麝香多肽分離純化及其抗炎作用機(jī)制研究

弋 靜，尹竹君，全云云，陳世龍，郎吉瑞，黎 勇，趙軍寧，李 莉*

1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，瀘州 646000；2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610000；3四川逢春制藥有限公司，德陽 618000

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一種嚴(yán)重、復(fù)雜的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床主要表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、低血壓和肺泡水腫，最終導(dǎo)致急性低氧性呼吸衰竭[1]。ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)失調(diào)、肺內(nèi)皮細(xì)胞和肺上皮通透性增加導(dǎo)致肺微血管屏障破壞是ALI/ARDS病理生理紊亂的核心[2]。Wu等[3]報(bào)道巨噬細(xì)胞焦亡參與了脂多糖誘導(dǎo)的ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制，且Caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-CMK可以減輕肺組織損傷，減少促炎因子產(chǎn)生。

麝香(Moschus)是鹿科動物林麝MoschusberezovskiiFlerov、馬麝MoschussifanicusPrzewalski 或原麝MoschusmoschiferusLinnaeus成熟雄體香囊中的干燥分泌物[4]。麝香，性溫，味辛，歸心脾經(jīng)，具有開竅醒神，活血通絡(luò)，消腫止痛的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，麝香化學(xué)成分及其復(fù)雜，具有抗炎、抗癡呆、抗腫瘤、抗腦缺血、免疫調(diào)節(jié)和激素調(diào)節(jié)的藥理作用[5-7]。Zhu等[8]在小鼠巴豆油耳部炎癥、大鼠酵母性和瓊脂性關(guān)節(jié)炎、大鼠燙傷性炎癥等多種體內(nèi)炎癥模型中均證實(shí)麝香多肽具有很強(qiáng)的抗炎活性，但抗炎作用機(jī)制尚不明確。本課題從天然麝香中提取、純化麝香多肽，在脂多糖誘導(dǎo)的THP-1體外細(xì)胞模型和急性肺損傷小鼠模型中研究麝香多肽的抗炎活性并探討其潛在的分子作用機(jī)制，以期為名貴中藥材麝香的進(jìn)一步研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

THP-1細(xì)胞系自中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級Balb/c雄性小鼠36只，6～8周齡，20～25 g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司成都分公司(許可證號：SYXK(川)2018-100)。實(shí)驗(yàn)動物倫理通過四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(授權(quán)編號：R20210302-1)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

天然麝香(林麝香囊的干燥分泌物)，四川逢春制藥有限公司麝養(yǎng)殖基地提供，符合2020年版《中國藥典》麝香的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。地塞米松磷酸鈉注射液(dexamethasone，Dex),購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H41020036。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

離子色譜柱(2020110501)、Claricep Flash手?jǐn)Q純化柱(2020110501)購自博納艾杰爾;離子交換樹脂(2020121101)、Q Bestarose FF(2020121101)購自博格隆;脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，L4005-100MG)購自Sigma;再生纖維素透析袋(1 kDa，S08D7G264)購自源葉生物;Mouse TNF-α(EM008-96)、Mouse IL-6(EM004-96)ELISA試劑盒購自依科賽;NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)抗體(Bs-10021R)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)抗體(Bs-6741R)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)抗體(Bs-10743R)、IL-18抗體(Bs-0529R)購自Bioss；Anti-Gasdermin D(Ab219800)、Anti-IL-1β(Ab283818)購自Abcam;多聚甲醛(20190408)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HE染液套裝(G1005)購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器

制備型離子色譜儀(Newstyle，漢邦科技)；功能酶標(biāo)儀(SUNRISE RC/STEEVOLYZER，Tecan)；超級混勻儀(BE-3100，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；全自動洗板機(jī)(APW-200，杭州奧盛儀器有限公司)；脫水機(jī)(JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司)；包埋機(jī)(JB-P5，武漢俊杰電子有限公司)；冷凍臺(JB-L5，武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(jī)(RM2016，徠卡)；組織攤片機(jī)(KD-P，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100，尼康)；成像系統(tǒng)(NIKON DS-U3，尼康)。

