基因工程表達(dá)甜味蛋白的研究進(jìn)展

施天元，曹國強(qiáng)

（黑龍江省金象生化有限責(zé)任公司，黑龍江哈爾濱 150040）

甜味蛋白作為一種由植物提取的蛋白質(zhì)，具有甜度大、熱量低、安全無毒等特點(diǎn)，早在上世紀(jì)就受到了廣泛的關(guān)注[1-2]。甜味蛋白是一類擁有巨大潛力的天然甜味劑，可作為蔗糖替代物，它們熱量低，功能活性好，經(jīng)胃蛋白酶消化可成為必需氨基酸，具有營養(yǎng)價值[3]，但由于最初的植物提取存在原料產(chǎn)地限制、提取成本高等問題，限制了其大規(guī)模的生產(chǎn)和使用[2,4]，利用基因工程異源表達(dá)甜味蛋白引起了科學(xué)家們的興趣。

目前，甜味蛋白的基因工程改造主要應(yīng)用于增強(qiáng)甜味蛋白的穩(wěn)定性、增加甜度、提高產(chǎn)量、降低成本等[5]。但同時，基因工程表達(dá)生產(chǎn)甜味蛋白尚存在較多困難與挑戰(zhàn)。如蛋白翻譯后修飾的提取工藝復(fù)雜，成本高，價格無法與市場上的人工合成甜味劑相競爭。利用細(xì)菌、真菌為原料生產(chǎn)的甜味蛋白很難被大眾接受應(yīng)用于食品等[6]?；蚬こ躺a(chǎn)的甜味蛋白具有傳統(tǒng)植物原料提取生產(chǎn)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，包括更高的產(chǎn)率、更低的理論成本和更有針對性的改造，代糖食品已成為新趨勢[7]，但是甜味蛋白作為已發(fā)現(xiàn)的最甜的物質(zhì)，現(xiàn)仍未被廣泛應(yīng)用。本文首次系統(tǒng)的分析了基因工程在生產(chǎn)甜味蛋白中的優(yōu)勢、應(yīng)用及相關(guān)熱點(diǎn)問題，為未來基因工程改造甜味蛋白提供理論資料。

1 甜味蛋白的種類及理化性質(zhì)

1.1 索馬甜

索馬甜又稱奇異果甜蛋白、沙馬汀，見表1。最初提取自一種來自西非的植物（Thaumatococcus daniellii）。甜度是蔗糖的3000倍。據(jù)報道，索馬甜家族至少存在五種常見的高甜度的索馬甜蛋白成員，包括兩種天然高含量的蛋白產(chǎn)物索馬甜I和索馬甜II，還有三種微量的蛋白產(chǎn)物索馬甜a，索馬甜b和索馬甜c。盡管有些肽環(huán)有差異[8]，但所有的蛋白都具有相同的分子量大小22 kDa，和相同的等電點(diǎn)pH12[9]。索馬甜I和索馬甜II蛋白都含有207個氨基酸，之間存在五個氨基酸位點(diǎn)的差異，分別是N46K、S63R、K67R、R76Q和N113D[10]。索馬甜蛋白含有16個半胱氨酸形成8個二硫鍵[11]。

1.2 莫乃靈

莫乃靈是一種存在于西非植物（Discorephyllum cumminisii）中的甜味蛋白，見表1。甜度較高，是蔗糖的3000倍。天然莫乃靈由94個氨基酸組成，含有一個半胱氨酸，不存在二硫鍵[11]，其分子量為10.7 kDa[4,12]。包含兩個非共價連接的多肽鏈鏈A和鏈B分別包括44個氨基酸和50個氨基酸。單獨(dú)的鏈A和鏈B都不具有甜味，見表1[13]。莫乃靈的二級結(jié)構(gòu)包含一個反向平行的β-折疊和一個17個殘基的α-螺旋[12]。因為莫乃靈A鏈和B鏈通過弱共價鍵鏈接，導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性較低[14]。MNEI是莫乃靈的單鏈衍生物，具有相似的甜度[15]，相比于莫乃靈，具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性[16]。

