梅花針聯(lián)合超聲導(dǎo)入在增生性瘢痕兔耳模型光動(dòng)力治療中的應(yīng)用研究

張明莉，柯錦城，焦云鶴，馬 莉

（廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，福建 廈門，361021）

增生性瘢痕是一種由創(chuàng)傷、手術(shù)、燒傷、痤瘡和帶狀皰疹等恢復(fù)不當(dāng)引起的病理性瘢痕[1]，對(duì)患者的形體美觀、肢體功能以及心理健康均產(chǎn)生嚴(yán)重影響。目前病理性瘢痕仍缺乏非常理想的治療手段，近年來(lái)有研究應(yīng)用光動(dòng)力療法對(duì)病理性瘢痕或其成纖維細(xì)胞進(jìn)行治療，取得了一定的療效，但由于光敏劑前體藥物和光的穿透深度有限，治療效果仍欠理想，需要改善前體藥物給藥方法和光的傳入途徑，以加強(qiáng)瘢痕組織對(duì)光動(dòng)力的治療反應(yīng)[2]。本研究使用動(dòng)物模型，擬觀察采用梅花針聯(lián)合超聲波導(dǎo)入光敏劑的光動(dòng)力治療方法對(duì)增生性瘢痕的有效性和安全性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

新西蘭大耳白兔6只，均為雄性，體重2.0～2.5 kg，購(gòu)自上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)。TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；Masson染色試劑套裝購(gòu)自廈門安提海拉生物科技有限公司；光敏劑外用鹽酸氨酮戊酸散購(gòu)自上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司；LED光譜治療儀購(gòu)自科諾醫(yī)學(xué)儀器設(shè)備有限公司；超聲波導(dǎo)入儀器購(gòu)自以色列飛頓公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兔耳增生性瘢痕(HS)模型建立

本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審批，參考賈宇博等造模方法[3-4]，6只新西蘭大耳白兔，5%異氟烷氣麻生效后將濃度降低為3%維持麻醉，剃刀刮除兔耳腹側(cè)毛發(fā)，露出光滑皮膚，充分暴露操作視野，展平兔耳，避開皮下較大血管，沿兔耳腹側(cè)長(zhǎng)軸用環(huán)鉆做直徑8 mm創(chuàng)面，切除全層皮膚，保留軟骨，11號(hào)手術(shù)刀片以及止血鉗將軟骨膜刮除剔除干凈，后紗布?jí)浩戎寡?-5分鐘，待創(chuàng)面自行愈合，愈合前創(chuàng)面未給予碘伏消毒等任何操作。33周后創(chuàng)面上皮化，形成突出于皮膚表面的紅色增生性瘢痕，界限清晰，表面光滑無(wú)毛。6只大耳兔每耳造模6～7個(gè)，間隔1～1.5cm，共建立60個(gè)可供實(shí)驗(yàn)用的瘢痕組織。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與方法

造模成功后將60個(gè)增生性瘢痕隨機(jī)分成3組（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組），每組20個(gè)。實(shí)驗(yàn)組HS先經(jīng)過梅花針點(diǎn)刺，壓迫止血，外涂20%鹽酸氨酮戊酸凝膠制劑（ALA），超聲波導(dǎo)入（50HZ,占空比50%）2.5 min后外敷3 h，LED紅光源(633 nm)照射30 min，能量密度100 mW/cm2，連續(xù)3次，每次間隔1周。對(duì)照組HS單純進(jìn)行光動(dòng)力治療，20%ALA凝膠制劑外敷3 h后照光30 min，能量密度100 mW/cm2，連續(xù)3次，間隔1周?？瞻捉M未經(jīng)任何處理。光動(dòng)力治療結(jié)束后4周，觀察瘢痕組織大體形態(tài)變化，切取各組HS組織進(jìn)行Masson染色觀察膠原變化，此外使用TUNEL（免疫組化法，具體按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2 觀察指標(biāo)與療效判定標(biāo)準(zhǔn)

