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    基于UPLC-Q/TOF-MS/MS和生物信息學(xué)探討鐵棍山藥皮中化學(xué)成分的藥用和營養(yǎng)價(jià)值

    2023-01-13 13:12:50馬婧瑋袁永亮翟南南鄭鷺飛吳緒金
    食品工業(yè)科技 2023年2期
    關(guān)鍵詞:皮中鐵棍山藥

    安 莉,汪 紅,馬婧瑋,袁永亮,翟南南,鄭鷺飛,吳緒金,

    (1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,河南鄭州 450002;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,河南鄭州 450052;3.SCIEX中國,北京 100015;4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,北京 100081)

    鐵棍山藥(Dioscorea oppositeThunb. cv. Tiegun)為薯蕷科植物薯蕷的塊莖,分布于河南省武陟縣、溫縣等地的山藥品種,其性平味甘,健脾止瀉、補(bǔ)肺益腎,具有“補(bǔ)虛羸、除寒邪熱、補(bǔ)中益氣力、長肌肉、久服耳目聰明、輕身不饑、延年”等功效,屬山藥中的極品[1]。鐵棍山藥富含多糖、蛋白、脂類、黃酮、多酚類等多種活性成分,具有調(diào)節(jié)脾胃、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等作用,兼有食用價(jià)值和藥用價(jià)值[2-3]。

    除了鐵棍山藥的藥用飲片外,目前市場上也不斷涌現(xiàn)出以鐵棍山藥為原料制成的零食或保健品,如鐵棍山藥薯片、鐵棍山藥餅干、鐵棍山藥粉等。然而,無論是在直接食用或加工鐵棍山藥過程中,鐵棍山藥皮一般都直接削除丟棄,造成了極大的資源浪費(fèi)。目前,關(guān)于鐵棍山藥皮的報(bào)道尚少,僅見對(duì)其所含部分成分的研究,如多糖[4]、黃酮類化合物的提取[5]以及多酚化合物的體外抗氧化作用[6]。這些研究僅關(guān)注單類化合物,對(duì)其所含化學(xué)成分的認(rèn)識(shí)不夠全面,無法反映其整體的化學(xué)成分特征。此外,鐵棍山藥皮藥用和營養(yǎng)價(jià)值尚不明確,這也嚴(yán)重阻礙了其再利用。因此,全面、系統(tǒng)識(shí)別鐵棍山藥皮所含的化學(xué)成分,并挖掘其相應(yīng)的分子機(jī)制,對(duì)于鐵棍山藥皮活性功能物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

    超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS/MS)具有速度快、靈敏度高、分辨率高等特點(diǎn)[7],根據(jù)化合物質(zhì)譜信息,結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫,能夠?qū)χ胁菟?、?fù)方制劑、天然產(chǎn)物等中的化學(xué)成分進(jìn)行快速分離和鑒定。生物信息學(xué)是綜合運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息技術(shù)和數(shù)學(xué)理論等技術(shù)方法的交叉學(xué)科[8],能夠從中草藥、復(fù)方制劑、天然產(chǎn)物機(jī)制研究、復(fù)雜疾病治療等生命科學(xué)的海量數(shù)據(jù)中,發(fā)現(xiàn)、挖掘、闡述其中所包含生物學(xué)意義[9]。

    聯(lián)合UPLC-Q/TOF-MS/MS和生物信息學(xué)的方法越來越多地應(yīng)用于多成分多靶點(diǎn)多通路的機(jī)制研究[10-11]。本研究擬采用UPLC-Q/TOF-MS/MS技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)鐵棍山藥皮中的化學(xué)成分進(jìn)行定性識(shí)別,并在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)對(duì)其潛在的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測和功能分析,探討鐵棍山藥皮化合物成分的藥用和營養(yǎng)價(jià)值,為鐵棍山藥皮的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    山藥皮 河南省溫縣鐵棍山藥的山藥皮;甲醇、乙腈 色譜級(jí),美國EMD Millipore公司;甲酸 色譜級(jí),美國Sigma公司。