1.3 馬賓靈

馬賓靈，也叫馬檳榔甜蛋白，是從亞熱帶植物（Capparis masaikai）種子中分離得到的，見表1。馬賓靈的甜度是蔗糖的100倍。馬賓靈是由A鏈和B鏈組成的二聚體，A鏈由33個氨基酸組成，B鏈由72個氨基酸組成。共有四種同分異構(gòu)體，1、3、4型均不能穩(wěn)定存在，只有2型是熱穩(wěn)定的，2型馬賓靈蛋白也是目前有報道的研究最多的馬賓靈蛋白[6,17]，其甜味能在80 °C條件下保持至少2 h[2,4]。馬賓靈的分子量為12.4 kDa[4]。2型馬賓靈前體含有155個氨基酸殘基，包含一個20個氨基酸的信號肽、一個15個氨基酸的N端擴(kuò)展序列、一個14個氨基酸的A鏈和B鏈之間的連接多肽和一個C端的擴(kuò)展氨基酸[18]。馬賓靈在已知的六種甜味植物蛋白中表現(xiàn)出最顯著的熱穩(wěn)定性和耐酸性[19]。

1.4 布拉齊因

布拉齊因，也叫布那珍甜蛋白，存在于一種西非常綠灌木（Pentadiplandra brazzeana）的紅漿果中[20]，見表1。布拉齊因具有很高的溶解性，在pH大幅度變化和高溫情況下都很穩(wěn)定[21]。布拉齊因比2%的蔗糖溶液甜2000倍，比10%的蔗糖溶液甜500倍。它的味道更像蔗糖而不是索馬甜[22]。它的甜度在80 ℃ 4.5 h條件下也不會被破壞[23]。布拉齊因由54個氨基酸組成，分子量為6473 Da[24]。果實中還存在一種微量的布拉齊因蛋白，由53個氨基酸殘基組成，甜度是主要成分的兩倍[22]。結(jié)構(gòu)區(qū)別為主要存在形式在氨基末端有焦谷氨酸，而微量形式在氨基末端缺少焦谷氨酸[25]。布拉齊因的二級結(jié)構(gòu)包含一個α-螺旋（殘基21～29）和三個反向平行的β-折疊（鏈I，殘基5～7；基鏈II，殘基44～50；鏈III，殘基34～39）。四個二硫鍵相互交聯(lián)成次級結(jié)構(gòu)[26]。潘塔亭（pentadin）也是一種甜味蛋白[27]，但有人認(rèn)為它只是布拉齊因的二聚體形式[22,27]潘塔亭由54個氨基酸組成，甜度為蔗糖的500倍。潘塔亭的甜味很容易喪失[2]。

表1 不同甜味蛋白特性對比Table 1 Comparison characteristics of different sweet proteins

1.5 庫克靈

庫克靈，也叫仙茅甜蛋白，存在于馬來西亞的一種植物（Curculingo latifolia）中，見表一[28]。甜度是蔗糖的550倍。其分子量24.9 kDa，由114個氨基酸組成。庫克靈是一種由兩個基礎(chǔ)亞基組成的同源二聚體[10]。庫克靈不穩(wěn)定，在50 ℃及以上溫度活性降低[2]。庫克靈也是一種矯味蛋白，能夠使酸味物質(zhì)變甜[7]。甜味在口腔內(nèi)可維持幾分鐘；甜味在口腔內(nèi)消失后若喝水，又會恢復(fù)，并可維持5 min左右[27]。Neoculin與庫克靈具有相似的甜度，甜度大約是蔗糖的500倍[29]。與庫克靈的區(qū)別是Neoculin是一種由一個酸性亞基（NAS）和一個基礎(chǔ)亞基（NBS）組成的異源二聚體。

1.6 神秘果素

神秘果素，也叫奇果蛋白，存在于一種熱帶西非灌木（Synepalum dulcificum）的果實中，見表1。神秘果素本身不具有甜味，但可以使酸味或苦味物質(zhì)嘗起來具有甜味[30]，包括鹽酸、草酸、乳酸、甲酸、醋酸、檸檬酸等。增甜效果取決于酸的酸度和pH[31]。濃度為4×10-7mol/L時神秘果素即能被感知，其甜度相當(dāng)于0.4 mol/L的蔗糖溶液[32]。在1988年，Theerasilp和Kurihara成功地分離出純化的神秘果素甜味蛋白，并測定其分子量為28 kDa。神秘果素是一個具有191個氨基酸的單鏈多肽，具有兩個通過二硫鍵交聯(lián)的糖基化位點(diǎn)，N42和N186[30]。

