顯著抑制這一現(xiàn)象。同時(shí)，為進(jìn)一步探究沉默巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響，課題組在體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系中的巨噬細(xì)胞能顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力，并降低上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，而上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)，即促進(jìn)細(xì)胞的EMT能力。在裸鼠體內(nèi)同樣證實(shí)，將沉默lncRNA NEAT1表達(dá)的巨噬細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移可顯著緩解乳腺癌的增殖與侵襲能力。

綜上所述，本研究表明，lncRNA NEAT1參與調(diào)控乳腺癌微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的極化，而沉默其表達(dá)可通過(guò)抑制M2型細(xì)胞的極化，改善乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖與侵襲。然而，關(guān)于lncRNA NEAT1發(fā)揮上述作用具體調(diào)控機(jī)制與信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步闡釋，本課題組后期將從該方面著手進(jìn)行深入探究。