月見草中一個(gè)新的莽草酸衍生物

劉娟娟，張靖柯，曾夢(mèng)楠，李 孟，朱登輝，魏俊俊，鄭曉珂，馮衛(wèi)生*

1河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一類破壞性、不可逆損傷的彌漫性肺間質(zhì)疾病[1]。其中嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒和新型冠狀病毒(COVID-19)感染以及多種炎癥性肺部疾病，均可引起肺纖維化[2]。治療上西醫(yī)多采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、細(xì)胞因子抑制劑等進(jìn)行治療，但不良反應(yīng)比較多[3]。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，以及中醫(yī)藥在抗擊新冠疫情方面發(fā)揮的核心作用[4]。越來越多的實(shí)驗(yàn)研究表明中藥及其提取物對(duì)肺纖維化有良好的治療作用[5]。查閱地方書籍發(fā)現(xiàn)月見草能夠治療肺部相關(guān)的疾病。比如《泉州本草》記載用月見草可以治療肺病、瘰疬等。

月見草OenotherabiennisL.為柳葉菜科(Onagraceae)月見草屬(OenotheraL.)多年生草本植物[6]，因在傍晚7～9時(shí)開花，故稱為月見草。它是一種集油用、觀賞、藥用于一身的多功能植物[7]，為民間常用的中草藥，全株皆可入藥，該植物主要分布在我國(guó)的東北南部及東部山區(qū)等地[8]。月見草種子油中富含γ-亞麻油酸等多種不飽和脂肪酸是人體不可缺少的必需脂肪酸，有很強(qiáng)的生物活性[9-12]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前有關(guān)月見草化學(xué)成分研究的報(bào)道比較少，且缺乏對(duì)月見草化學(xué)成分的系統(tǒng)研究。為了明確月見草的化學(xué)成分，為月見草的后續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，本文對(duì)月見草全草化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

賽譜銳思LC-52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思北京科技有限公司，SP-5030型半制備型高壓輸液泵，UV200型紫外檢測(cè)器，Easychrom型色譜工作站)；OSB-21000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；Bruker AVANCE III 500型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；Bruker maxis HD型飛行時(shí)間質(zhì)譜(德國(guó)Bruker公司)；Thermo Nicolet IS10 紅外光譜儀(Thermo Scientific，USA)；Thermo EVO300紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)；Rudolph AP-IV 型旋光儀(Rudolph，USA)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,USA)。

硅膠H(200～300目)(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech)；MCI GEL CHP-20(Mitusishi Chemical Corporation)；色譜柱COSMOSIL C18-MS-II，250 mm × 20 mm，5 μm)；薄層色譜硅膠G和GF254(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；色譜甲醇、分析甲醇、分析二氯甲醇、分析乙酸乙酯、分析石油醚、分析正丁醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，色譜乙腈(美國(guó)天地有限公司)。

月見草樣品于2019年8月采自于河南省伏牛山區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為柳葉菜科月見草屬植物月見草(OenotherabiennisL.)的干燥全草；留樣標(biāo)本(YJC-201908)存放于河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離

取干燥月見草全草(40 kg)，用50%含水丙酮組織破碎提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得到總浸膏(3.3 kg)?？偨嗉拥攘克稚ⅲ来斡檬兔?、二氯甲烷、乙酸乙酯以及水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，各部位經(jīng)減壓濃縮，回收溶劑，得到石油醚部位(5.0 g)、二氯甲烷部位(49.6 g)、乙酸乙酯部位(161.0 g)及正丁醇部位(457.0 g)。二氯甲烷部位進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(10∶0 → 0∶1)以及乙酸乙酯-甲醇(5∶1 → 0∶1)洗脫，洗脫組分經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同部分，得到10個(gè)組分，即Fr.1～Fr.10。其中Fr.8(2.47 g)洗脫組分進(jìn)行硅膠柱色譜分離以石油醚-丙酮(20∶1 → 0∶1)梯度洗脫，經(jīng)TLC檢識(shí)，合并相同組分，得到9個(gè)組分，即Fr.8-1～Fr.8-9。其中Fr.8-8(0.95 g)進(jìn)行硅膠柱色譜分離以石油醚-丙酮(15∶1 → 0∶1)梯度洗脫，經(jīng)TLC檢識(shí)，合并相同組分，得到7個(gè)組分，即Fr.8-8-1～Fr.8-8-7。其中Fr.8-8-6(0.53 g)加甲醇溶解，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷：甲醇(50∶1 → 10∶1)梯度洗脫，得到7個(gè)洗脫組分Fr.8-8-6-1～Fr.8-8-6-7。其中Fr.8-8-6-3(0.14 g)進(jìn)行制備薄層分離純化并結(jié)合使用半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物9(22.96 mg)。Fr.8-8-6-4(0.27 g)加甲醇溶解，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷∶甲醇(50∶1→10∶1)梯度洗脫，得到4個(gè)洗脫組分Fr.8-8-6-4-1～Fr.8-8-6-4-4。其中Fr.8-8-6-4-2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結(jié)合半制備高效液相(甲醇-水洗脫體系)，最終得到化合物3(3.68 mg)、4(1.98 mg)、5(2.55 mg)。Fr.8-8-6-6(0.09 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結(jié)合半制備高效液相(甲醇-水洗脫體系)，最終得到化合物6(1.32 mg)。