2 利用基因工程生產(chǎn)甜味蛋白的優(yōu)勢

2.1 甜度方面

利用玉米表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)甜味蛋白布拉齊因，表達(dá)量高，純化出的玉米布拉齊因蛋白甜度高達(dá)蔗糖的1200倍[33]。而另一方面，天然索馬甜引起甜味味覺感受的濃度為50 nmol/L[2,34]。通過基因工程改造，最甜的索馬甜突變體D21N，31 nmol/L濃度就能引起味覺[34]。MNEI兩個雙突變體E50N/Y65R和E2N/E50N均表現(xiàn)出比單突變體E50N更高的甜度[35]。用大腸桿菌表達(dá)的Neoculin不僅能誘發(fā)甜味反應(yīng)，而且能在水或檸檬酸存在情況下進(jìn)行矯味[29]。

2.2 蛋白活性方面

神秘果素在室溫收獲后的2～3 h內(nèi)，風(fēng)味活性就會喪失[36]。因此，神秘果素的天然來源是有限的。人們利用外源的大腸桿菌、酵母菌、米曲霉和植物等宿主，一直在嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)生產(chǎn)神秘果素，利用轉(zhuǎn)基因生菜，成功表達(dá)了具有甜味活性的重組神秘果素蛋白，以生菜為宿主表達(dá)神秘果素蛋白不僅解決了神秘果素易喪失風(fēng)味的問題，而且由于其食品來源消除了人們對其安全性的擔(dān)心[37]。利用帶有KEX2剪切位點(diǎn)的α-淀粉酶分別與兩個蛋白亞基融合，可成功獲得與天然Neoculin具有同樣活性的重組Neoculin[27]。布拉齊因需要四個二硫鍵才能激活產(chǎn)生強(qiáng)烈的甜味，而利用畢赤酵母獲得的布拉齊因的不僅具有活性且在產(chǎn)量方面具有優(yōu)勢[21]。

2.3 蛋白表達(dá)量與轉(zhuǎn)化率方面

酵母，主要為畢赤酵母（Pichia pastoris）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在產(chǎn)量方面由于其為真核微生物，在合成和分泌方式上具有優(yōu)勢。索馬甜用合成DNA在釀酒酵母中生產(chǎn)，表達(dá)水平可達(dá)140 mg/L。畢赤酵母生產(chǎn)索馬甜產(chǎn)量也可達(dá)到70 mg/L[18]。在畢赤酵母中共表達(dá)索馬甜與分子伴侶使產(chǎn)量至少提高了兩倍[38]。另外，乳酸乳球菌也可用于表達(dá)索馬甜[2]。莫乃靈可以除了可用畢赤酵母和釀酒酵母表達(dá)外，還可以用產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）表達(dá)[39]。利用產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)的莫乃靈產(chǎn)量甚至可以超過天然提取的莫乃靈[6]。索馬甜在米曲霉（Aspergillus oryzae）、婁地青霉（Penicillium.roquefortii）、黑曲霉變種（Aspergillus. nigervar.awamori）中均能成功表達(dá)[40-41]。在酸性蛋白酶缺陷的黑曲霉變種中，gdhA啟動子誘導(dǎo)和適宜的N源C源條件下，索馬甜的產(chǎn)量可達(dá)105 mg/L[40]。同樣的宿主中過表達(dá)pdiA基因，產(chǎn)量可達(dá)150 mg/L[41]。

在番茄植株中表達(dá)并純化出了與天然蛋白甜味相同的索馬甜II，重組的索馬甜II與天然索馬甜II的口感特征沒有明顯區(qū)別且具有加工生產(chǎn)發(fā)面的優(yōu)勢[42]。轉(zhuǎn)基因的番茄也是最適合生產(chǎn)重組神秘果素的宿主，以幼苗子葉為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方案中，番茄轉(zhuǎn)化效率超過40%[43]。

目前，評價因素定量化篩選常用的方法有：層次分析法、信息熵法、主成分分析法、聚類分析法、灰色關(guān)聯(lián)分析法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法、粗糙集屬性約簡法。充分考慮核電廠主控室龐大的系統(tǒng)環(huán)境，采用層次分析法。目前層次分析法主要采用領(lǐng)域?qū)＜乙庖?，主觀賦值通常需要有一定的先驗知識，評判結(jié)果具有主觀隨意性，且核電廠交互界面的設(shè)計需要考慮到界面設(shè)計師以及核電專家兩方面人士的意見，評判側(cè)重點(diǎn)容易產(chǎn)生分歧且存在主觀性，故本文采用基于粗糙集理論的層次分析法，自動獲取評價因子。

