矢車菊素-3-O-葡萄糖苷通過Nrf2/ARE 信號通路對蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠血腦屏障完整性影響研究

楊新宇，吳偉東，范 滌，陳立剛

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 沈陽 110016

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種嚴(yán)重的卒中亞型，30 d 病死率高達(dá)40%，其主要由動脈瘤破裂引起，并伴隨嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙［1］。手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步和診斷手段的提高使動脈瘤性SAH 的存活率增加17%，但出血帶來的損傷仍無較好方法減輕［2］。早期腦損傷（early brain injury，EBI）是SAH 后72 h 內(nèi)發(fā)生的一系列病理反應(yīng)，是主要的致殘、致死原因［3-4］。有研究顯示，血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）損傷在SAH 及隨后的EBI 中發(fā)揮重要作用［5］。BBB 主要由緊密連接蛋白組成，緊密連接蛋白的損傷在SAH 患者中較常見。有研究顯示，腦血流灌注改變、全身炎癥和氧化應(yīng)激共同導(dǎo)致BBB 的損傷，并進(jìn)一步造成腦組織的病理變化，如微循環(huán)障礙和神經(jīng)細(xì)胞凋亡［6］。而保護(hù)BBB在SAH 中具有潛在的治療意義。Cui 等［7］研究證實(shí)，Nrf2/ARE 信號通路可以通過增加緊密連接蛋白的表達(dá)，保護(hù)膿毒癥小鼠BBB 的完整性。矢車菊素又名花青素，是源于藍(lán)莓等植物中的天然抗氧化劑，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）具有強(qiáng)大的抗氧化、抗炎和抗腫瘤等生理功能［8］。有研究表明，C3G 可以激活Nrf2/ARE 信號通路［9］。因此，本研究旨在探討C3G 通過Nrf2/ARE 信號通路對SAH 后EBI 的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑 C3G（Solarbio，97%）、SDS聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒（碧云天，中國）、抗鼠Nrf2 單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國）、抗鼠HO-1 單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國）、抗兔NQO1 單克隆抗體（碧云天，中國）、抗兔ZO-1 單克隆抗體（碧云天，中國）、抗鼠Occludin單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國）、抗兔Claudin-5 單克隆抗體（Abcam，英國）、鼠抗β-Tubulin一抗（碧云天，中國）、山羊抗兔二抗（碧云天，中國），兔抗鼠二抗（碧云天，中國）。選取4～6 周成年雄性C57BL/6J 小鼠54 只，購自長生生物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2020-0001；體質(zhì)量22～30 g。將小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、C3G組，每組各18 只。

1.2 研究方法

1.2.1 動物模型建立 采用血管穿刺法制作SAH模型［10］。取頸正中開口，分離頸總血管，頸內(nèi)血管和頸外血管。在頸外剪口插入長1.500 cm，直徑0.625 mm尼龍線。打開頸內(nèi)，將尼龍線穿入頸內(nèi)并推動刺破頸內(nèi)動脈的分叉，當(dāng)感受到落空或小鼠呼吸節(jié)律改變時(shí)即表示造模成功。然后，取出尼龍線并結(jié)扎頸外血管，打開頸總血管并縫合切口。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 模型組小鼠采用血管穿刺法［10］制作SAH 模型，假手術(shù)組小鼠采用相同的操作方法處理但不刺破血管，C3G 組小鼠在SAH 模型建立30 min 后經(jīng)腹腔注射給予C3G 20 mg/kg［11］。24 h 后評估小鼠SAH 分級評分、加西亞評分。全部脫頸處死后，取出血側(cè)腦組織，每組隨機(jī)取6 只，檢測小鼠腦水含量。再每組隨機(jī)取6 只，檢測小鼠依文思藍(lán)滲出量。余下小鼠利用蛋白免疫印跡法檢測Nrf2，HO-1，NQO1，ZO-1，Occludin 及Claudin-5 的含量。

1.2.3 SAH 分級評分 SAH 分級評分根據(jù)Sugawara評分標(biāo)準(zhǔn)［12］對SAH 后小鼠的基底池血凝塊進(jìn)行0～3 級評分。SAH 出血分級的最終評分為6 個部位之和，0～7 為輕度出血，8～12 為中度出血，13～18 為重度出血。排除評分＜8 分的，將中度出血和重度出血納入選定模型。

1.2.4 加西亞評分 每組取6 只C57BL/6J 小鼠，根據(jù)參考文獻(xiàn)［12］中描述的方法進(jìn)行評估。見表1。

表1 加西亞評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 干濕法檢測腦水含量 建模后24 h，小鼠采用脊椎脫臼法處死，取腦組織于110℃下烘烤72 h。腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%

1.2.6 依文思藍(lán)滲出量 每組取6只C57BL/6J 小鼠，于取材前1 h，經(jīng)尾靜脈給予2% 伊文思藍(lán)溶液5 ml/kg，全身循環(huán)1 h 后，進(jìn)行生理鹽水灌注，然后迅速取出出血側(cè)腦組織，立即稱重。按10 ml/g 將組織浸潤到甲酰胺溶液中，60℃恒溫孵育24 h，待伊文思藍(lán)浸出，收集浸出液，于酶標(biāo)儀620 nm 處測定其吸光度。

