湖北省某奶牛場(chǎng)乳腺炎主要病原微生物的分離鑒定與藥敏分析

許順鑫，張海艷，胡長(zhǎng)敏，金爾光，李 東，胡秀秀,4，陳 潔

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430208 ； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070 ；3.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430016 ； 4.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

奶牛乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最常見且對(duì)奶牛生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的一種復(fù)雜的乳腺綜合疾病，可由病原微生物入侵、機(jī)械性刺激或化學(xué)物理性損傷等因素引起，導(dǎo)致奶牛出現(xiàn)妊娠率降低、流產(chǎn)率升高等，影響奶牛的繁殖性能[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1例普通的臨床型奶牛乳腺炎的治療費(fèi)用平均在150元左右，嚴(yán)重者可能高達(dá)幾百元，極大地增加了奶牛的養(yǎng)殖成本[2]。

目前已知能夠引起奶牛乳腺炎的病原微生物有150種之多[3]，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸埃希菌為主，約占所有病原微生物的90%以上[4]。牛無(wú)綠藻(Protothecabovis，P.bovis)曾被命名為中型無(wú)綠藻基因Ⅱ型(Protothecazopfiigenotype Ⅱ)，后根據(jù)Jagielski等[5]的研究重新分類命名為P.bovis，其被認(rèn)為是可導(dǎo)致奶牛隱性乳腺炎的一種條件性致病藻類。近年來(lái)，由P.bovis所引起的奶牛乳腺炎在波蘭[6]、韓國(guó)[7]、日本[8]、德國(guó)[9]、意大利[10]等國(guó)家被大量報(bào)道，在我國(guó)北京、天津、山東等地也相繼出現(xiàn)牛無(wú)綠藻性奶牛乳腺炎的報(bào)道[11-12]。

本試驗(yàn)對(duì)湖北省某規(guī)?；膛?chǎng)引起奶牛乳腺炎的主要病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢、分子生物學(xué)方法鑒定，并對(duì)主要病原菌分離株進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)及分析，以期對(duì)奶牛乳腺炎的防控提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar medium，SDA)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose broth medium，SDB)、無(wú)綠藻選擇性培養(yǎng)基(Prototheca selective medium，PIM)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(Tryptose soya agar，TSA)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Tryptose soya broth，TSB)，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭染色液，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；乳酸酚棉藍(lán)染色液，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DNA Marker(DL1 000、DL2 000)、ExTaqDNA聚合酶、Buffer緩沖液、dNTP和ddH2O，均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Ⅱ級(jí)生物安全柜，蘇州蘇潔生物有限公司產(chǎn)品；GI80DWS型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司產(chǎn)品；BM2000型臺(tái)式光學(xué)顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司產(chǎn)品；HYL-C型全自動(dòng)振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CP-ST100A二氧化碳培養(yǎng)箱，長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司產(chǎn)品；ETC 811型PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥敏材料 本試驗(yàn)采用的31種常規(guī)抗菌藥敏紙片如表1所示，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，包括青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類和抗真菌類等；組合式藥敏檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳樣采集 乳樣采集于湖北省某規(guī)?；膛?chǎng)，根據(jù)奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定體系(Dairy herd improvement，DHI)測(cè)定結(jié)果和臨床奶牛乳腺炎癥狀進(jìn)行綜合判斷，選取乳樣中體細(xì)胞數(shù)高于100萬(wàn)個(gè)/mL或存在輕微臨床型乳腺炎癥狀的奶牛進(jìn)行采樣，共采集40份樣品，采樣前對(duì)奶牛乳區(qū)進(jìn)行清洗消毒，棄置前3把奶，隨后采集15～20 mL多乳區(qū)混合生鮮乳樣品于無(wú)菌離心管中，置冰盒暫存，2 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將乳樣搖勻后進(jìn)行梯度稀釋，取不同濃度乳樣100 μL接種于TSA、SDA和PIM平板上，使用無(wú)菌涂布棒涂抹均勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，肉眼觀察菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)和菌落形態(tài)，挑取典型的菌落進(jìn)行劃線純化，并進(jìn)行唯一性編號(hào)，接著對(duì)典型單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色或乳酸酚棉藍(lán)染色，在油鏡下進(jìn)行鏡檢，根據(jù)菌落形態(tài)和染色特征初步判定細(xì)菌類屬。