3 基因工程表達(dá)生產(chǎn)甜味蛋白遇到的困難及解決辦法

3.1 甜味缺失

甜味蛋白最重要的是甜味。但1982年，Luppo等[10]第一次在大腸桿菌中表達(dá)出的索馬甜蛋白是沒有甜味的。究其原因，主要是由于蛋白質(zhì)折疊不當(dāng)或缺乏必要的翻譯后的修飾，因而不能引起甜味反應(yīng)[6,44]。人們利用外源的大腸桿菌、酵母菌、米曲霉和植物等宿主，一直在嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)生產(chǎn)神秘果素。但異源生產(chǎn)的神秘果素有的喪失了甜味，有的甜味活性很低[18,37,45]。用大腸桿菌表達(dá)的庫克靈（NBS-NBS）或庫克靈2（NAS-NAS）兩種同源二聚體都不具有甜味，也沒有矯味作用。2000年在前人基礎(chǔ)上，通過氧化還原性谷胱甘肽系統(tǒng)對重組蛋白進(jìn)行復(fù)性處理，生產(chǎn)出了具有與天然索馬甜相似甜味的甜味蛋白索馬甜[46-47]。利用轉(zhuǎn)基因植物作為宿主可實現(xiàn)具有甜味活性的神秘果素的生產(chǎn)[30]。MNEI是一種高效的飲料甜味劑，但在半固態(tài)食品中使用可能會降低它的甜味，已證實對其進(jìn)行點(diǎn)突變可以解決這類問題[34,48]。

3.2 成本高

植物提取甜味蛋白由于原料限制存在成本高的問題，限制了其大規(guī)模的應(yīng)用[3,19]。2020年，Park等[49]以胡蘿卜（Daucus carotaL.）愈傷組織為材料，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)SWPA2啟動子驅(qū)動各種應(yīng)激處理下神秘果素基因的表達(dá)，采用氣升式生物反應(yīng)器進(jìn)行了重組神秘果素的大規(guī)模生產(chǎn)研究，為將來利用轉(zhuǎn)基因胡蘿卜愈傷組織量產(chǎn)神秘果素打下基礎(chǔ)。此外，利用CaMV35S啟動子過表達(dá)編碼甜味蛋白基因的轉(zhuǎn)基因土豆、生菜、黃瓜、草莓等也獲得了成功[18]。部分重組甜味蛋白如莫乃靈仍處于研究階段，也存在生產(chǎn)成本高，在產(chǎn)量和價格上與市場上的人工合成甜味劑相比具有較大差距的問題[1]。利用生物技術(shù)生產(chǎn)植物甜味蛋白和矯味蛋白必須達(dá)到一定的單產(chǎn)水平才能與天然產(chǎn)品競爭[6]。原核宿主相比植物表達(dá)具有操作流程簡單、生長周期短等優(yōu)點(diǎn)，但是原核宿主表達(dá)也存在純化過程繁瑣，純化工藝復(fù)雜，純化成本高的問題，而且部分甜味蛋白無法正確折疊，產(chǎn)生甜味[49]。于是人們開展了轉(zhuǎn)基因植物組織和真菌表達(dá)平臺生產(chǎn)甜味蛋白的研究。開發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)流程簡化了純化過程，提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)量，節(jié)約了成本。利用煙草毛狀根培養(yǎng)物成功表達(dá)并分泌了甜味蛋白索馬甜I[50]。

3.3 穩(wěn)定性差

莫乃靈A鏈和B鏈通過弱共價鍵鏈接，熱穩(wěn)定性較低[14]?；蚬こ烫岣卟糠痔鹞兜鞍兹缒遂`的熱穩(wěn)定性也是需要解決的問題[1]。MNEI與莫乃靈具有相似的甜度[51]，克隆相對簡單，可導(dǎo)入許多宿主微生物中生產(chǎn)應(yīng)用于食品飲料工業(yè)[14]。也可以利用轉(zhuǎn)基因植物，固相多肽合成等方式生產(chǎn)[18]。相比于莫乃靈，MNEI具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，因此也有著更廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)階段主要用MNEI替代莫乃靈，同時MNEI也被認(rèn)為是最有前途的甜味蛋白之一[18]。