1.2.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 將C57BL/6J 小鼠脫頸處死后立即取出出血側(cè)，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，在冰上進(jìn)行充分研磨，取上清液。部分上清液使用BCA 檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測，其余上清液加入loading buffer 溶液后煮沸，分裝保存于-80℃。本研究根據(jù)蛋白分子量大小選取12% 濃度分離膠，5% 濃度濃縮膠。隨后進(jìn)行電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。使用5%的BSA 在恒溫37℃搖床下充分封閉1 h，然后在4℃下孵育一抗過夜。次日用TBST 溶液洗條帶3 次，每次10 min，在恒溫37℃搖床下孵育二抗1.5 h，TBST溶液洗條帶3 次，每次10 min。最后使用BeyoECL發(fā)光溶液，在自動曝光機(jī)下曝光。β-actin 作為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)水平，使用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組小鼠SAH 分級評分、加西亞評分比較 建模后24 h，與假手術(shù)組相比，模型組、C3G 組SAH 分級評分均顯著增加，但與模型組比較，C3G 組SAH分級評分顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3組小鼠SAH分級評分、加西亞評分比較（a.SAH分級評分；b.加西亞評分）

2.2 3 組小鼠腦組織水含量和腦血管通透性比較 建模后24 h，與假手術(shù)組比較，模型組、C3G 組腦含水量和伊文斯藍(lán)滲出量均顯著增加，但與模型組比較，C3G 組腦含水量和伊文斯藍(lán)滲出量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組小鼠SAH后的腦組織水含量和腦血管通透性比較（a.腦水含量；b.依文思藍(lán)含量）

2.3 3 組小鼠Nrf2/ARE 信號通路蛋白表達(dá)的比較 建模后24 h，與假手術(shù)組比較，模型組、C3G 組腦組織中Nrf2/ARE 信號通路中的分子Nrf2、HO-1及NQO1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，但與模型組比較，C3G 組Nrf2、HO-1 及NQO1 蛋白表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 3組小鼠Nrf2/ARE信號通路蛋白表達(dá)的比較

2.4 3 組小鼠腦組織粘附連接蛋白表達(dá)的比較 建模后24 h，與假手術(shù)組比較，模型組、C3G 組腦組織中ZO-1、Claudin-5、Occludin 蛋白表達(dá)水平均顯著降低但與模型組比較，C3G 給藥后能夠顯著恢復(fù)這種變化，增加 ZO-1、Claudin-5、Occludin 蛋白的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 3組小鼠腦組織粘附連接蛋白表達(dá)的比較

3 討論

SAH 是較嚴(yán)重的卒中亞型之一，占所有卒中的5%［2，13］。盡管SAH 不如缺血性卒中和腦出血常見，但由于患者通常年齡較小，發(fā)病率和病死率高，預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［1，4］。在SAH 后的72 h內(nèi)，顱內(nèi)發(fā)生了一系列病理變化，BBB 破壞，顱內(nèi)壓升高，腦血流減少以及一些促進(jìn)血管收縮、氧化應(yīng)預(yù)后不良的關(guān)鍵機(jī)制之一，在EBI 過程中，BBB 通透性顯著增加，BBB 完整性的結(jié)構(gòu)和功能損害都會導(dǎo)致血管生成因子的變化［15-16］。Claudin-5 的顯著下降和白蛋白的升高是檢測BBB 破壞的標(biāo)志因子［17］。有研究證明，Nrf2 作為一種抗氧化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可能作為上游靶標(biāo)來保護(hù)免受BBB 損傷。Nrf2 激活劑也被證明是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效方法［18］。C3G 是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，其可以穿過BBB 并定位于廣泛的大腦區(qū)域，包括皮質(zhì)、小腦、海馬體和紋狀體等，從而發(fā)揮作用［19］。Cui 等［20］研究證明，C3G 可減少缺血性卒中患者M(jìn)CAO/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷、神經(jīng)元凋亡和腦梗塞體積的增加。C3G的神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制之一是抑制神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血/再灌注損傷［21］。

在本研究發(fā)現(xiàn)，C3G 可以降低小鼠SAH 分級評分，改善小鼠SAH 后的神經(jīng)功能，并能夠減輕腦水腫，保護(hù)BBB 的完整性。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，C3G可上調(diào)Nrf2 的表達(dá)，增加OH-1，NQO1 等抗氧化因子的表達(dá)水平，抑制氧化應(yīng)激作用，從而增加小鼠SAH 誘導(dǎo)的ZO-1，Claudin-5，Occludin 等緊密連接蛋白的表達(dá)。緊密連接是構(gòu)成BBB 的基礎(chǔ)，其通過控制BBB 相鄰腦內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞旁空間運(yùn)輸，增加其表達(dá)，從而保護(hù)BBB，嚴(yán)格調(diào)節(jié)血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的離子和分子交換［22］。本研究結(jié)果提示，C3G 在SAH 后可以通過激活Nrf2/ARE 信號通路中抗氧化相關(guān)因子的產(chǎn)生，保護(hù)BBB 完整性，從而減輕EBI。

綜上所述，C3G 能夠作用于Nrf2/ARE 信號通路，保護(hù)SAH 后血腦屏障的完整性，在SAH 的治療中具有良好的應(yīng)用前景。