超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定豬肉中 9種β-受體激動劑的殘留量

楊鳳賢，楊焓妤

（文山州綠色食品發(fā)展中心，云南文山 663099）

β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，是具有苯乙醇胺結構的腎上腺素類的合成藥物[1]。它既不屬于獸藥，也不屬于添加劑，是腎上腺素類的神經(jīng)興奮劑，最初用來治療肺科疾病和臨床急救[2]，后來經(jīng)常被不法商人摻雜在飼料中喂養(yǎng)畜禽，促進畜禽的快速增長，同時增加畜禽瘦肉的含量。由于高用藥量導致高殘留，人體食用含有“瘦肉精”殘留的畜禽肉后會出現(xiàn)心情煩躁不安、頭痛、心悸，并伴有疼痛等代謝紊亂和障礙性中毒癥狀，可誘發(fā)和加重心腦血管病人的病情，嚴重時還會導致死亡[3-4]。因此，世界各國都先后將其列為畜禽產(chǎn)品中禁用藥物。

目前，國內(nèi)外關于β-受體激動劑殘留量檢測標準及文獻資料的報道較多，但大部分是用SPE方法凈化，該方法操作步驟繁多，需耗費大量的人力、物力和時間等，而畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全受到社會各界的高度重視，對畜禽產(chǎn)品中藥物殘留的監(jiān)測力度和頻度不斷加強，因此有必要建立高效、快速、簡便、靈敏的方法以應對大量的檢測工作。本文采用QuEChERS[5-7]凈化法對前處理條件進行優(yōu)化，通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，優(yōu)選出豬肉中9種β-受體激動劑前處理的最優(yōu)條件，為今后大批量β-受體激動劑殘留量檢測提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（HPLC，美國Fisher公司）；甲醇（HPLC，美國Fisher公司）；乙酸銨（HPLC，aladdin公司）；氯化鈉（AR，上海國藥集團）；乙酸（HPLC，美國Sigma公司）；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（CNW）；純凈水（大理娃哈哈公司）。

標準溶液：氯丙那林、西馬特羅、特布他林硫酸鹽、妥布特羅、沙丁胺醇、克倫特羅、噴布特羅鹽酸鹽、萊克多巴胺鹽酸鹽和非諾特羅氫溴酸鹽 （100 mg·L-1，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；內(nèi)標溶 液：氯丙那林-D7同位素、西馬特羅-D7同位素、妥布特羅-D9同位素、沙丁胺醇-D3同位素、克倫特羅-D9同位素、鹽酸萊克多巴胺-D3同位素（100 mg·L-1， 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX 3200QTRAP超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB 公司）；MS 3 Basic 旋渦混合器（艾卡儀器設備有限公司）；ST16R 離心機（美國thermofisher）；SHA-CA水浴恒溫振蕩器（谷寧儀器有限公司）；AutoEVA-20Plus全自動平行濃縮儀（?？萍瘓F股份有限公司）；SQP電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 混合標準儲備液、內(nèi)標儲備液的配制

分別準確吸取0.1 mL各標準溶液、內(nèi)標液置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容成濃度為1 mg·L-1的混合儲備液，使用前用甲醇將儲備液稀釋，配制成濃度為0.1 mg·L-1的混合標準液、混合內(nèi)標液。

1.3.2 樣品前處理

（1）酶解。在50 mL離心管中準確稱取豬肉樣品（2±0.01）g，分別加入0.2 mol·L-1乙酸銨溶液（pH值5.2）8.0 mL、β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 30 μL、0.1 mg·L-1混合內(nèi)標液20 μL，再加入0.1 mg·L-1的混合標液，渦旋混勻，在37 ℃下避光水浴振蕩（轉速140 r·min-1）16 h。

（2）提取。酶解后將樣品放置至室溫，加15 mL乙腈和NaCl（飽和），渦旋混勻5 min，用8000 r·min-1高速離心5 min，將上清液轉移至另一50 mL離心管內(nèi)，再加入乙腈15 mL并渦旋混勻5 min，8000 r·min-1離心5 min后，將上清液一并轉移至另一50 mL離心管內(nèi)，加入正己烷10 mL并渦旋1 min，8000 r·min-1離心5 min，棄去正己烷層（上層），將乙腈層（下層）濃縮至干，用1∶1甲醇水溶液（含0.1%甲酸） 1.0 mL定容，用10000 r·min-1離心10 min后，過 0.22 μm有機濾膜，待UPLC-MS/MS測定。