1.6 麝香多肽提取、純化

在麝香粗品中分批次加入Tris-HCl緩沖液(pH 8.0，0.025 mol/L)，最終的料液比為1∶100(麝香質(zhì)量與溶劑體積之比，W/V)，研磨1 h后，混合液在冰水浴超聲提取(超3 s停7 s，循環(huán)30次，10% P)。超聲結(jié)束后，混合液離心(12 000 r/min，5 min)取上清保存，沉淀繼續(xù)加入Tris-HCl(W/V=1∶100)混合，超聲破碎提取。離子交換層析柱對上清液純化，以20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L NaCl溶液為流動相A相，20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，500 mmol/L NaCl溶液為流動相B相。依次用5% B緩沖液沖洗，10%B緩沖液洗脫P(yáng)1流分，35% B洗脫P(yáng)2流分，45% B洗脫P(yáng)3流分，100% B洗脫P(yáng)4流分，1 mol/L NaCl洗脫P(yáng)5流分，按220 nm波長出峰收集各流分。麝香多肽各流分經(jīng)脫鹽、冷凍干燥后得到固體粉末。

1.7 麝香多肽定性鑒定

點(diǎn)樣毛細(xì)管(0.3 mm×100 mm)吸取2 μL麝香多肽樣品分別點(diǎn)樣至硅膠G板，硅膠板置于濃鹽酸氛圍酸解(110 ℃，100 min)；取出硅膠G板，置于展開缸，展層液系統(tǒng)采用正丁醇-冰乙酸-水(4∶1∶5，V/V/V，上層)；樣品展開后吹干硅膠板溶劑，噴顯色劑(2%茚三酮乙醇溶液)，110 ℃加熱25 min，顯色。

1.8 麝香多肽抗炎活性篩選

1.8.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型復(fù)制

THP-1細(xì)胞生長于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取生長狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞接種于適合的培養(yǎng)板，100 ng/mL佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)作用24 h誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，更換無PMA的完全培養(yǎng)基靜息培養(yǎng)24 h，最后用1 μg/mL LPS作用24 h誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

1.8.2 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)

取生長狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞以5×104個/孔接種96孔板，THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞；細(xì)胞分為空白組、SXP1組、SXP2組、SXP3組、SXP4組、SXP5組，另設(shè)置一個背景對照組(無細(xì)胞)，背景對照組、空白組加入完全培養(yǎng)基，其余組分別加入SXP1～SXP5(1、10、100、1 000 μg/mL)；SXP1～SXP5孵育24 h后，棄舊培養(yǎng)基，加入CCK8工作液；繼續(xù)孵育30～60 min后，酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測OD值。

1.8.3 細(xì)胞因子檢測實(shí)驗(yàn)

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以5×105個/孔接種于24孔板，THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞；細(xì)胞分為對照組(control，Con)、模型組(model，Mod)、SXP1組(100 μg/mL)、SXP2組(100 μg/mL)、SXP3組(100 μg/mL)、SXP4組(100 μg/mL)、SXP5組(100 μg/mL)及地塞米松組(Dex，1 μg/mL)。藥物預(yù)處理2 h后，給藥組加入終濃度為1 μg/mL LPS刺激24 h；收集細(xì)胞上清液，分裝，-80 ℃冰箱保存；酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量。

1.9 SXP4含量及分子量測定

經(jīng)“1.8.3”中THP-1體外炎癥模型篩選出SXP4有明顯的抗炎活性。隨后，采用BCA法測量SXP4中多肽的含量。稱取5 mg SXP4，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)為溶劑，配成5 mg/mL的SXP4母液。以BCA試劑盒檢測SXP4中多肽含量，具體操作步驟按照BCA試劑盒說明書進(jìn)行。

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測SXP4分子量的分布范圍?？傮w實(shí)驗(yàn)過程分為制膠、制樣、上樣、電泳、染色、脫色和顯影。各步驟參數(shù)分別為配膠(12%分離膠和4%濃縮膠)、制樣(SXP4與loading buffer體積比4∶1混合后煮沸8 min)、上樣(marker上樣6 μL，SXP4上樣20 μL)、電泳(30 V電泳30 min、100 V電泳20 min、150 V電泳60 min)、染色(固定液振蕩固定1 h，考馬斯亮藍(lán)染液振蕩染色1 h)、脫色(高火加熱1 min，脫色液脫色30 min，重復(fù)脫色2次)、顯影(凝膠成像系統(tǒng)拍照)。

