致灰鶴腹瀉病原菌的分離鑒定和耐藥性分析

陳文東，陳耀年，葉文斌，蘇滿春，2

(1. 隴南師范高等?？茖W校農(nóng)林技術學院，甘肅 成縣 742500 ； 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000)

灰鶴(Grusgrus)別稱玄鶴、番薯鶴或千歲鶴，其全身灰色，頭頂裸露部分為鮮紅色，被有稀疏的黑色短羽，眼后至后枕有一白色條帶，喉、前頸和后頸為灰黑色?；寅Q是大型遷徙濕地候鳥，屬鶴形目鶴科，體長100～120 cm，是目前世界上15種鶴類中數(shù)量最多、分布最廣的一種，常棲息于開闊的平原、河灘、湖泊、草地、曠野、沼澤地帶，是雜食性動物，常以蛙、昆蟲、蜥蜴、魚類、玉米、谷粒等為食，其中以植物的根、莖、葉、果實和種子為主[1-2]。國內灰鶴主要分布在北緯32°20′～53°，東經(jīng)76°～135°，垂直分布在海拔65～3 900 m處，包括新疆喀什葉爾羌河流域、甘肅隴南山地和祁連山地、青海柴達木盆地宗加鄉(xiāng)、寧夏西北部石嘴山和陶樂縣、內蒙古大興安嶺、黑龍江嫩江-烏裕爾河水系流域和吉林白城向海保護區(qū)等[3]。

近年來，家養(yǎng)畜禽感染野生動物源細菌性和病毒性傳染病頻發(fā)，隴南作為灰鶴遷徙過程中的重要駐留地，存在灰鶴源病原菌通過糞便或水源傳染給生態(tài)散養(yǎng)畜禽，引起畜禽傳染病暴發(fā)流行的可能性，因此野生灰鶴是當?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)傳染病的重要潛在傳染源。隴南師專狗博士動物醫(yī)院在救治隴南機場防鳥網(wǎng)誤傷的野生灰鶴的過程中，發(fā)現(xiàn)該灰鶴有腹瀉癥狀，本試驗以灰鶴泄殖腔內細菌為研究對象，對泄殖腔內的細菌進行分離鑒定及耐藥性分析，以期為該灰鶴的治療和畜禽養(yǎng)殖防治野生動物源傳染病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 隴南機場防鳥網(wǎng)誤傷腳趾的野生灰鶴，成鳥，雌性，體重4.32 kg，體長102 cm，全身大部分羽毛呈灰色，頭頂裸露皮膚為鮮紅色，眼后至后枕有一白色條帶，腳呈黑色。

1.2 主要試劑 BGI 2×Super PCR Mix和BGI D2 000 Plus DNA Ladder，均購自武漢華大基因科技有限公司；細菌基因提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖，購自廈門太陽馬生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒，購自上海碩美生物科技有限公司；伊紅美藍培養(yǎng)基(EMB)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和瑞氏染液，均購自青島海博生物技術有限公司；pMD19-T載體，購自上海雅吉生物科技有限公司；藥敏紙片，購自常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；PCR儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品；測序儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.4 細菌分離鑒定 2020年1月12日，無菌采集灰鶴的泄殖腔糞便，置于裝有生理鹽水的離心管內充分搖勻，吸取管內溶液至普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基各加入100 μL溶液，涂布均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，用接種環(huán)挑取單個菌落至另一培養(yǎng)基上純化，反復純化3次，將純化后的細菌進行瑞氏染色，顯微鏡觀察。

1.5 生化試驗 根據(jù)參考文獻[4]的方法，用純化好的細菌進行糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、V-P試驗、硫化氫試驗、甲基紅(MR)試驗、檸檬酸鹽利用試驗和尿素酶試驗，對細菌做進一步鑒定。

1.6 16S rRNA基因擴增及系統(tǒng)進化樹分析 提取分離到的細菌基因組DNA，以此DNA為模板，用16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應體系(30 μL)：DNA模板1 μL，2×GC Buffer Ⅰ15 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應條件：96 ℃預變性5 min；96 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收凝膠目的條帶，克隆至pMD19-T載體中，送武漢華大基因科技有限公司測序。測序結果在GenBank中與相關核苷酸序列進行比對，并構建遺傳進化樹進行分析。

