陽離子宿主防御肽的功能及其臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

于函冬 , 崔 琪 , 孔令聰 , 劉樹明 , 馬紅霞

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130118 ； 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

陽離子宿主防御肽(Cationic host defense peptides，CHDPs)是一種含有親水和疏水側(cè)鏈的兩親性多肽，一般含有12～60個氨基酸，是微生物、植物、無脊椎動物、兩棲動物和哺乳動物等生物體內(nèi)先天性免疫防御系統(tǒng)中的重要組成部分[1]。因其具有特異性殺傷細(xì)菌、不易產(chǎn)生耐藥性、調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)、抑制炎癥加劇以及可單獨(dú)使用或與抗生素聯(lián)合使用的特點(diǎn)，被作為新型抗菌藥物的理想來源。目前已知CHDPs的種類超過3 250多種，均收錄在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(APD：http://aps.unmc.edu/AP/)中，其中還包括一些合成肽。目前抗菌肽也存在一些具有爭議或需要解決的問題，如生產(chǎn)成本高，半衰期短，具體的耐藥機(jī)制尚未明確等，導(dǎo)致部分CHDPs被迫中止臨床試驗(yàn)。隨著新型技術(shù)的發(fā)展，人工改造抗菌肽類衍生物不斷涌現(xiàn)，以期達(dá)到最好的治療效果。本文主要闡述了近年來CHDPs及其衍生物的功能、臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展，以期為CHDPs的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 CHDPs的功能

1.1 抗菌活性 近年來有關(guān)CHDPs的抗細(xì)菌機(jī)制的研究已經(jīng)較為深入，主要分為膜透化機(jī)制和非膜靶向機(jī)制。膜透化機(jī)制包括帶正電的CHDPs與帶負(fù)電的細(xì)胞外膜通過靜電相互作用結(jié)合，以及通過與細(xì)胞內(nèi)膜之間的疏水相互作用結(jié)合。Schneider等[2]發(fā)現(xiàn)雞腸毒素(Cath-2)可通過電荷間的相互作用與細(xì)胞膜外膜結(jié)合，進(jìn)一步與細(xì)胞內(nèi)膜上帶負(fù)電荷的磷脂相互作用，最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物外泄，細(xì)胞死亡。非膜靶向機(jī)制分為CHDPs與胞內(nèi)作用靶點(diǎn)相結(jié)合和抑制細(xì)胞壁的形成2個部分。研究表明CHDPs存在胞內(nèi)作用靶點(diǎn)，可與核酸物質(zhì)結(jié)合，阻止DNA復(fù)制、RNA合成，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分裂、胞內(nèi)酶的活性，從而干擾細(xì)菌正常代謝，最終達(dá)到抑菌的目的。Mardirossian等[3]從寬吻海豚中發(fā)現(xiàn)了一種富含脯氨酸的抗菌肽Tur1A，可通過與核糖體結(jié)合并阻止基因轉(zhuǎn)錄從起始階段到延伸階段的轉(zhuǎn)變來抑制大腸桿菌蛋白質(zhì)的合成從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。CHDPs可以與細(xì)胞壁合成所需的前體分子相結(jié)合，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁的目的。de Leeuw等[4]發(fā)現(xiàn)防御素(HNP1)可與細(xì)胞壁前體脂質(zhì)II結(jié)合，從而抑制細(xì)胞壁的形成，起到抗菌作用。目前有關(guān)CHDPs抗真菌活性的機(jī)制還有待深入研究，已知CHDPs可通過影響真菌結(jié)構(gòu)，改變真菌細(xì)胞膜的通透性以及線粒體的功能進(jìn)一步影響真菌的代謝，抑制其活性。do Nascimento Dias等[5]報(bào)道多肽ToAP2和NDBP-5.7可影響白色念珠菌的膜通透性，并引起真菌細(xì)胞形態(tài)的變化，最終導(dǎo)致其死亡。Puri等[6]發(fā)現(xiàn)唾液中的組蛋白5可以通過影響白色念珠菌線粒體的功能進(jìn)而抑制其活性。Alexander等[7]報(bào)道了一種設(shè)計(jì)合成的抗真菌多肽PAF26，對細(xì)胞的殺傷是復(fù)雜的，且依賴于細(xì)胞外鈣和鈣調(diào)節(jié)機(jī)制的組件。Jiang等[8]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的iturin A可通過改變真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，下調(diào)與轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透壓、氧化還原過程和能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制真菌的代謝。