    Exion 20AD型超高效液相色譜儀、X500R QTOF型高分辨質(zhì)譜儀(SCIEX OS軟件) 美國SCIEX公司;ME204E電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Milli-Q Synthesis 超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;DW-HL398S超低溫冷藏冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 樣品制備 將鐵棍山藥流水清洗干凈,晾干,削皮后即刻將皮置于-80 ℃環(huán)境中過夜冷凍,取出后迅速于冷凍干燥機(jī)內(nèi)-90 ℃真空低溫冷凍干燥,待完全干燥后制成鐵棍山藥皮凍干粉,過8號(hào)篩。稱取1.0 g,加入5 mL甲醇:水=1:1(v/v)超聲提取30 min,在10000 r/min的條件下離心10 min,吸取上清液進(jìn)樣[12]。

    1.2.2 色譜條件 Waters HSS T3色譜柱(100×3.0 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:0.05%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫程序?yàn)椋?~1.0 min,3% B;1.0~10 min,3%~30% B;10~20 min,30%~99% B;20~26 min,99% B;26~26.1 min,99%~3% B;26.1~30 min,3% B。進(jìn)樣盤溫度:15 ℃;流速:0.40 mL/min;柱溫:40 ℃。

    1.2.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電噴霧離子源ESI檢測,在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行樣品采集,開啟動(dòng)態(tài)背景以扣除干擾。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為:氣簾氣流(CUR)25 psi;霧化氣流速(GS1)50 psi;輔助氣流速(GS2)50 psi;離子源電壓(ISVF)5500/-4500 V;離子源溫度(TEM)500 ℃;捕獲電壓(DP)80 V;碰撞電壓(CE)35±15 V。一級(jí)質(zhì)譜m/z掃描范圍設(shè)為50~1300 Da,掃描累計(jì)時(shí)間0.25 s,選擇響應(yīng)最高的碎片進(jìn)行二級(jí)掃描,m/z掃描范圍設(shè)為50~1000 Da,掃描累計(jì)時(shí)間0.1 s。

    1.2.4 化合物鑒定 采用SCIEX OS軟件進(jìn)行質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)的采集和處理,通過質(zhì)量準(zhǔn)確度、同位素豐度、二級(jí)譜庫確認(rèn)及保留時(shí)間等,根據(jù)SCIEX自建天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫SCIEX TCM Library自動(dòng)進(jìn)行峰提取和篩查,進(jìn)一步根據(jù)獲得的質(zhì)譜信息結(jié)合參考文獻(xiàn)、有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]、人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB:https://hmdb.ca/)[14]和植物活性分子數(shù)據(jù)庫(Collective Molecular Activities of Useful Plants:CMAUP)[15]進(jìn)行鐵棍山藥皮中化合物的鑒定識(shí)別。

    1.2.5 活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)將所鑒別的化合物成分進(jìn)行口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和藥物相似度(drug-likeness,DL)的查找。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)篩選標(biāo)準(zhǔn)[16]OB≥20%和DL≥0.1篩選出潛在活性成分。

    1.2.6 鐵棍山藥皮-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的活性成分利用PubChem數(shù)據(jù)庫找到相應(yīng)的SMILES信 息,通 過SwissTargetPrediction數(shù) 據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/),設(shè)定物種“Homo sapiens”進(jìn)行檢索,選擇Probability值大于0的值,獲取其潛在的作用靶標(biāo)[17],利用Cytoscape 3.8.2分析軟件構(gòu)建鐵棍山藥皮-化合物-靶點(diǎn)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

    1.2.7 潛在作用靶點(diǎn)功能富集分析 將1.2.6項(xiàng)下獲得的作用靶點(diǎn),通過R軟件中的ClusterProfiler軟件包進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG通路分析[18],以P<0.05為篩選條件,獲得鐵棍山藥皮中目標(biāo)化合物富集的相關(guān)通路,進(jìn)而分析其藥理和營養(yǎng)作用機(jī)理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基于UPLC-Q/TOF-MS/MS平臺(tái)的鐵棍山藥皮中化學(xué)成分識(shí)別