1.7 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推薦的Kirby-Bauer(K-B)法進行藥敏試驗，測定分離菌株對20種抗菌藥(阿米卡星、頭孢唑林、多黏菌素、四環(huán)素、多西環(huán)素、頭孢哌酮、林可霉素、萬古霉素、頭孢氨芐、米諾環(huán)素、哌拉西林、頭孢曲松、鏈霉素、卡那霉素、青霉素、紅霉素、慶大霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶和氨芐西林)的敏感性，試驗結果的判定按美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)(2015年)的標準進行。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定 在灰鶴泄殖腔內共分離出3株細菌，分別編號LNHH1、LNHH2和LNHH3，3株細菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長，且均無溶血環(huán)(圖1A～1C)。LNHH1在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長為紅色菌落，菌落呈圓形半透明，表面濕潤光滑，邊緣整齊(圖1D)；在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈紫黑色菌落，菌落有金屬光澤，呈圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊(圖1E)；瑞氏染色后菌體呈長短不一的短桿狀，兩端鈍圓，藍色，散在分布(圖2A)。LNHH2在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長，菌落呈圓形，較小的凸起，表面灰白色，光滑濕潤(圖1B)；菌體經(jīng)瑞氏染色后呈藍色，圓形或橢圓形，單個、成對或短鏈狀排列(圖2B)。LNHH3在鮮血培養(yǎng)基上生長，菌落呈較大的圓形凸起，灰白色，表面濕潤黏液樣，用接種環(huán)挑取拉成絲狀(圖1C)；經(jīng)瑞氏染色后可見菌體呈較粗的短桿菌，藍色，單獨、成對或聚集存在(圖2C)。

圖1 細菌分離培養(yǎng)Fig.1 Bacterial isolation and cultureA：LNHH1在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； B：LNHH2在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； C：LNHH3在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；D：LNHH1在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； E：LNHH1在伊紅美藍培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)A：Colony morphology of LNHH1 on blood medium； B：Colony morphology of LNHH2 on blood medium； C：Colony morphology of LNHH3 on blood medium； D：Colony morphology of LNHH1 on Macconkey medium； E：Colony morphology of LNHH1 on eosin methylene blue medium

圖2 細菌瑞氏染色(1 000×)Fig.2 Bacterial Wright staining (1 000×)A：LNHH1； B：LNHH2； C：LNHH3

2.2 生化試驗 3株細菌均可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和麥芽糖，LNHH1對甘露醇、MR試驗和吲哚試驗呈陽性反應，硝酸鹽、尿素酶、硫化氫、V-P試驗、檸檬酸鹽反應呈陰性；LNHH2對硝酸鹽、MR試驗和吲哚試驗呈陽性反應，對甘露醇、尿素酶、硫化氫、V-P試驗、檸檬酸鹽反應呈陰性；LNHH3對甘露醇、硝酸鹽、尿素酶、V-P試驗和檸檬酸鹽反應呈陽性，對MR試驗、吲哚試驗和硫化氫試驗呈陰性反應(表1)。將上述結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》比對，初步判定LNHH1為大腸埃希菌(Escherichiacoli)，LNHH2為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，LNHH3為肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)。

表1 生化試驗結果Table 1 Biochemical test results

2.3 16S rRNA基因擴增及系統(tǒng)進化樹分析 將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測樣品均可得到明亮的大小為1 500 bp的電泳條帶(圖3)，符合測序條件。測序結果在NCBI上進行BLAST比對。結果顯示，LNHH1與大腸埃希菌(MH111527.1)親源關系最近；LNHH2與糞腸球菌(MH135230.1)親源關系最近；LNHH3與肺炎克雷伯菌(KY494861.1)親源關系最近(圖4)。結合生化鑒定結果，判定LNHH1為大腸埃希菌，LNHH2為糞腸球菌，LNHH3為肺炎克雷伯菌。

2.4 藥敏試驗 3株細菌對林可霉素和紅霉素均耐藥，LNHH1和LNHH2對四環(huán)素耐藥，LNHH1和LNHH3對萬古霉素和青霉素耐藥。此外，菌株LNHH1對多西環(huán)素耐藥，對其他14種抗菌藥均敏感；菌株LNHH2對阿米卡星、多黏菌素、鏈霉素、卡那霉素和慶大霉素耐藥，對頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢曲松和頭孢他啶中度敏感，對其他7種抗菌藥敏感；菌株LNHH3對氨芐西林中度敏感，對其他15種抗菌藥均敏感(表2)。