3.4 安全性

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)出的重組蛋白的安全性需經(jīng)過嚴(yán)格的生物學(xué)活性檢驗[52]。前期人們在大腸桿菌和酵母中表達(dá)了重組甜味蛋白，雖然也進(jìn)行了小鼠的毒理學(xué)驗證，但是并未得到所有人的認(rèn)可，相當(dāng)一部分人還是不能接受尤其是在大腸桿菌中表達(dá)的甜味蛋白應(yīng)用于食品[6,53-54]。為甜味蛋白尋找更多被認(rèn)可的安全表達(dá)宿主也是甜味蛋白開發(fā)面臨的重要問題之一。還有，利用重組技術(shù)生產(chǎn)的植物甜味蛋白或矯味蛋白必須獲得權(quán)威性食品安全檢驗機(jī)構(gòu)的認(rèn)證，例如美國的FDA和歐盟的食品安全審查機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。食品安全認(rèn)證也是生產(chǎn)食品級甜味蛋白需要攻克的關(guān)鍵問題[6]。由于乳酸乳球菌（Lactococcus.lactis）屬于常見的腸道定殖菌，幾百年來一直被奶酪制造工業(yè)使用，因此用它生產(chǎn)的MNEI被大多數(shù)人認(rèn)為是安全的可食用甜味蛋白[54]。目前，索馬甜和莫乃靈已通過毒理學(xué)試驗和安全試驗，經(jīng)相關(guān)批準(zhǔn)用于食物和飼料的增甜劑或調(diào)味劑[52,54]。

3.5 大規(guī)模生產(chǎn)受限

盡管在一些生物體中成功地表達(dá)了重組索馬甜蛋白，但一直缺少大規(guī)模的生物生產(chǎn)設(shè)施存在。植物的價格，生長周期，種植密度在大規(guī)模生產(chǎn)中均需要考慮。此外，由于氣象因素，產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量方面可能存在大量的批內(nèi)差異，這也是使用田間種植的植物材料進(jìn)行這一應(yīng)用所關(guān)注的問題之一。這些變化反過來會導(dǎo)致關(guān)鍵設(shè)施性能參數(shù)的不一致。2021年Kelada等[55]提出了初步的工藝設(shè)計，工藝模擬和經(jīng)濟(jì)分析，將利用多種農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)重組索馬甜蛋白。未來預(yù)計將采用分子手段每年量產(chǎn)50公噸索馬甜II。

另外，酵母是最具工業(yè)意義的真核微生物，由于其可用性，主要應(yīng)用于生物生產(chǎn)，其具有良好的遺傳和生理背景，遺傳操作簡單，生長迅速，具有翻譯后修飾和細(xì)胞外分泌的能力。這樣的平臺使其成為表達(dá)甜味蛋白的理想系統(tǒng)。因此，利用微生物如絲狀真菌、酵母等對酶的高水平分泌和重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)有一定的好處[2]。

4 基因工程生產(chǎn)甜味蛋白技術(shù)的應(yīng)用

4.1 索馬甜的生產(chǎn)應(yīng)用

4.2 莫乃靈的生產(chǎn)應(yīng)用

莫乃靈也是美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的“公認(rèn)安全的”（GRAS）食品添加劑[7]。莫乃靈由于高溫不耐受和pH條件的限制[12]，其研究一直處于瓶頸狀態(tài)。對其進(jìn)行基因工程改造可提高其穩(wěn)定性和表達(dá)水平，降低其生產(chǎn)成本[57]，改良口感，提高產(chǎn)量[47,58]。最初利用基因工程表達(dá)的重組莫乃靈蛋白需要生長在含有甲醇的培養(yǎng)基上[59]。在2016年，分子生物學(xué)研究表明莫乃靈的N端序列決定了其在酵母菌株中表達(dá)的蛋白甜度，成功在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)了不需要甲醇誘導(dǎo)的莫乃靈蛋白，此項研究表明莫乃靈的量產(chǎn)不再是遙不可及[59]。Jia等[60]通過有效調(diào)控甲醇代謝模式和提高能量利用效率，提高了畢赤酵母中低細(xì)胞濃度條件誘導(dǎo)的莫乃靈產(chǎn)量。應(yīng)用Trp啟動子或T7 lac啟動子在大腸桿菌中表達(dá)莫乃靈或MNEI蛋白，表達(dá)水平高達(dá)45%[10,14]。2015年，用乙酸作為碳源工業(yè)化生產(chǎn)MNEI在理論上已完全具備條件，并且產(chǎn)量可達(dá)177 mg/L[61]。2018年，該實驗室又通過生產(chǎn)乳制品廢液中的乳糖為底物，開發(fā)了一種工藝簡單，適合工業(yè)規(guī)模應(yīng)用，并且生長參數(shù)易于控制的MNEI生產(chǎn)流程[54]。除此之外，煙草葉綠體也可以作為穩(wěn)定的植物表達(dá)平臺來生產(chǎn)三種MNEI蛋白突變體，它們具有更好的口感、更高的穩(wěn)定性和產(chǎn)量[58]。