    采用上述色譜和質(zhì)譜條件對(duì)鐵棍山藥皮提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測,其正、負(fù)離子模式掃描下質(zhì)譜基峰離子流圖如圖1所示。利用SCIEX OS軟件擬合計(jì)算可能的分子式,結(jié)合本地SCIEX TCM Library數(shù)據(jù)庫對(duì)鐵棍山藥皮質(zhì)譜離子流圖匹配出的化合物進(jìn)行前期推測,再根據(jù)參考文獻(xiàn)、CMAUP、PubChem、HMDB等數(shù)據(jù)庫提供的一級(jí)、二級(jí)離子信息等進(jìn)行進(jìn)一步確定,最終鑒別出33種化合物,其中酚酸類9種,黃酮類7種,氨基酸有機(jī)酸類5種,糖類2種及其他類10種,以上成分相關(guān)歸屬及鑒定信息見表1。

    圖1 鐵棍山藥皮提取物在正離子模式和負(fù)離子模式下的基峰離子流圖Fig.1 Base peak intensity chromatograms of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel in positive and negative modes

    表1 鐵棍山藥皮提取物中化學(xué)成分的鑒定Table 1 Identification of chemical composition of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

    2.2 活性成分篩選

    將鐵棍山藥皮中鑒別所獲得的化合物成分,根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)篩選標(biāo)準(zhǔn)OB≥20%和DL≥0.1篩選出潛在活性成分10個(gè),見表2。

    表2 鐵棍山藥皮中通過OB和DL預(yù)測的10個(gè)活性成分Table 2 Ten active ingredients predicted by OB and DL in Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

    2.3 潛在作用靶標(biāo)預(yù)測和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    進(jìn)一步通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的10個(gè)化合物靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,去掉重復(fù)基因名稱,共獲得348個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建出鐵棍山藥皮-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),見圖2。

    圖2 鐵棍山藥皮-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of Dioscorea opposita Thumb peel-compound-target network

    網(wǎng)絡(luò)中連接度值表明此化合物或靶點(diǎn)的重要程度,化合物的連接度分析發(fā)現(xiàn),10個(gè)化合物中芹菜素、金合歡素、甘草素、山藥素I、原花青素B1、腺苷、雙去甲基姜黃素和丁香酸葡萄糖苷這8個(gè)化合物的連接度值均在60以上,其中芹菜素、金合歡素和甘草素的連接度值均大于100(圖3A),上述化合物可能為鐵棍山藥皮中潛在發(fā)揮功效的重要化合物;碳酸酐酶2(CA2)、絲/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1(PIM1)、二肽基肽酶4(DPP4)、環(huán)加氧酶1(PTGS1)、碳酸酐酶9(CA9)、碳酸酐酶1(CA1)、雌激素受體α(ESR1)、環(huán)加氧酶 2(PTGS2)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸1(PTPN1)為連接度排名前10的作用靶點(diǎn)(圖3B),其可能為鐵棍山藥皮作用的主要靶點(diǎn)。

    圖3 網(wǎng)絡(luò)中重要化合物靶點(diǎn)數(shù)和作用的主要靶點(diǎn)Fig.3 Top ten important compounds and primary targets of the network

    續(xù)表 1

    2.4 潛在作用靶點(diǎn)KEGG功能富集分析

    將獲得的潛在作用靶基因通過R軟件中的ClusterProfiler軟件包進(jìn)行KEGG功能富集分析,其中富集程度最高且排名前10條重要代謝通路分別為:PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路(Lipid and atherosclerosis)、癌癥蛋白多糖信號(hào)通路(Proteoglycans in cancer)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、前列腺癌(Prostate cancer)、內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用信號(hào)通路(AGERAGE signaling pathway in diabetic complications)、非小細(xì)胞肺癌通路(Non-small cell lung cancer)和胰腺癌通路(Pancreatic cancer),見圖4。

    圖4 化合物靶點(diǎn)的KEGG通路分析(Top10)Fig.4 KEGG pathway analysis of compound targets (Top10)