1.2 抗病毒活性 相關(guān)研究表明，CHDPs體外可抑制包膜病毒如流感病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒，即通過破壞病毒被膜的穩(wěn)定性，從而抑制病毒粒子并破壞其傳染性[9]；也可通過減少病毒復(fù)制或結(jié)合病毒衣殼，導(dǎo)致病毒基因組的脫殼和核進(jìn)入，最終導(dǎo)致病毒裂解死亡。同時，CHDPs對無包膜病毒(如鼻病毒、人乳頭瘤病毒16和腺病毒)也具有抑制活性，可使病毒顆粒聚集，抑制病毒復(fù)制、蛋白質(zhì)的合成以及蛋白激酶C(PKC)的活化，導(dǎo)致病毒死亡。Harcourt等[10]建立了一個更接近人類氣道上皮的氣液界面(ALI)CALU-3模型，發(fā)現(xiàn)在呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)感染前預(yù)先與病毒孵育的LL-37可顯著降低感染的CALU-3細(xì)胞中的病毒基因組水平，說明了LL-37預(yù)防RSV感染和復(fù)制的有效性。He等[11]在非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)GF-17和BMAP-18兩個肽在10 μmol/L時具有較強(qiáng)的抗寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)活性，毒性較小，可直接滅活病毒，也可通過干擾素途徑來抑制ZIKV。

1.3 抗腫瘤和抗寄生蟲活性 CHDPs對寄生蟲和腫瘤細(xì)胞同樣具有抑制作用。研究表明，CHDPs可以在寄生蟲的膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。Kulkarni等[12]發(fā)現(xiàn)α-防御素、馬維菌素和放線菌素型抗菌肽可通過影響能量的產(chǎn)生、DNA的降解及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方式殺傷寄生蟲。Tanaka等[13]發(fā)現(xiàn)α-防御素5可作用于寄生蟲的細(xì)胞質(zhì)膜,破壞其形態(tài),出現(xiàn)暫時的孔洞，胞質(zhì)外溢，阻止速殖子的入侵，以達(dá)到殺滅寄生蟲的目的。汪文博等[14]總結(jié)了克羅他啶(CTN)及其CTN片段(15～34)抗腫瘤活性的雙重機(jī)制，它們優(yōu)先聚集在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中；隨后提出了多種肽攝取途徑，包括直接進(jìn)入和內(nèi)吞作用，抗菌肽能與參與DNA和蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞程序性死亡等過程的蛋白質(zhì)相互作用，最后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡。

1.4 免疫調(diào)節(jié)作用

1.4.1 趨化作用 CHDPs能夠激活抗原呈遞細(xì)胞,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。CHDPs及其從天然CHDPs中提取的小分子合成陽離子肽(IDR)衍生物對嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均顯示出直接的趨化活性，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞內(nèi)流。Beaumont等[15]發(fā)現(xiàn)LL-37可通過影響體內(nèi)中性粒細(xì)胞的功能來增強(qiáng)肺部銅綠假單胞菌感染的清除。另外Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)LL-37在絲裂原活化蛋白激酶p38和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的調(diào)控下促進(jìn)IL-8的產(chǎn)生。Hemshekhar等[17]證明了LL-37通過G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和JNK-MAPK途徑促進(jìn)趨化因子(如GRO-α和IL-8)的產(chǎn)生和白細(xì)胞的募集。Malerba等[18]發(fā)現(xiàn)A族鏈球菌(GAS)感染期間在皮膚中誘導(dǎo)的抗菌肽Hepcidin可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子(CXCL)，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集，最終限制或完全阻止GAS感染的全身性擴(kuò)散。