1.10 動物實(shí)驗(yàn)

1.10.1 動物分組和給藥

取Balb/c雄性小鼠36只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，小鼠隨機(jī)分為對照組(control，Con)、模型組(model，Mod)、SXP4低劑量組(SXP4 low dose，SXP4-L；5 mg/kg)、SXP4中劑量組(SXP4 medium dose，SXP4-M；15 mg/kg)、SXP4高劑量組(SXP4 high dose；SXP4-H，50 mg/kg)、地塞米松組(Dex，5 mg/kg)，每組6只。SXP4低中高劑量組和地塞米松組分別尾靜脈注射相應(yīng)劑量藥物(注射容積0.1 mL/10 g)，連續(xù)注射3天，每天1次(注射容積0.1 mL/10 g)，其余組注射等體積的生理鹽水。末次給藥1 h后，除空白組腹腔注射生理鹽水(0.1 mL/10 g)外，其余各組腹腔注射5 mg/kg LPS(注射容積0.1 mL/10 g)。

1.10.2 小鼠血清炎癥因子檢測

在LPS處理小鼠6 h后，戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，小鼠眼眶采血，分離血清-80 ℃保存待測。ELISA法檢測小鼠血清總TNF-α、IL-6的含量。

1.10.3 小鼠肺組織病理分析

取肺組織于4%多聚甲醛固定24 h以上。肺組織脫水、包埋制成石蠟切片，石蠟切片脫蠟、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，分別采集圖像。

1.10.4 免疫組織化學(xué)

石蠟切片脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶及封閉，肺組織用一抗4 ℃孵育過夜，回收一抗，二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水，封片。切片于100倍下觀察全部組織，分別采集圖像。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 麝香多肽定性鑒定

通過茚三酮顯色反應(yīng)對麝香提取物進(jìn)行多肽定性鑒定。麝香多肽定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。根據(jù)斑點(diǎn)顯示，SXP1～SXP4流分為多肽類物質(zhì)，SXP5流分可能不含多肽。

圖1 SXP1～SXP5茚三酮顯色Fig.1 The ninhydrin reaction of SXP1-SXP5

2.2 麝香多肽對THP-1巨噬細(xì)胞活力的影響

麝香多肽各流分在不同濃度下分別作用24 h后細(xì)胞相對活力如圖2所示。在1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，SXP1～SXP5對正常THP-1源巨噬細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性作用。

圖2 麝香多肽不同流分對THP-1源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響Fig.2 The effects of different components in polypeptide from Moschus on THP-1 macrophages viability( 注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

2.3 麝香多肽對LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中炎癥因子的影響

如圖3中所示，與空白組比較，模型組中細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)；與模型組比較，SXP4(100 μg/mL)明顯減少TNF-α和IL-1β產(chǎn)生，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)，SXP1、SXP2、SXP3、SXP5(100 μg/mL)對IL-1β產(chǎn)生無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SXP1(100 μg/mL)升高TNF-α含量，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)，SXP2、SXP3、SXP5對TNF-α含量無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 麝香多肽不同流分對LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞炎癥模型TNF-α和IL-1β分泌的影響Fig.3 The effect of different components of polypeptide from Moschus on the secretion of TNF-α and IL-1β in LPS-induced THP-1 macrophages( 注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，與地塞米松組比較，△△P<0.01。Note:Compared with Con,##P<0.01;Compared with Mod,*P<0.05,**P<0.01;Compared with Dex,△P<0.05,△△P<0.01.