1.3.3 標準工作曲線的制備

分別準確吸取0.1 mg·L-1的混合標準液，用1∶1甲醇水溶液（含0.1%甲酸）配制成濃度為0.5 μg·L-1、 1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1標 準系列溶液和2.0 μg·L-1內(nèi)標溶液。

1.3.4 儀器工作條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Agilent C18（150 mm× 3.0 mm，3.5 μm）；流動相：有機相A為乙腈，水相B為含0.1%乙酸水溶液；梯度洗脫條件：0～3.00 min，4%A→30%A，3.00～5.30 min，30%A→96%A，5.30～7.02 min，96%A→4%A，7.02～10.00 min，4%A；流速：0.40 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

（2）質(zhì)譜條件。本試驗采用ESI源，多反應監(jiān)測正離子掃描模式。氣簾氣流速：25 L·h-1，霧化氣流速：50 L·h-1，輔助氣流速：60 L·h-1，輔助加熱氣溫度：650 ℃，噴霧電壓：5500 V。9種β-受體激動劑的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 9種β-受體激動劑的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 正交試驗設計

2 結果與分析

本文采用正交試驗，設計3因素3水平條件，分別用不同的因素和水平對樣品進行前處理，具體設計因素水平見表2，正交試驗設計見表3。

2.1 線性范圍、檢出限和定量限

表2 正交設計因素水平表

表3 正交設計實驗組合

用1∶1甲醇水溶液（含0.1%甲酸）配制不同濃度的9種β-受體激動劑標準溶液，通過峰面積對各獸藥的濃度進行線性回歸分析，并加入適當濃度的9種β-受體激動劑到豬肉空白基質(zhì)中，通過采用上述的前處理方法和儀器測定方法，用3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比（S/N）分別計算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。如表4所示，9種β-受體激動劑在0.50～20.00 μg·L-1線性關系良好，相關系數(shù)r≥0.9991，均可滿足豬肉中9種β-受體激動劑的測定需求。

2.2 回收率和精密度

在空白豬肉樣品中添加標準溶液進行回收率試驗，添加水平和提取條件見表2和3（每一加標水平和提取條件進行3次平行試驗），采用超高效液相色譜/質(zhì)譜檢測，內(nèi)標法和外標法定量，添加回收試驗結果見表5，精密度（相對標準偏差）見 表6。

表4 9種β-受體激動劑的線性回歸方程、相關系數(shù)、LOD和LOQ

表5 9種β-受體激動劑的添加回收試驗結果（n=3）

表6 9種β-受體激動劑的相對標準偏差（n=3）

結果表明，添加濃度為2.5 μg·kg-1、提取次數(shù)為1次、提取體積為10 mL時，即1號、2號、3號、5號、6號和8號這6組樣品中9種藥物的平均回收率為18%～150%，相對標準偏差為0.8%～31.0%；而4號、7號和9號這3組樣品中9種藥物的平均回收率為53%～130%，相對標準偏差為0.4%～26.0%。根據(jù)實驗室質(zhì)量控制規(guī)范[8]要求，添加濃度為1～10 μg·kg-1時，測定值與真值的回收率偏差在-30%～+10%，RSD≤30%，因此，1號、2號、3號、5號、6號和8號這6組樣品的檢測結果更偏離規(guī)范要求，提取條件不被考慮。從人力、物力和儀器負荷等方面考慮，4號即添加濃度為1.0 μg·kg-1，提取次數(shù)為2次，提取體積為20 mL為本試驗最優(yōu)條件。

3 結論

本文對豬肉中9種β-受體激動劑的提取條件進行了優(yōu)化，并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行同時檢測的方法。總體而言，克倫特羅、噴布特羅和非諾特羅3個化合物的回收率在所有提取條件下都在標準規(guī)定的范圍[6]；而氯丙那林、西馬特羅、特布他林、妥布特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺6個化合物的回收率在部分提取條件下滿足標準規(guī)定的范圍，部分提取條件下不滿足標準規(guī)定的范圍。9號即添加濃度水平5 μg·kg-1，提取次數(shù)為3次，每一次提取的體積為20 mL時，9種β-受體激動劑的回收率和精密度都滿足標準規(guī)定的范圍，但獸藥添加濃度高，提取次數(shù)多，不但增加了人力和物力等成本，還增加了獸藥對質(zhì)譜儀的污染，所以，在大批量檢測的情況下，不建議使用此條件。綜合考慮各方面的情況，本試驗最優(yōu)的條件是4號，即添加濃度水平為1 μg·kg-1，提取次數(shù)為2次，每一次提取的體積為20 mL。