1.4.2 其他免疫調(diào)節(jié)作用 CHDPs可激活免疫系統(tǒng)的多種功能，是抑制炎癥增強(qiáng)的調(diào)節(jié)因子，也是機(jī)體引發(fā)促炎反應(yīng)的關(guān)鍵因子。Hancock等[19]發(fā)現(xiàn)IDR肽可以控制體內(nèi)的感染并減輕炎癥；Wuerth等[20]發(fā)現(xiàn)IDR-1002可抑制炎性細(xì)胞因子如TNF和IL-6的釋放，抑制活性氧(ROS)的產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞脫顆粒，從而抑制炎癥增強(qiáng)；同年Wu等[21]建立炎癥性疾病模型，發(fā)現(xiàn)IDR-1002可有效控制慢性炎癥。Severino等[22]在盲腸結(jié)扎和穿刺性膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)，放線菌素可使小鼠的促炎基因表達(dá)量增加，進(jìn)而提高小鼠的存活率。這些都證明CHDPs可同時發(fā)揮抗炎和促炎的作用，這與環(huán)境刺激、肽的濃度、細(xì)胞和組織類型及其與微環(huán)境中的其他因素相互作用有一定關(guān)系[23]。

2 CHDPs臨床應(yīng)用

2.1 CHDPs的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀 近年來，越來越多的CHDPs逐漸進(jìn)入臨床試驗(yàn)，大多數(shù)CHDPs已應(yīng)用于局部感染或作為吸入劑來治療感染，其中最先進(jìn)的藥物是培西加南(Pexiganan)，它是爪蟾抗菌肽的類似物，已在III期臨床試驗(yàn)中作為乳霜用于治療感染的糖尿病足潰瘍，但因與目前治療藥物相比療效并不優(yōu)越，并未投產(chǎn)使用。另外通過口服和靜脈內(nèi)途徑的CHDPs，已經(jīng)進(jìn)行或正在進(jìn)行少量的臨床研究。其中艾塞加南(Iseganan)，一種前列腺素1的類似物，被用作口服溶液治療口腔黏膜炎，在III期臨床試驗(yàn)中并未顯示出明顯的療效。當(dāng)然目前也有肽類藥物已經(jīng)獲得批件，其中包括PAC-113，一種在臺灣獲準(zhǔn)上市的組蛋白類似物，用于局部治療口腔念珠菌感染；達(dá)巴文(Dalbavancin BI397)，一種半合成脂糖肽，用于靜脈治療急性皮膚感染；LL-37，一種小陽離子宿主防御肽，用于促進(jìn)靜脈性腿部潰瘍快速愈合(表1)。

2.2 CHDPs潛在的臨床應(yīng)用前景 近年來，相關(guān)研究證明，醫(yī)療器械、假肢關(guān)節(jié)等醫(yī)用植入器材表面上細(xì)菌形成的生物被膜會導(dǎo)致一系列感染，已成為臨床亟待解決的一大難題[33]。生物被膜的根除十分困難，目前臨床上主要通過置換手術(shù)輔以抗生素進(jìn)行治療，但治療費(fèi)用昂貴，并給患者造成巨大的痛苦，因此尋找一種安全有效的新型藥物或者治療方法是必要的。CHDPs可通過結(jié)合聚苯乙烯覆蓋在器材表面，改變細(xì)菌生物被膜表面的疏水性，減弱其在器材表面的黏附作用，干擾生物被膜相關(guān)信號分子的表達(dá)，消除細(xì)菌生物被膜內(nèi)的胞外基質(zhì)，從而殺死生物被膜內(nèi)的細(xì)菌[34]。Lin等[35]發(fā)現(xiàn)合成陽離子抗菌肽 WLBU2在防止細(xì)菌附著方面比常用抗菌藥黏菌素療效提高3～8倍。Dutta等[36]發(fā)現(xiàn)涂有合成免疫調(diào)節(jié)肽Mel4的硅水凝膠隱形眼鏡可以減少相關(guān)的感染和炎癥。雖然CHDPs在生物被膜的抑制和清除方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景，但是目前還沒有深入研究其對成熟生物被膜的清除作用以及明確的作用機(jī)制。另外，將CHDPs真正用于臨床治療細(xì)菌感染形成的生物被膜之前，還需要進(jìn)行大量臨床前試驗(yàn)，以確定最佳的給藥劑量和方式。