    KEGG通路富集分析顯示,鐵棍山藥皮活性成分對(duì)應(yīng)的通路主要集中在細(xì)胞信號(hào)通路、癌癥和代謝類疾病治療等方面。其中,在細(xì)胞信號(hào)通路上,分別有48和34個(gè)基因富集在PI3K-Akt信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路;抗癌癥方面,分別有38、32、25、24和23個(gè)基因富集在癌癥蛋白多糖信號(hào)通路、前列腺癌通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、非小細(xì)胞肺癌通路和胰腺癌通路等通路上面;調(diào)節(jié)代謝系統(tǒng)方面,分別41、25和29個(gè)基因富集在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用信號(hào)通路和內(nèi)分泌抵抗通路。圖5展示了這些KEGG通路與靶基因之間的相互關(guān)系。

    圖5 KEGG通路與靶基因相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.5 KEGG pathway and target gene correlation network

    3 討論與結(jié)論

    針對(duì)鐵棍山藥中化合物成分及其藥理活性的研究較多,相對(duì)而言,鐵棍山藥皮的相關(guān)研究報(bào)道較少[4-6]。本文利用UPLC-Q/TOF-MS/MS平臺(tái),分析并鑒別出了鐵棍山藥皮中的33種化合物,為其成分的識(shí)別和潛在價(jià)值奠定了前期基礎(chǔ);通過生物信息學(xué)分析方法,找出鐵棍山藥皮中發(fā)揮功效的關(guān)鍵化學(xué)成分,其中芹菜素、金合歡素、甘草素、去二甲氧基姜黃素、山藥素I等物質(zhì)具有良好的生物活性。如芹菜素具有抗炎、抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、保護(hù)肝功能、抗動(dòng)脈硬化和腦血栓、降壓和鎮(zhèn)靜抗焦慮等功效[29],金

    合歡素具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[30],甘草素具有良好的抗癌活性和抗腫瘤作用[31],去二甲氧基姜黃素具有抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和抗炎作用[32],山藥素I具有良好的抗炎作用[33],由此可見,鐵棍山藥皮可能通過多成分共同發(fā)揮其藥用和營養(yǎng)價(jià)值。同時(shí),這些功能成分的鑒別對(duì)于鐵棍山藥皮中營養(yǎng)與藥用功能物質(zhì)的開發(fā)和利用也有著重要的參考意義。

    鐵棍山藥皮-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn),鐵棍山藥皮具有多個(gè)作用靶點(diǎn),其中重要潛在靶點(diǎn)包括癌癥腫瘤相關(guān)基因(PIM1)、治療糖尿病代謝相關(guān)基因(GSK3B、PTPN1、DPP4)、雌激素受體(ESR1)、環(huán)加氧酶(PTGS1、PTGS2)和多種碳酸酐酶(CA2、CA9、CA1)等,這些基因與癌癥腫瘤、糖尿病、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長和增殖調(diào)控及代謝等密切相關(guān),體現(xiàn)了鐵棍山藥皮多成分-多靶點(diǎn)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。研究將成分對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析,明確了鐵棍山藥皮成分靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病主要集中在腫瘤癌癥、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、糖尿病及代謝類等相關(guān)途徑,這一發(fā)現(xiàn)也為藥物的進(jìn)一步研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

    本研究采用UPLC-Q/TOF-MS/MS分析技術(shù)進(jìn)行了鐵棍山藥皮中化學(xué)成分的鑒別,通過生物信息學(xué)預(yù)測了潛在活性化合物具有的多種藥理活性,初步明確了鐵棍山藥皮具有的藥用和營養(yǎng)價(jià)值,但鐵棍山藥皮尚需進(jìn)一步深入挖掘和研究。首先,對(duì)鐵棍山藥皮中化合物成分的提取工藝、定性和定量分析研究十分必要;其次,本文通過生物信息學(xué)技術(shù)建立的山藥皮-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中,所涉及的重要化合物和重要靶點(diǎn)需深入研究;最后,鐵棍山藥皮的再利用過程,需要建立規(guī)范化流程,進(jìn)而可以形成產(chǎn)品,有望作為保健品或者中醫(yī)藥產(chǎn)品應(yīng)用于人類疾病的預(yù)防和治療。由此可見,本研究為鐵棍山藥皮資源的有效利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和開發(fā)依據(jù),也為進(jìn)一步延長鐵棍山藥的產(chǎn)業(yè)鏈、提高其附加值提供了理論數(shù)據(jù)。

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