TUNEL免疫組化結(jié)果判定采用采陽(yáng)性系數(shù)的判定方法[5]，陽(yáng)性系數(shù)記分=染色強(qiáng)度記分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比記分。棕黃色、棕褐色為陽(yáng)性染色，陽(yáng)性細(xì)胞百分比=染色陽(yáng)性的細(xì)胞個(gè)數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，＜5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，＞51%記3分。顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野（400×），依據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，不染色記0分，淡染色記1分，中等強(qiáng)度染色記2分，深染色記3分。陽(yáng)性系數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性(-)為0～1分；弱陽(yáng)性()為2～3分，中等陽(yáng)性()為4～6分，強(qiáng)陽(yáng)性()為9分。療效判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性系數(shù)0～1分無(wú)效，2～3分為顯效，4分以上為優(yōu)效。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組瘢痕組織外觀形態(tài)變化

治療前HS組織色紅、隆起、質(zhì)硬韌；治療后，實(shí)驗(yàn)組HS色澤明顯變淡、質(zhì)地明顯變平變軟，空白組瘢痕組織色略暗淡、質(zhì)地變化不明顯，對(duì)照組變化介于兩者之間，見圖1。

圖1 治療前后瘢痕組織外觀形態(tài)變化

2.2 各組瘢痕組織膠原纖維Masson 染色

膠原纖維呈藍(lán)色?？瞻捉M真皮膠原纖維粗大紊亂，排列緊密；實(shí)驗(yàn)組膠原變細(xì)、排列規(guī)則疏松；對(duì)照組膠原粗細(xì)、排列密度及規(guī)則度方面的改善均較實(shí)驗(yàn)組為弱、較空白組明顯，見圖2。

圖2 治療后瘢痕組織膠原纖維Masson 染色

2.3 TUNEL 結(jié)果

3組TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況見表1和圖3，各組染色結(jié)果陽(yáng)性系數(shù)等級(jí)分布見表2，各組療效比較見圖4。經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組與空白組有效率兩兩比較，Z值分別為-2.190和-3.543（P＜0.05）。

表1 三組陽(yáng)性細(xì)胞百分比均值（，%）

表1 三組陽(yáng)性細(xì)胞百分比均值（，%）

圖3 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

表2 三組陽(yáng)性系數(shù)等級(jí)分布

圖4 各組療效情況

3 討論

光動(dòng)力（PDT）治療病理性瘢痕，是近年來(lái)研究較多的新方法?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PDT療法通過上調(diào)基因p53/p21、Bax/Bcl-2的比值以及caspase-3剪切等機(jī)制導(dǎo)致成纖維細(xì)胞凋亡[6]，同時(shí)PDT明顯限制成纖維細(xì)胞TGF-β1及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)[6,7]，減少血管形成[8]，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使血流減少、柔韌性增加、膠原蛋白和血紅蛋白水平下降[9]。由于光敏劑前體藥物吸收有限等因素制約，PDT在瘢痕方面的治療效果仍有待提升。

梅花針是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)當(dāng)中重要外治法之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中屬于物理治療范疇[10]。梅花針叩刺可人為造成眾多微小孔道，有利于外用藥物滲透吸收[11]。有研究采用梅花針垂直叩刺皮膚癌皮疹預(yù)處理后進(jìn)行10%鹽酸氨酮戊酸（ALA）凝膠封包，可提高ALA的藥物滲透，加強(qiáng)了ALA-PDT 治療皮膚腫瘤的療效[12,13]。