表1 目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)或處于臨床試驗(yàn)的CHDPs及其衍生物

此外，抗菌藥添加劑的長期使用，嚴(yán)重破壞了動物腸道微生物平衡狀態(tài)，并且有部分抗菌藥在動物體內(nèi)殘留，嚴(yán)重影響了畜產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量，危害人類健康。為維護(hù)我國動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種；自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料等飼料禁抗的規(guī)定。在這種情況下，尋找一種既無抗藥性，又無殘留等問題的新型飼料添加劑是必要的。CHDPs具有抗菌譜廣、效果穩(wěn)定、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、與其他抗菌物質(zhì)聯(lián)合有協(xié)同作用等優(yōu)點(diǎn)，另外有研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加CHDPs具有促進(jìn)生長和提高免疫力的作用[37]，因此CHDPs作為飼料添加劑在動物生產(chǎn)方面具有良好的應(yīng)用前景。Liao等[38]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加1%的多肽S100顯著提高了凡納濱對蝦的增重(Weight gain，WG)和比生長率(Sustainable growth rate，SGR)，WG增加高達(dá)1 176.3倍，SGR增加了0.12%，并改善了抗菌免疫能力和腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。Tai等[39]發(fā)現(xiàn)雞飼料中添加重組抗菌肽魚青素可以提高家雞的增重，最高可達(dá)140.42倍，同時可以提高生產(chǎn)性能及機(jī)體免疫應(yīng)答。Peng等[40]發(fā)現(xiàn)β-防御素2(β-defensin 2，rpBD2)作為斷奶仔豬的飼料添加劑可以提高仔豬的體重、平均日增重以及平均日采食量，并且降低仔豬斷奶后腹瀉的發(fā)生率。

3 小結(jié)與展望

CHDPs因其具有分布廣泛、毒性小、功能多樣化等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為醫(yī)藥，食品、畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前通過開發(fā)非肽類CHDPs模擬化合物，研究其與常規(guī)抗生素的協(xié)同作用以及聯(lián)合納米生物技術(shù)等方法，在抑制耐藥病原體，減輕慢性炎癥，針對特定的癌癥等方面取得巨大進(jìn)展，并且相關(guān)藥物開發(fā)數(shù)量也迅速增長。多數(shù)多重耐藥細(xì)菌的耐藥機(jī)制是抑制抗菌藥進(jìn)入細(xì)胞,而CHDPs可以作用于細(xì)胞膜，增加細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性,使抗菌藥滲透到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。目前臨床上CHDPs與常規(guī)抗菌藥聯(lián)合使用的協(xié)同作用已被證實(shí)，但是聯(lián)合使用時必須考慮藥物的拮抗作用、多重感染以及不良反應(yīng)等問題。研究表明CHDPs可通過與癌細(xì)胞膜相互作用引起細(xì)胞裂解死亡，這可能是CHDPs抗癌機(jī)制的關(guān)鍵步驟，CHDPs也可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制癌細(xì)胞的增殖。雖然現(xiàn)在獲得市場批準(zhǔn)的抗癌CHDPs較少，但CHDPs的特異性、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)使其在代替化療藥物或與實(shí)際治療結(jié)合等方面具有巨大潛力。目前以CHDPs為基礎(chǔ)的藥物開發(fā)還面臨著很多挑戰(zhàn)，尤其是在藥代動力學(xué)參數(shù)、藥物制劑種類以及抗菌機(jī)制等方面缺少理論基礎(chǔ)。因此，開發(fā)以CHDPs為基礎(chǔ)的藥物應(yīng)與大數(shù)據(jù)生物信息平臺等新型的生物信息學(xué)檢測技術(shù)的方法相結(jié)合。隨著新型CHDPs研究的不斷深入，新技術(shù)的快速發(fā)展將極大地推進(jìn)CHDPs藥物的篩選和研發(fā)工作，同時將為治療創(chuàng)傷感染，心血管疾病以及癌癥等方面帶來希望。