圖3 分離菌株16S rRNA序列PCR擴增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA from the isolated strainsM：DNA分子質量標準； 1：LNHH1； 2：LNHH2； 3：LNHH3M:DNA molecular quality standard; 1:LNHH1; 2:LNHH2; 3:LNHH3

圖4 分離菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree base on 16S rRNA nucleotide sequences of the isolated strains▲:本試驗所得分離菌株▲:Strains isolated in this study

表2 藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity test results

3 討論

保護瀕危、珍貴野生動物，對維持生態(tài)平衡和生物多樣性具有重要意義?；寅Q是國家二級保護野生動物，被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ中，有研究報道，目前在我國分布的灰鶴數(shù)量僅有21 632～22 401只[3]。張偉木等對草海鶴類主要疫病研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌病為引起野生灰鶴死亡的重要病因之一，其癥狀包括腹瀉、便血以及呼吸困難等[5]。本試驗中灰鶴因被隴南機場防鳥網(wǎng)誤傷，導致機體免疫力低下，造成體內條件性致病菌大量繁殖而致病。為找出導致灰鶴腹瀉的原因，對腹瀉灰鶴泄殖腔內細菌進行分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗和16S rRNA基因擴增鑒定，分離得到3株細菌，分別為大腸埃希菌、糞腸球菌和肺炎克雷伯菌，均為廣泛存在于動物腸道內的條件性致病菌[6-8]，在機體免疫力低下時，這些存在于機體腸道內的細菌可成為致病菌，對機體造成嚴重威脅[9]。已有研究證實，大腸埃希菌正常情況下主要分布在人和動物的呼吸道、消化道和泌尿系統(tǒng)內，在機體免疫力低下時可以引起人和動物發(fā)生胃腸道或尿道等多種局部組織器官感染[10-11]。糞腸球菌主要分布在畜禽養(yǎng)殖場所和畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)加工的環(huán)境中，或存在于人和動物上呼吸道、消化道和生殖道內，另外還廣泛分布在自然界中[12-13]，可引起牛、羊、豬、雞、鴕鳥和蜜蜂等多種動物發(fā)病[14-15]。肺炎克雷伯菌具備躲避宿主免疫系統(tǒng)的能力，且菌毛為其提供吸附寄存條件，因此大多數(shù)肺炎克雷伯菌具備潛在致病力[16]，雞、鴨、豬、羊、貓和獺兔等畜禽可感染肺炎克雷伯菌而致病[17]?；寅Q在遷徙過程中會停歇在河流或農(nóng)田等地，其糞便會污染這些棲息地，從而使當?shù)丶茵B(yǎng)畜禽感染。

3株細菌生化試驗的反應特性與從其他家養(yǎng)動物分離鑒定的同種細菌生化特性均有不同[18-20]，表明野生動物源細菌鑒定可將生化試驗作為參考，準確鑒定仍需進行16S rRNA基因擴增測序。

目前臨床上主要通過抗生素治療細菌性疾病，隨之導致的細菌對抗生素的耐藥性問題，已在世界范圍內引起高度重視[21]。夏倫斌等對雛雞源致病性糞腸球菌進行耐藥性分析，并利用分析結果進行治療，結果雞群病情得到控制[22]。本試驗為對腹瀉灰鶴精準治療，避免產(chǎn)生耐藥性問題，進行了藥敏試驗，根據(jù)試驗結果對腹瀉灰鶴進行臨床治療，取得了較好效果。同時，甘肅隴南地處秦巴山區(qū)、黃土高原、青藏高原的交匯區(qū)域，為長江流域和亞熱帶氣候地區(qū)，每年該地區(qū)有大量遷徙灰鶴經(jīng)過，其糞便可能會落入養(yǎng)殖場或通過水源與畜禽間接接觸。調查灰鶴源菌株耐藥情況，對當?shù)匦笄蒺B(yǎng)殖防治野生動物源傳染病也具有重要意義。