乙酸乙酯部位進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(100∶1 → 0∶1)梯度洗脫，洗脫組分經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同部分，得到5個(gè)組分，即Fr.11～Fr.15。其中Fr.13(10.3 g)進(jìn)行MCI gel CHP-20柱色譜分離，以甲醇-水(0∶100 → 100∶0)梯度洗脫，洗脫組分經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同部分，得到7個(gè)組分，即Fr.13-1～Fr.13-7。其中Fr.13-5(1.49 g)加甲醇溶解，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷∶甲醇(50∶1 → 10∶1)梯度洗脫，得到4個(gè)洗脫組分，即Fr.13-5-1～Fr.13-5-4。Fr.13-5-2(0.21 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結(jié)合半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物8(2.70 mg)、10(4.33 mg)。Fr.13-5-3(0.12 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結(jié)合半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物7(1.62 mg)。其中Fr.14(28.9 g)進(jìn)行MCI gel CHP-20柱色譜分離，以甲醇∶水(0∶100 → 100∶0)梯度洗脫，洗脫組分經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同部分，得到9個(gè)組分，即Fr.14-1～Fr.14-9。其中Fr.14-2(3.59 g)加甲醇溶解，進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(30∶1 → 0∶1)梯度洗脫，得到6個(gè)洗脫組分Fr.14-2-1～Fr.14-2-6。其中Fr.14-2-4(1.39 g)反復(fù)經(jīng)過硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，并結(jié)合使用半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物1(6.28 mg)、2(8.76 mg)。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

前期課題組成員對(duì)月見草總提物以及各分部位進(jìn)行抗肺纖維化活性實(shí)驗(yàn)研究。為探究其發(fā)揮肺纖維化的活性成分，本研究采用MTT法測(cè)定化合物1～10對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞損傷的影響，以初步探究其抗肺纖維化的活性成分。

將BEAS-2B細(xì)胞置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照細(xì)胞密度每毫升2.5×104個(gè)細(xì)胞，每孔200 μL接種于96孔板中，24 h后分為正常組、模型組(TGF-β1，1 ng/mL)及各給藥組(10 μmol/L + TGF-β1，1 ng/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸取摒棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL的DMSO，在490 nm下測(cè)定每個(gè)孔吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞活力(細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組的OD值/正常組的OD值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