2.4 SXP4中蛋白質(zhì)含量及多肽分子量

通過BCA法檢測SXP4凍干品中蛋白質(zhì)多肽的濃度為2.96 mg/mL。采用SDS-PAGE分析SXP4的分子量，結(jié)果如圖4所示。SXP4為一混合型多肽，分子量大多分布在10～26 kDa范圍內(nèi)。

圖4 SXP4的SDS-PAGE分析Fig.4 The SDS-PAGE analysis of SXP4

2.5 SXP4對小鼠血清中炎癥因子的影響

ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α和IL-6濃度，結(jié)果如圖5所示。與空白對照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明顯增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)；與模型組相比，SXP4(5、15、50 mg/kg)預(yù)防給藥的小鼠血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的含量明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

圖5 SXP4對急性肺損傷小鼠血清中炎癥因子的影響Fig.5 The effect of SXP4 on cytokines in serum of mice with acute lung injury注：與空白組比較，##P<0.01，與模型組比較；*P<0.05，**P<0.01；與地塞米松組比較，△P<0.05，△△P<0.01。Note:Compared with Con,##P<0.01;Compared with Mod,*P<0.05,**P<0.01;Compared with Dex,△P<0.05,△△P<0.01.

2.6 SXP4對小鼠肺組織中炎癥因子的影響

如圖6、7和表1所示，與空白對照組相比，模型組小鼠肺組織中IL-1β和IL-18的表達(dá)明顯增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，SXP4(5、15、50 mg/kg)預(yù)防給藥的小鼠肺組織中IL-1β和IL-18的表達(dá)明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)。

圖6 SXP4對急性肺損傷小鼠肺組織中IL-1β蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.6 The effect of SXP4 on the protein expression of IL-1β in lung of mice with acute lung injury (×400)

圖7 SXP4對急性肺損傷小鼠肺組織中IL-18蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.7 The effect of SXP4 on the protein expression of IL-18 in lung of mice with acute lung injury(×400)

表1 小鼠肺組織中IL-1β、IL-18陽性面積Table 1 The positive tissue of IL-1β and IL-18 in lung of mice with acute lung injury(

2.7 SXP4對小鼠肺組織病理損傷的影響

采用HE染色觀察肺組織病理變化，評估麝香多肽對脂多糖引起的肺組織損傷的影響。如圖8所示，與空白對照組相比，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞聚集、肺泡壁增厚，肺組織結(jié)構(gòu)的完整性被破壞；與模型組相比，麝香多肽預(yù)給藥后，小鼠肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤減少，肺泡壁增厚減少，肺組織病理損傷得到緩解。

圖8 SXP4對急性肺損傷小鼠肺組織病理損傷的影響(×200)Fig.8 The effect of SXP4 on pathological injury of pulmonary tissue in mice with acute lung injury (×200)

2.8 SXP4對小鼠肺組織中NLRP3/Caspase-1介導(dǎo)的焦亡通路相關(guān)蛋白的影響

采用免疫組化檢測小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白陽性表達(dá)，結(jié)果如圖9～12和表2所示。與空白對照組相比，模型組小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白的陽性表達(dá)明顯增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，SXP4(5、15、50 mg/kg)預(yù)防給藥的小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白的陽性表達(dá)明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01)。

表2 小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D陽性面積Table 2 The positive tissue of NLRP3,ASC,Caspase-1 and Gasdermin D in lung of mice with acute lung injury(

圖9 SXP4對急性肺損傷小鼠肺組織中NLRP3蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.9 The effect of SXP4 on the protein expression of NLRP3 in pulmonary tissue of mice with acute lung injury (×400)

圖10 SXP4對急性肺損傷小鼠肺組織中ASC蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.10 The effect of SXP4 on the protein expression of ASC in pulmonary tissue of mice with acute lung injury (×400)

圖11 SXP4對急性肺損傷小鼠肺組織中Caspase-1蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.11 The effect of SXP4 on the protein expression of Caspase-1 in pulmonary tissue of mice with acute lung injury (×400)

圖12 SXP4對急性肺損傷小鼠肺組織中Gasdermin D蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.12 The effect of SXP4 on the protein expression of Gasdermin D in pulmonary tissue of mice with acute lung injury (×400)