表1 藥敏紙片名稱和含量Table 1 Names and contents of drug senstitive papers

1.2.3 PCR鑒定 對(duì)分離出的典型單個(gè)菌落使用16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系見表2，其中DNA模板為在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的菌液。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，電泳結(jié)束后進(jìn)行凝膠成像分析。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送檢測(cè)序，在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性分析，確定病原菌的類別。對(duì)疑似P.bovis的分離菌株進(jìn)行cytb特異性引物擴(kuò)增鑒定[13]，引物序列：cytb-F：5′-GyGTwGAACAyATTATGAGAG-3′；cytb-R：5′-wACCCATAArAArTACCATTCwGG-3′。PCR反應(yīng)體系見表2，其中DNA模板為在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的菌液。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸5 min，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，電泳結(jié)束后進(jìn)行凝膠成像分析。

1.2.4 最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)測(cè)定 對(duì)分離出的P.bovis、葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鏈球菌和棒狀桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法，利用組合式藥敏檢測(cè)試劑盒(氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南、安普霉素、黏桿菌素、乙酰甲喹)進(jìn)行MIC測(cè)定。

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法。對(duì)分離編號(hào)后的P.bovis分別接種至SDB培養(yǎng)基中增殖24～48 h，使用麥?zhǔn)媳葷峁芊ㄕ{(diào)整P.bovis菌液濃度至1×108CFU/mL，使用移液器分別吸取100 μL轉(zhuǎn)移至SDA培養(yǎng)基上，用無(wú)菌涂布棒將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面；使用滅菌眼科鑷夾取藥敏紙片置于培養(yǎng)基表面貼緊，記錄各藥敏紙片名稱及位置，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后使用游標(biāo)卡尺測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑。敏感度判定參照杭州微生物試劑有限公司官網(wǎng)發(fā)布的《藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定 本試驗(yàn)對(duì)湖北省某規(guī)?；膛?chǎng)奶樣中體細(xì)胞數(shù)較高的奶牛進(jìn)行采樣，對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化、肉眼觀察(圖1)、染色鏡檢(圖2)和16S rRNA通用引物擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)進(jìn)行鑒定，對(duì)疑似P.bovis菌株進(jìn)行cytb特異性引物擴(kuò)增鑒定(圖3)。結(jié)果顯示，40份被檢乳樣中共分離出83株微生物，其中能引起奶牛乳腺炎的病原微生物共有46株，主要為P.bovis、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌(表3)，分離率分別為65.0%(26/40)、12.5%(5/40)和10.0%(4/40)；其他非病原微生物有37株，主要包括干燥棒狀桿菌、芽孢桿菌、庫(kù)克氏菌、嗜根考克氏菌等。由此可見，引起該規(guī)?；膛?chǎng)奶牛乳腺炎的主要病原微生物為P.bovis、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌。

圖1 肉眼觀察P.bovis菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of P.bovis by naked eyes

圖2 P.bovis顯微鏡下形態(tài)(1 000×)Fig.2 Microscopic morphology of P.bovis (1 000×)A:革蘭染色； B:乳酸酚棉藍(lán)染色A:Gram staining; B:Lactophenol cotton blue staining

圖3 乳樣分離P.bovis cytb基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of cytb gene of P.bovis isolated from fresh milk samplesM:DL1 000 Marker； 1～16：P.bovis分離株； 17：陽(yáng)性對(duì)照； 18：陰性對(duì)照M:DL1 000 Marker; 1-16:Isolated P.bovis; 17:Positive control; 18:Negative control

表3 湖北省某規(guī)模化奶牛場(chǎng)病原微生物分離Table 3 Isolation of pathogenic microorganisms in a dairy farm in Hubei Province