1H-1H COSY譜(見圖1)中顯示H-3(δH4.11)和H-2(δH6.87)、H-4(δH3.70)與H-5(δH4.00)和H-4(δH3.70)、H-6(δH2.44，2.53)具有相關(guān)，推測(cè)該結(jié)構(gòu)中有一個(gè)-C=CH-CH-CH-CH-CH2-的結(jié)構(gòu)；在HMBC譜(見圖1)中H-6(δH2.44，2.53)與C-5(δC69.5)、C-4(δC73.8)、C-1(δC130.2)、C-2(δC137.7)、C-7(δC168.5)具有遠(yuǎn)程相關(guān)，可以確定該結(jié)構(gòu)中有一個(gè)莽草酸甲酯結(jié)構(gòu)。1H-1H COSY譜中顯示H-8(δH4.46)和H-10(δH1.40)具有相關(guān)；在HMBC譜中δH4.46(H-8)與δC175.8(C-9)、δC78.7(C-3)、δC19.2(C-10)具有遠(yuǎn)程相關(guān)，推測(cè)該結(jié)構(gòu)中有一個(gè)-O-CHCH3COOCH3結(jié)構(gòu)，且連在莽草酸甲酯的3位碳原子上。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)[13]，由此可以確定該化合物的平面結(jié)構(gòu)。在NOESY譜中，H-4與H-5具有相關(guān)信號(hào)，說明其位于同側(cè)，為β-構(gòu)型；H-3與H-4無相關(guān)信號(hào)，說明其位于異側(cè)，為α-構(gòu)型；H-8與H-3具有相關(guān)信號(hào)，說明其位于同側(cè)，為α-構(gòu)型。經(jīng)過ECD計(jì)算(見圖2)，確定該化合物的絕對(duì)構(gòu)型為3R，4R，5R，8S。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，確定該化合物為新化合物，命名為dimethyl 3-lactyl shikimate(結(jié)構(gòu)見圖3)。該化合物的碳?xì)鋽?shù)據(jù)歸屬見表1?；衔?的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1的1H-1H COSY、HMBC相關(guān)Fig.1 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR(500 MHz)和13C NMR(125 MHz)數(shù)據(jù)(CD3OD)Table 1 1H NMR (500 MHz) and13C NMR (125 MHz) data for compound 1 (in CD3OD)

圖2 化合物1的實(shí)測(cè)和計(jì)算ECD譜圖Fig.2 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

化合物2無色結(jié)晶；分子式為C8H12O5，ESI-MS：m/z211 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.76(1H，m，H-2)，4.29(1H，m，H-3)，4.04(1H，dt，J= 4.8，7.2 Hz，H-5)，3.74(3H，s，7-OCH3)，3.62(1H，d，J= 6.4 Hz，H-4)，2.55(1H，m，H-6a)，2.46(1H，m，H-6b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：129.8(C-1)，139.3(C-2)，70.3(C-3)，75.0(C-4)，69.0(C-5)，32.0(C-6)，168.7(C-7)，52.4(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為methyl shikimate。

化合物3黃色固體；分子式為C17H12O8，ESI-MS：m/z367 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.64(1H，s，H-5)，7.54(1H，s，H-5′)，4.06(3H，s，3-OCH3)，4.04(3H，s，4-OCH3)，4.00(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：111.2(C-1)，140.2(C-2)，140.9(C-3)，152.7(C-4)，111.7(C-5)，112.0(C-6)，158.3(C-7)，112.6(C-1′)，141.5(C-2′)，141.0(C-3′)，153.8(C-4′)，107.5(C-5′)，113.4(C-6′)，158.5(C-7′)，61.3(3′-OCH3)，60.9(3-OCH3)，56.7(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為3,3′,4-O-三甲基鞣花酸。

化合物4黃色固體;分子式為C16H10O8，ESI-MS：m/z353 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.54(2H，s，H-5，5′)，4.04(6H，s，3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：111.7(C-1，1′)，141.2(C-2 2′)，140.2(C-3 3′)，152.2(C-4 4′)，111.5(C-5 5′)，112.2(C-6 6′)，158.5(C-7，7′)，61.0(3，3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為3,3′-二甲氧基-鞣花酸。

化合物5黃色固體;分子式為C17H12O9，ESI-MS：m/z383 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δH7.54(1H，s，H-5′)，4.15(3H，s，3-OCH3)，4.04(3H，s，4-OCH3)，3.89(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：111.7(C-1)，140.1(C-2)，151.7(C-3)，133.4(C-4)，147.0(C-5)，97.5(C-6)，160.9(C-7)，113.0(C-1′)，141.4(C-2′)，140.6(C-3′)，153.1(C-4′)，111.3(C-5′)，113.4(C-6′)，158.3(C-7′)，61.7(4-OCH3)，61.2(3-OCH3)，61.0(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為3,4,3′-三甲氧基鞣花酸。

