免疫組化檢測(cè)與RNA 原位雜交檢測(cè)三陰性乳腺癌組織程序死亡受體1 一致性研究

郭一君，劉 丹，何 淼，呂晨光

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤［1-2］。三陰性乳腺癌（triple negative breast carcinoma，TNBC）患者的雌激素受體、孕激素及人表皮生長(zhǎng)因子受體2 均呈現(xiàn)出陰性［3］。TNBC患者約占乳腺癌患者的15%，預(yù)后較其他類型乳腺癌患者預(yù)后差［4］。程序死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）是診斷和治療TNBC 新的突破口［5］。PD-1 為細(xì)胞表面膜的膜蛋白之一，是T 細(xì)胞與B 細(xì)胞表面的抑制性信號(hào)受體，與T 細(xì)胞表面程序性死亡-受體1（programmed death-gland1，PD-L1）相結(jié)合，具有抑制T 淋巴細(xì)胞免疫功能的作用，使腫瘤無法被免疫監(jiān)視［6］。本研究采用免疫組化檢測(cè)（immuno-histochemistry，IHC）與RNA 原位雜交（RNA in situ hybridization，RNAscope）檢測(cè)PD-1 水平，分析并判斷兩種方法的一致性與優(yōu)劣?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2019 年3 月到2021 年4 月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的62 例TNBC 患者為研究對(duì)象。患者年齡40～70 歲；根據(jù)乳腺癌組織學(xué)分級(jí)分為Ⅲ級(jí)20 例，Ⅱ級(jí)11 例；伴大汗腺分化癌5 例，伴髓樣癌4 例，浸潤(rùn)性小葉癌5 例，腺樣囊性癌4 例，化生性癌5 例，腺泡細(xì)胞癌7 例，低級(jí)別腺鱗癌1 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：檢查前均為接受乳腺癌手術(shù)治療；病理學(xué)檢查為原發(fā)性乳腺癌；符合《乳腺癌雌、孕激素受體免疫組化學(xué)檢測(cè)指南》［7］及《乳腺癌外科學(xué)》［8］相關(guān)的TNBC 診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有心、肝、腎等臟器腫瘤；合并凝血功能障礙；患有精神類疾病且交流溝通障礙。

1.2 研究方法 分別運(yùn)用IHC 和RNAscope 檢測(cè)PD-1 狀態(tài)。石蠟組織進(jìn)行切片為5 μm，使用二甲苯脫蠟15 min，使用100%、95%、85%、75%乙醇的梯度酒精脫二甲苯6 min，使用流動(dòng)自來水反復(fù)沖洗，進(jìn)行微波抗原修復(fù)，加入過氧化氫阻斷液，降低內(nèi)源性過氧化物酶。加入PD-1（鼠抗人，克隆號(hào)UMAB187）抗體，用3，3-二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色。將切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固。RNA 原位雜交檢測(cè)探針來自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司，熒光標(biāo)記PD-1mRNA。比較RNAscope 與IHC 結(jié)果。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中有棕色標(biāo)點(diǎn)判讀RNA 原位雜交結(jié)果：1～10 個(gè)點(diǎn)為1 分，10～15 個(gè)點(diǎn)記為2 分，15～20 個(gè)點(diǎn)記為3 分，棕色標(biāo)點(diǎn)＞20 個(gè)點(diǎn)記為4 分，分?jǐn)?shù)≥1 分為抗體表達(dá)陽(yáng)性。IHC 檢測(cè)結(jié)果判讀：細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色黃色反應(yīng)≥5%為陽(yáng)性，出現(xiàn)棕色黃色反應(yīng)＜5%為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)、Kappa檢驗(yàn)。Kappa ＞0.75 為一致性好，0.4 ≤Kappa ＜0.75 為一致性一般，Kappa ＜0.40 為一致性差。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者IHC、RNAscope 檢測(cè)結(jié)果 IHC 檢測(cè)方法定位于細(xì)胞膜，檢測(cè)陽(yáng)性患者占83.9%（52/62），陰性患者占16.1%（10/62）。RNAscope 定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，檢測(cè)陽(yáng)性率為91.9%（57/62），陰性率為8.1%（5/62）。

2.2 IHC 與RNAscope 檢測(cè)一致性 RNAscope檢測(cè)與IHC檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性Kappa=0.758（P ＜0.05）。IHC 與RNAscope 檢測(cè)一致性較強(qiáng)。

3 討論

TNBC 病死率高、且容易復(fù)發(fā)，約占我國(guó)乳腺癌患者的15%，主要為絕經(jīng)前女性［9］。TNBC 常見于年輕女性，40 歲以下女性患有TNBC 的風(fēng)險(xiǎn)是50 歲以上女性的2 倍，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，每年約有26 萬(wàn)女性被診斷為乳腺癌，其中15%～20%患有TNBC，且發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)［10］。

TNBC 多呈單發(fā)小腫塊，晚期可出現(xiàn)“酒窩征”、“橘皮樣變”、皮膚潰瘍、淋巴結(jié)腫大。部分患者可見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，侵犯肺、肝、腦等臟器。乳腺癌的影像學(xué)表現(xiàn)與病理學(xué)預(yù)后指標(biāo)之間存在一定關(guān)聯(lián)，TNBC 為高侵襲性的腫瘤，超聲檢查能有效觀測(cè)內(nèi)部回聲與血流情況。對(duì)于TNBC 患者的診斷，應(yīng)綜合分析臨床病理及影響學(xué)特征，結(jié)合不同患者的自身情況制定個(gè)體化診療方案，降低臨床診斷的假陽(yáng)性或假陰性率，切實(shí)提高TNBC 患者診斷準(zhǔn)確率。

有研究表明，PD-1 是細(xì)胞表面膜蛋白，能與腫瘤細(xì)胞配體PD-L1 結(jié)合，降低T 細(xì)胞的分化、增殖，但調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞活性得到激活，機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效益被削弱［11］。這為臨床工作者提供治療思路：可通過抑制腫瘤表面的PD-1，減少對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。靶向PD-1 治療也是TNBC治療的重要方法。目前檢查PD-1 的方法有多種，本研究選擇RNAscope 檢測(cè)與IHC。IHC 診斷效果顯著，但在腫瘤分辨中有一定的局限性，依賴于抗體［12］。RNAscope 技術(shù)是一種新型RNA 原位雜交技術(shù)，在6～8 h 即可完成，可進(jìn)行單染色和多重染色、操作流程簡(jiǎn)單，能有效了解腫瘤異質(zhì)性，分析基因的表達(dá)情況。RNAscope 在臨床檢驗(yàn)診斷上具有高度敏感性，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理對(duì)特定基因的mRNA 水平進(jìn)行檢測(cè)［13］。HC 檢測(cè)方法定位于細(xì)胞膜，檢測(cè)陽(yáng)性患者占83.9%（52/62），陰性患者占16.1%（10/62）。RNAscope 定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，檢測(cè)陽(yáng)性率為91.9%（57/62），陰性率為8.1%（5/62）。RNAscope 檢測(cè)與IHC檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性Kappa=0.758（P＜0.05），IHC 與RNAscope檢測(cè)一致性較強(qiáng)。臨床工作者診斷 TNBC 時(shí)可使用IHC 與RNAscope 聯(lián)合檢測(cè)PD-1。

綜上所述，IHC 與RNAscope 檢測(cè)TNBC 效果較好，且IHC 和RNAscope 檢測(cè)PD-1 一致性較強(qiáng)。