超聲波技術(shù)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用技術(shù)手段之一，除了作為常規(guī)檢查技術(shù)，還可以用于疾病的治療。當(dāng)一定強(qiáng)度和頻率的超聲能量作用于液體時(shí)會(huì)產(chǎn)生眾多微小氣泡，這些微泡會(huì)發(fā)生震蕩、膨脹甚至爆裂，這稱之為超聲波的空化效應(yīng)。當(dāng)空化效應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞膜表面時(shí)，細(xì)胞膜形成瞬時(shí)可逆的斷裂、塌陷，形成聲孔效應(yīng)，從而增加細(xì)胞膜通透性，有利于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)[14]。發(fā)生空化效應(yīng)時(shí)，聲場(chǎng)能量瞬間釋放，細(xì)胞微環(huán)境可以產(chǎn)生高溫高壓，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)、細(xì)胞降解壞死等一系列繼發(fā)損傷。同時(shí)Prescott[15]等發(fā)現(xiàn)超聲波空化效應(yīng)可以通過破壞細(xì)胞骨架而直接使細(xì)胞損傷死亡。

本研究將梅花針與超聲波導(dǎo)入聯(lián)合使用，研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（梅花針聯(lián)合超聲波導(dǎo)入處理后再進(jìn)行光動(dòng)力治療組）的瘢痕組織色澤更淡，質(zhì)地較對(duì)照組

（單獨(dú)光動(dòng)力治療組）和空白組（未給予任何處理）更平軟，且膠原變細(xì)、排列更規(guī)則疏松；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡水平亦高于其他兩組。從研究結(jié)果看，光動(dòng)力治療前經(jīng)過梅花針點(diǎn)刺聯(lián)合超聲波導(dǎo)入光敏劑前體藥物的方法對(duì)增生性瘢痕治療有效，且較單純光動(dòng)力治療效果佳，可能與梅花針點(diǎn)刺打開組織通道后超聲波加強(qiáng)促進(jìn)了光敏劑前體藥物的滲透轉(zhuǎn)運(yùn)吸收有關(guān)，光敏劑前體藥物吸收增加可能使后續(xù)產(chǎn)生的單線態(tài)氧或氧自由基等活性氧物質(zhì)增加，進(jìn)而加強(qiáng)細(xì)胞毒性等光化學(xué)反應(yīng)作用，增強(qiáng)光動(dòng)力治療效果。其次，超聲波的空化效應(yīng)可以使組織細(xì)胞骨架受損，促進(jìn)細(xì)胞崩解，增加活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，加速細(xì)胞傷亡，也可能協(xié)同強(qiáng)化了光動(dòng)力的治療作用。這提示梅花針點(diǎn)刺聯(lián)合超聲波導(dǎo)入促滲的方法可有效增強(qiáng)增生性瘢痕的光動(dòng)力治療效果。近年有研究表明，光敏劑ALA的代謝產(chǎn)物原卟啉(PpIX)也是一種較強(qiáng)的聲敏劑，在適當(dāng)頻率和強(qiáng)度的超聲波作用下產(chǎn)生聲-化學(xué)效應(yīng)，造成組織細(xì)胞損傷死亡，故本研究中若在ALA凝膠外敷結(jié)束充分產(chǎn)生PpIX時(shí)再次給予超聲波作用，聯(lián)合光照依次進(jìn)行，筆者認(rèn)為這是再次增強(qiáng)光動(dòng)力治療效果可以考慮嘗試的方法。同時(shí)，本研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，樣本量偏小，操作過程中存在不可避免的實(shí)驗(yàn)誤差，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定偏差。由于經(jīng)費(fèi)等問題，本研究中未能比較不同組別間光動(dòng)力治療后不同時(shí)段細(xì)胞凋亡水平的差異，未能探究梅花針和超聲波單獨(dú)預(yù)處理對(duì)光動(dòng)力療效的影響；由于實(shí)驗(yàn)條件等限制，本研究亦未能直接檢測(cè)梅花針聯(lián)合超聲波導(dǎo)入處理后光敏劑前體藥物的真實(shí)吸收水平、所產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)的具體含量，使得本研究存在一定的局限性，有待后續(xù)研究完善。