化合物6白色晶體;分子式為C15H12O5，ESI-MS：m/z295 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：11.83(1H，s，7-OH)，10.38(1H，s，3-OH)，7.24(1H，d，J= 2.1 Hz，H-10)，6.66(2H，d，J= 2.6 Hz，H-2，4)，6.63(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，3.92(3H，s，9-OCH3)，2.74(1H，s，H-11)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：138.4(C-1)，117.6(C-2)，158.6(C-3)，101.6(C-4)，152.6(C-4a)，166.2(C-6)，98.5(C-6a)，164.1(C-7)，99.2(C-8)，164.7(C-9)，103.4(C-10)，137.8(C-10a)，108.8(C-10b)，25.0(C-11)，55.8(9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為Alternariol 9-methyl ether。

化合物7淡黃色粉末;分子式為C11H14O6，ESI-MS：m/z242 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.35(2H，s，H-2，6)，5.13(1H，t，J= 3.8 Hz，H-8)，3.80(6H，s，3，5-OCH3)，3.68(1H，dd，J= 11.6，5.1 Hz，H-9a)，3.58(1H，dd，J= 11.6，5.1 Hz，H-9b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：125.3(C-1)，106.3(C-2，6)，147.7(C-3，5)，141.6(C-4)，198.3(C-7)，74.2(C-8)，64.8(C-9)，55.5(3，5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為2,3-二羥基-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙酮。

化合物8白色無定形粉末;分子式為C10H12O5，ESI-MS：m/z235 [M+Na]+，1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：5.95(1H，d，J= 2.2 Hz，H-5)，5.42(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3)，3.85(3H，s，4-OCH3)，3.64(3H，s，H-4′)，2.77(2H，m，H-1′)，2.68(2H，m，H-2′)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：164.7(C-2)，88.1(C-3)，171.9(C-4)，99.4(C-5)，164.0(C-6)，29.4(C-1′)，31.1(C-2′)，172.7(C-3′)，51.9(C-4′)，55.6(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為scirpyrone H。

化合物9白色無定形粉末;分子式為C12H14O4，ESI-MS：m/z245 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.87(1H，s，H-6)，5.48(1H，dd，J= 6.7，13.2 Hz，H-8)，3.96(3H，s，H-9)，3.94(3H，s，H-11)，2.11(3H，s，H-10)，1.58(3H，d，J= 6.7Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：170.6(C-1)，110.2(C-2)，158.6(C-3)，121.3(C-4)，166.1(C-5)，100.0(C-6)，155.1(C-7)，78.5(C-8)，62.5(C-9)，8.7(C-10)，56.9(C-11)，20.8(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為dimethoxydimethylphthalide。

化合物10無定形固體;分子式為C13H14O4，ESI-MS：m/z257 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.47(1H，s，H-4)，4.74(1H，s，H-10a)，4.72(1H，s，H-10b)，4.08(1H，q，J= 7.1 Hz，H-8)，3.93(3H，s，H-13)，2.10(3H，s，H-12)，1.36(3H，d，J= 7.1 Hz，H-11)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：165.9(C-1)，99.2(C-2)，164.0(C-3)，98.3(C-4)，167.6(C-5)，114.8(C-6)，143.3(C-7)，35.3(C-8)，158.3(C-9)，96.0(C-10)，22.5(C-11)，10.1(C-12)，56.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為clearanol C。

化合物1～10的結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 化合物1～10的結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of compounds 1-10

2.2 活性測(cè)試結(jié)果

采用TGF-β1誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞建立肺纖維化體外模型，探究從月見草中分離得到的化合物1～10對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果表明，化合物2、3可顯著提高TGF-β1誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞的活力，推測(cè)其可能具有潛在的肺保護(hù)作用。

3 結(jié)論

本文通過多種色譜分離技術(shù)對(duì)月見草的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，得到10個(gè)化合物(1～10)，其中化合物1為新化合物；采用MTT法測(cè)定了化合物1～10對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果顯示化合物2、3可顯著提高TGF-β1誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞的活力。本文進(jìn)一步豐富了月見草化學(xué)成分，前期研究多集中在月見草油的相關(guān)藥理活性[23]，本研究的活性測(cè)試結(jié)果也拓展了月見草的藥用價(jià)值，為月見草的開發(fā)利用積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時(shí)課題組前期對(duì)月見草的總提物進(jìn)行了抗肺纖維化活性篩選研究，為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，為其進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。