外周血胃蛋白酶原、Toll 樣受體4 對(duì)喉癌診斷價(jià)值及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性

張 義，王志平，崔子峰，許堯生

衡水市人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，河北 衡水 053099

喉癌是我國(guó)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的6%［1］。喉癌起病隱匿，早期無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，部分患者確診時(shí)，病情較為嚴(yán)重，多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良［2］。因此，尋求合適的指標(biāo)用于喉癌的早期診斷及病情評(píng)估，對(duì)改善預(yù)后具有重要的臨床意義。胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）是胃蛋白酶的前體，可分為PG Ⅰ、PG Ⅱ兩個(gè)亞群，是臨床判斷胃黏膜損傷的常用指標(biāo)。有研究報(bào)道，PG 在酸性環(huán)境下裂解生成的胃蛋白酶能反流至咽喉部，對(duì)喉黏膜上皮產(chǎn)生慢性炎性刺激，進(jìn)而誘發(fā)癌變［3］。Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）是跨膜識(shí)別受體的一員，能參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞代謝等過(guò)程［4］。既往研究報(bào)道，TLR4 在結(jié)直腸癌的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［5］。目前，關(guān)于PG、TLR4 與喉癌的相關(guān)研究較少。因此，本研究旨在探討外周血PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 對(duì)喉癌的診斷價(jià)值及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2019 年4 月至2022 年4 月衡水市人民醫(yī)院收治并確診的102 例喉癌患者為喉癌組，另選取同期收治的130 例喉部良性病變患者為良性組。根據(jù)患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將喉癌組患者分為未轉(zhuǎn)移組（n=67）與轉(zhuǎn)移組（n=35）。納入標(biāo)準(zhǔn)：喉癌組患者符合喉癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，且經(jīng)病理檢查確診；良性組患者均診斷為良性聲帶息肉；納入患者的臨床資料完整；患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前接受過(guò)抗腫瘤相關(guān)治療；心、肺、腦等功能異常者；既往有精神疾病或認(rèn)知障礙病史；血液系統(tǒng)及自身免疫系統(tǒng)異常者；合并其他惡性腫瘤者。喉癌組患者男性59 例，女性43 例；年齡范圍45～80 歲，年齡（56.15±5.23）歲。良性組患者男性76 例，女性54 例；年齡范圍45～80 歲，年齡（55.94±5.25）歲。良性組與喉癌組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員審批通過(guò)。

1.2 研究方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清PG Ⅰ、PG Ⅱ水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)TLR4 mRNA 表達(dá)，并比較良性組與喉癌組PG Ⅰ、PG Ⅱ及TLR4。評(píng)估PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 對(duì)喉癌的診斷價(jià)值及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。收集喉癌患者基線資料，包括性別、年齡、是否吸煙、是否飲酒、腫瘤分型（聲門(mén)上型、聲門(mén)型、聲門(mén)下型）、喉癌TNM 分期［7］（Ⅰ～ Ⅱ期、Ⅲ～ Ⅳ期）、分化程度（低分化、中/ 高分化）等。分析喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)及配對(duì)t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（百分率）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 對(duì) 喉癌的診斷價(jià)值；采用Spearman 相關(guān)分析對(duì)PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進(jìn)行分析；采用單因素及多因素Logistic 回歸分析對(duì)喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良性組與喉癌組PG Ⅰ、PG Ⅱ及TLR4 比較 喉癌組PG Ⅰ水平低于良性組，PG Ⅱ、TLR4 水平高于良性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 良性組與喉癌組PG Ⅰ、PG Ⅱ及TLR4 比較（）

表1 良性組與喉癌組PG Ⅰ、PG Ⅱ及TLR4 比較（）

2.2 PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 對(duì)喉癌診斷價(jià)值分析 PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 診斷喉癌的ROC 曲線下面積分別為0.845、0.779、0.874，特異度分別為78.08%、75.00%、70.77%，敏感度分別為73.53%、66.67%、87.25%。見(jiàn)表2、圖1。

表2 PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 對(duì)喉癌診斷價(jià)值

圖1 評(píng)估PGⅠ、PGⅡ、TLR4對(duì)喉癌診斷價(jià)值的ROC曲線

2.3 未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組患者PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 比較 轉(zhuǎn)移組PG Ⅰ低于未轉(zhuǎn)移組，PG Ⅱ、TLR4 高于未轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組患者PGⅠ、PGⅡ、TLR4比較（）

表3 未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組患者PGⅠ、PGⅡ、TLR4比較（）

2.4 PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，PG Ⅰ與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（r=-0.401，P＜0.001），PG Ⅱ、TLR4 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.347、0.534，P＜0.001）。

2.5 喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素分析 喉癌患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為因變量（否=0，是=1），自變量賦值見(jiàn)表4。將單因素Logistic 分析有意義的指標(biāo)進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，低分化、PG Ⅰ低表達(dá)、PG Ⅱ高表達(dá)、TLR4高表達(dá)是喉癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（P ＜0.05）。見(jiàn)表5～6。