2.2 MIC測(cè)定 采用組合式藥敏MIC檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示，本試驗(yàn)分離的P.bovis對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、氧氟沙星、黏桿菌素敏感，對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、恩諾沙星、美羅培南、安普霉素、乙酰甲喹中度敏感，對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、多西環(huán)素、頭孢噻呋、頭孢他啶不敏感。金黃色葡萄球菌對(duì)磺胺異噁唑、安普霉素敏感，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、恩諾沙星、氧氟沙星、黏桿菌素、乙酰甲喹中度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢他啶、美羅培南不敏感。乳房鏈球菌對(duì)氨芐西林、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、頭孢噻呋，頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南敏感，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、安普霉素、黏桿菌素、乙酰甲喹中度敏感，對(duì)多西環(huán)素不敏感。

2.3 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片測(cè)定P.bovis對(duì)抗菌藥物的敏感性，結(jié)果如表5所示，P.bovis對(duì)頭孢類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、糖肽類、β-內(nèi)酰胺類、林可霉素類和磺胺類的大部分抗菌藥均不敏感，僅對(duì)多黏菌素B、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、兩性霉素B中度敏感，對(duì)抗真菌類抗菌藥制霉菌素B敏感。

表4 主要病原微生物MIC測(cè)定結(jié)果Table 4 MIC determination results of main pathogenic microorganisms (μg/mL)

續(xù)表

表5 26株P(guān).bovis對(duì)主要抗菌藥物敏感性Table 5 Sensibility of 26 strains P.bovis to major antibiotic agents

續(xù)表

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)湖北省某奶牛場(chǎng)的部分乳腺炎患牛乳樣進(jìn)行主要病原微生物的分離和鑒定，分離出主要病原微生物為P.bovis、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌，其中P.bovis的分離率為65.0%。同時(shí)也分離出大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等奶牛乳腺炎常見病原微生物。Shahid等[11]報(bào)道,由北京、天津和山東省所采集到的620份牛奶樣品中分離出84株P(guān).bovis，分離率為13.5%，從收集到的410份環(huán)境樣品中分離出21份P.bovis，分離率為5.1%；張寒琪等[12]報(bào)道的北京某規(guī)?；膛?chǎng)中采集的11份臨床型乳腺炎奶樣中分離出8株P(guān).bovis，分離率為72.7%；Alfonso等[14]報(bào)道意大利的科莫省、萊科省、米蘭省、洛迪省4個(gè)地區(qū)奶牛乳腺炎流行病學(xué)調(diào)查情況中，主要病原微生物為金黃色葡萄球菌(42.0%)、無(wú)乳鏈球菌(9.6%)、P.bovis(11.1%)、牛分枝桿菌(1.55%)；Jagielski等[15]對(duì)波蘭16個(gè)奶牛場(chǎng)奶牛乳腺炎進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)主要病原微生物為鏈球菌屬(19.3%)、葡萄球菌屬(7.8%)、P.bovis(8.0%)；朱俊平[16]報(bào)道的山東省東營(yíng)市奶牛乳腺炎流行病學(xué)調(diào)查顯示，主要致病菌為無(wú)乳鏈球菌(27.2%)、金黃色葡萄球菌(26.5%)、大腸埃希菌(15.1%)、停乳鏈球菌(12.1%)；沈陽(yáng)陽(yáng)等[17]報(bào)道的蘇中地區(qū)部分規(guī)?；翀?chǎng)奶牛乳腺炎流行病學(xué)調(diào)查情況中，主要致病菌為金黃色葡萄球菌(15.0%)、大腸埃希菌(55.0%)、枸櫞酸桿菌(35.0%)、不動(dòng)桿菌(30.0%)和肺炎克雷伯菌(30.0%)；王玲等[18]報(bào)道的廣西壯族自治區(qū)某規(guī)?；膛?chǎng)的奶牛乳腺炎流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，假絲酵母菌分離率最高，達(dá)73.1%；王軍等[19]對(duì)青海省部分規(guī)?；膛?chǎng)乳腺炎進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，主要致病菌是大腸埃希菌(14.0%)，其次為金黃色葡萄球菌(4.2%)和鏈球菌(1.4%)。由于地理位置、氣候條件和飼養(yǎng)管理水平不同，奶牛乳腺炎主要病原微生物的分離情況存在較大差異。本試驗(yàn)為了重點(diǎn)了解奶牛場(chǎng)隱性乳腺炎主要病原微生物種類，專門挑選了前期調(diào)查已經(jīng)證實(shí)了的某P.bovis陽(yáng)性奶牛場(chǎng)作為調(diào)查對(duì)象，并采集了體細(xì)胞數(shù)高于100萬(wàn)個(gè)/mL的乳樣進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，P.bovis分離率高達(dá)65.0%，明顯高于大多數(shù)報(bào)道以及本團(tuán)隊(duì)前期調(diào)查數(shù)據(jù)[20]。這進(jìn)一步提示，P.bovis與奶牛隱性乳腺炎存在著緊密的聯(lián)系，其感染機(jī)制及相關(guān)的防控措施研究值得學(xué)者進(jìn)一步關(guān)注和探索。