3 討論與結(jié)論

生物活性肽由于具有高選擇性，體內(nèi)代謝可預(yù)測性，低毒性和易合成等優(yōu)點(diǎn)，可作為多種疾病的潛在治療藥物，受到國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注[9]。據(jù)報(bào)道，麝香多肽是天然麝香中抗炎活性成分之一。日本學(xué)者木村正康等人首次從麝香分離出分子量約為1000的多肽，具有很強(qiáng)的抗炎活性，能顯著抑制豚鼠白細(xì)胞游走，其作用強(qiáng)度約為氫化可的松的40余倍[10]。Zhu等[8,10]在巴豆油致小鼠耳腫脹模型中證實(shí)，麝香-21的抗炎作用是氫化可的松的3倍，麝香-65的抗炎作用約為氫化可的松的6倍，麝香1號的抗炎強(qiáng)度是氫化可的松的36倍。Liu等[11]通過凝膠過濾法分離得到分子量在20萬左右的Mu-a-1，對巴豆油小鼠耳部炎癥具有明顯的抑制作用，炎癥抑制率為72.3%。THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)可分化成巨噬細(xì)胞，具有與人原代巨噬細(xì)胞相似的表型和功能[12,13]。THP-1細(xì)胞系已被廣泛用作人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的體外模型，用于炎癥性疾病的機(jī)制研究[14]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的活性成分，可以引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，常常被用作體內(nèi)、體外炎癥模型的誘導(dǎo)劑[15,16]。在本次研究中，作者采用離子交換色譜層析柱從天然麝香提取液中分離純化獲得了5個流分，即SXP1、SXP2、SXP3、SXP4、SXP5。在LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，SXP4能顯著抑制TNF-α、IL-1β產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的抗炎活性。此外，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)SXP4中多肽蛋白質(zhì)分子量主要分布于10～26 kDa。

急性肺損傷及發(fā)展更為嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征具有極高的死亡率，以感染、創(chuàng)傷、肺組織挫傷或胃內(nèi)容物誤吸等誘因引起的肺部炎癥為特征[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，SXP4可以明顯改善小鼠肺組織的病理損傷，減少脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠血清中TNF-α、IL-6和肺組織中IL-1β、IL-18的表達(dá)。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種程序性細(xì)胞死亡形式，依賴Caspase家族成員的酶活性，介導(dǎo)Gasdermin家族蛋白在細(xì)胞膜上形成跨膜孔，引起細(xì)胞腫脹破裂和IL-1β、IL-18、HMGB1等炎癥介質(zhì)釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[19]。研究表明，肺泡巨噬細(xì)胞焦亡在急性肺損傷中扮演著重要的作用[3,20,21]。因此，抑制細(xì)胞焦亡是急性肺損傷的潛在治療靶點(diǎn)。

細(xì)胞焦亡有兩條激活途徑，即Caspase-1依賴的經(jīng)典途徑和Caspase-4,-5/-11依賴的非經(jīng)典途徑，這兩條途徑都伴隨著Gasdermin D(GSDMD)裂解和IL-1β、IL-18釋放[22]。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡通路由“炎癥小體”介導(dǎo)。炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的大分子復(fù)合物，由傳感器NOD樣受體(NLRs)、銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和效應(yīng)器Caspase-1前體(Pro-Caspase-1)組成。其中NLRP3是NLRs家族中研究最為廣泛的成員。Grailer等[23]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體和Caspase-1在急性肺損傷發(fā)病機(jī)制中有至關(guān)重要的作用。在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠中，NLRP3-/-小鼠和Caspase-1-/-小鼠的肺組織損傷和炎癥反應(yīng)明顯減弱。活化的NLRP3募集ASC和Pro-Caspase-1組裝成NLRP3炎癥小體，將Pro-Caspase-1剪切為活性形式Caspase-1，Caspase-1切割GSDMD暴露出GSDMD的氨基酸端結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和裂解[24]。同時，Caspase-1也會對IL-1β、IL-18前體(Pro- IL-1β、Pro-IL-18)加工，通過細(xì)胞膜上的孔洞釋放出成熟的IL-1β、IL-18。本研究的免疫組化結(jié)果表明，SXP4可以明顯減少急性肺損傷小鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD的表達(dá)水平(見圖13)。

圖13 麝香多肽(SXP4)的抗炎作用分子機(jī)制Fig.13 The anti-inflammatory mechanisms of polypeptide from Moschus (SXP4)

綜上所述，麝香多肽SXP4可能通過抑制NLRP3/Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，減輕急性肺損傷小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)并緩解肺組織病理損傷。