表4 自變量賦值

表5 喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素單因素分析

3 討論

喉癌的發(fā)病率僅次于鼻咽癌，位居頭頸部惡性腫瘤的第二位［8］。喉癌的致病機(jī)制尚不明確，多認(rèn)為與吸煙、環(huán)境、病毒感染等有關(guān)，咽喉反流、胃食管反流也可能是誘發(fā)喉癌的重要原因［9］。近年來(lái)，早期喉癌的診斷率明顯提高，但仍有部分患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)治療的最佳時(shí)機(jī)［10］。目前，臨床主要通過(guò)影像學(xué)檢查來(lái)評(píng)估患者病情，其特異度和靈敏度較低，存在局限性。因此，需要尋找合適的生物學(xué)指標(biāo)用于喉癌的早期診斷以滿足臨床需求。

表6 喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素多因素分析

PG Ⅰ主要由主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌，PG Ⅱ由胃腺細(xì)胞分泌，是臨床篩查慢性胃炎、胃癌的常用指標(biāo)［11］。正常情況下，PG Ⅰ、PG Ⅱ水平保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)胃黏膜受損促使主細(xì)胞被幽門(mén)腺取代時(shí)，PG Ⅰ水平降低，PG Ⅱ水平升高［12］。本研究結(jié)果顯示，喉癌組PG Ⅰ水平低于良性組，PG Ⅱ水平高于良性組，提示PG Ⅰ、PG Ⅱ異常表達(dá)與喉癌的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移組PG Ⅰ水平低于未轉(zhuǎn)移組，PG Ⅱ水平高于未轉(zhuǎn)移組，且PG Ⅰ與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，PG Ⅱ與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示PG Ⅰ、PG Ⅱ異常表達(dá)與喉癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。PG 在酸性條件下可采用自我催化的方式發(fā)生裂解，產(chǎn)生胃蛋白酶，而胃蛋白酶可隨胃內(nèi)容物反流至咽喉部，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，進(jìn)入喉部黏膜上皮組織并造成慢性損傷，導(dǎo)致喉部黏膜上皮過(guò)度增生，誘發(fā)喉癌［13-14］。有研究報(bào)道，被內(nèi)吞的胃蛋白酶能夠激活核因子κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路，刺激血管生成因子合成，加快腫瘤血管生成，促使腫瘤進(jìn)展［15］。因此，可推測(cè)PG 能參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，PG Ⅰ、PG Ⅱ預(yù)測(cè)喉癌的ROC曲線下面積分別為0.845、0.779，提示PG Ⅰ、PG Ⅱ表達(dá)水平可作為早期診斷喉癌的指標(biāo)；PG Ⅰ低表達(dá)、PG Ⅱ高表達(dá)是喉癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明PG Ⅰ、PG Ⅱ異常表達(dá)會(huì)增加淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

TLR4 主要表達(dá)于免疫細(xì)胞中，通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞的增殖與分化、代謝及免疫逃逸等過(guò)程，增加惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［16］。洪淑貞等［17］研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 在宮頸癌患者中呈高表達(dá)，且與臨床分期、病理分級(jí)呈正相關(guān)。吳葉丹［18］研究指出，TLR4 能參與組蛋白甲基化過(guò)程，調(diào)控癌細(xì)胞Foxp3 轉(zhuǎn)錄，在肺癌細(xì)胞的免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，喉癌組TLR4 水平高于良性組；轉(zhuǎn)移組TLR4 水平高于未轉(zhuǎn)移組，且TLR4 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這提示TLR4 在喉癌患者中呈高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。TLR4 表達(dá)異?？勺R(shí)別病原相關(guān)分子，通過(guò)調(diào)控NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路激活免疫防御系統(tǒng)，促使炎性因子、趨化因子水平升高，加快惡性腫瘤的病情發(fā)展［19］。同時(shí)，TLR4 可激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號(hào)通路，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，加快癌組織新生血管形成，進(jìn)而促使疾病進(jìn)展，增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［20］。本研究結(jié)果顯示，TLR4 預(yù)測(cè)喉癌的ROC 曲線下面積為0.874，且TLR4 高表達(dá)是喉癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。這提示TLR4 在篩查喉癌中具有一定的臨床價(jià)值，且TLR4高表達(dá)是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高危因素。

綜上所述，PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4 能作為預(yù)測(cè)喉癌的生物學(xué)指標(biāo)，且PG Ⅰ低表達(dá)、PG Ⅱ和TLR4 高表達(dá)是喉癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。但本研究為單中心研究，結(jié)果存在一定選擇偏移，且未對(duì)喉癌預(yù)后進(jìn)行隨訪，后續(xù)需開(kāi)展大樣本多中心研究，進(jìn)一步探討PG Ⅰ、PG Ⅱ、TLR4與喉癌患者預(yù)后的關(guān)系。