本試驗(yàn)中使用紙片瓊脂擴(kuò)散法和MIC法對(duì)分離出的奶牛乳腺炎主要病原微生物進(jìn)行藥敏分析，通過紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)了分離出的P.bovis對(duì)常見抗菌藥的敏感性；通過MIC法檢測(cè)了P.bovis與其他常見奶牛乳腺炎病原微生物藥敏分析的差異。結(jié)果顯示，該奶牛場(chǎng)所分離出的P.bovis對(duì)頭孢類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、糖肽類、β-內(nèi)酰胺類、林可霉素類和磺胺類的大部分抗菌藥均不敏感，對(duì)多黏菌素B、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、兩性霉素B中度敏感，對(duì)抗真菌類抗菌藥制霉菌素B敏感；MIC檢測(cè)結(jié)果顯示，P.bovis對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、氧氟沙星、黏桿菌素敏感，對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、恩諾沙星、美羅培南、安普霉素、乙酰甲喹中度敏感，對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、多西環(huán)素、頭孢噻呋、頭孢他啶不敏感。侯榮光等[21]對(duì)P.bovis進(jìn)行藥敏分析表明，P.bovis僅對(duì)制霉菌素、慶大霉素、阿米卡星和鏈霉素敏感。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)奶牛乳腺炎的治療主要依賴抗菌藥物，使用抗菌藥治療在一定程度上可以治愈奶牛乳腺炎，同時(shí)奶牛產(chǎn)前給予抗菌藥還能有效防止乳腺炎的發(fā)生。結(jié)合該奶牛場(chǎng)病原微生物分離情況，P.bovis的感染情況最為嚴(yán)重，故可以考慮選擇針對(duì)P.bovis有效的抗真菌類或氨基糖苷類藥物進(jìn)行治療，如制霉菌素B、兩性霉素B、慶大霉素等，同時(shí)也需考慮針對(duì)乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等其他奶牛乳腺炎常見病原微生物進(jìn)行綜合防治。鑒于P.bovis是一種條件致病性藻類，能在溫暖、潮濕的環(huán)境中長(zhǎng)期存在，防控?zé)o綠藻性奶牛乳腺炎仍需以加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生消毒、改善擠奶設(shè)備和擠奶程序?yàn)橹饕A(yù)防控制手段，輔以干奶期科學(xué)使用抗菌藥進(jìn)行預(yù)防，同時(shí)考慮使用生物制劑和中藥制劑等新型治療方法進(jìn)行治療，從而有效降低奶牛乳腺炎發(fā)生率，保障奶牛正常生產(chǎn)和乳品質(zhì)量安全。

目前P.bovis所導(dǎo)致的奶牛乳腺炎在世界范圍內(nèi)越來(lái)越引起人們的重視，由于P.bovis對(duì)大多數(shù)抗菌藥不敏感，奶牛一旦發(fā)生感染很難治愈，且P.bovis一旦感染，在奶牛場(chǎng)環(huán)境中可能長(zhǎng)期存在，污染奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、牛床、飼料、水槽和擠奶機(jī)等[22]，P.bovis所致奶牛乳腺炎的流行病學(xué)調(diào)查、致病機(jī)制和防治措施研究值得引起國(guó)內(nèi)外研究者和養(yǎng)殖業(yè)主們的重點(diǎn)關(guān)注，加快針對(duì)P.bovis的中草藥制劑研究及環(huán)境消毒劑研發(fā)或許對(duì)有效防控?zé)o綠藻性奶牛乳腺炎起到重要作用。