4.3 其他甜味蛋白的生產(chǎn)應(yīng)用

不僅僅是索馬甜與莫乃靈，其他甜味蛋白通過基因工程的改造工作也已經(jīng)在不斷推進(jìn)。2004年Lamphear等[33]在玉米宿主中表達(dá)了布拉齊因蛋白，因含布拉齊因的玉米胚芽粉可直接應(yīng)用于食品，使這種高甜度的甜味蛋白未來在食品工業(yè)中的作用得到看好，并且使用可食用植物作為宿主的優(yōu)勢在于可以降低純化成本[32]。美國的BioResources International公司也利用傳統(tǒng)的栽培技術(shù)種植R.dulifera，并利用重組宿主表達(dá)生產(chǎn)神秘果素。作為合作研究，日本的Asahi DenkaKogyo公司和日本物理學(xué)和化學(xué)研究所正在將庫克靈表達(dá)于轉(zhuǎn)基因植物和大腸桿菌。而布拉奇因作為甜度最大的甜味蛋白，也擁有著極大的潛力，近年來被廣泛研究。通過基因工程改造后的布拉奇因甜度比野生型提高近50%[5]。乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的布拉奇因產(chǎn)量可達(dá)107 mg/L[62]。經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵工藝、凈化程序后的布拉奇因可以用作食品、醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域的甜味添加劑[23]，在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 結(jié)語與展望

目前關(guān)于甜味蛋白的研究主要集中在甜味活性的保持，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)量，生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等方面。研究人員希望能夠找到一種認(rèn)可度高、高甜度、價格便宜、甜味特性好、性質(zhì)穩(wěn)定的甜味蛋白。利用可食用的植物組織生產(chǎn)甜味蛋白在安全性上具有一定優(yōu)勢，易于被大眾接受。利用微生物生產(chǎn)的甜味蛋白具有價格上的優(yōu)勢。而無論是利用植物組織生產(chǎn)還是微生物生產(chǎn)，應(yīng)用基因工程改造都能令其具有更高的甜度和更好的穩(wěn)定性。

2016年，重組蛋白市場全球價值3.472億美元。根據(jù)2018年consistent Market Insights公司提供的信息，2017～2025年全球重組蛋白市場復(fù)合年增長率預(yù)計為6.2%[2]。甜味蛋白具有甜度高，熱量低，安全，且不會把非天然的代謝產(chǎn)物引入體內(nèi)的優(yōu)點(diǎn)。隨著人們健康意識的增強(qiáng)，甜味蛋白未來將長期向好。我國目前減糖市場還屬于起步探索階段，作為功能糖和高倍甜味劑原料的主產(chǎn)國，國內(nèi)企業(yè)發(fā)展減糖類產(chǎn)品具有較大的原料優(yōu)勢。制糖企業(yè)可參考國際減糖產(chǎn)品發(fā)展趨勢及甜味劑的應(yīng)用情況提前布局減糖市場[7]。隨著部分甜味蛋白被發(fā)達(dá)國家批準(zhǔn)應(yīng)用，未來甜味蛋白的國際需求將持續(xù)增大，關(guān)于甜味蛋白的研究也將越來越多。

甜味蛋白的研究方向一直集中在降低成本、提高轉(zhuǎn)化率、提高穩(wěn)定性、擴(kuò)大高活性甜味蛋白的生產(chǎn)規(guī)模上。未來，繼續(xù)提高甜度，降低生產(chǎn)成本將是主流方向。此外，為克服原材料的季節(jié)性，通過基因工程手段對植物甜味蛋白基因進(jìn)行克隆，再導(dǎo)入微生物細(xì)胞表達(dá)，最后利用工業(yè)發(fā)酵法來大規(guī)模生產(chǎn)或?qū)⒊蔀槲磥砩a(chǎn)甜味蛋白的主流模式；另外，純化方式的優(yōu)化也是一大難點(diǎn)。在應(yīng)用方面，未來也將使用多種甜味劑復(fù)合產(chǎn)品改良食品口感。同時，隨著科技的進(jìn)步，甜味蛋白的研究也將向更為微觀，更為精細(xì)發(fā)展，現(xiàn)已開展對甜味蛋白活性位點(diǎn)的研究，也就是說，生物工程技術(shù)和計算機(jī)技術(shù)設(shè)計相結(jié)合改良甜味蛋白也將成為趨勢。