豬源發(fā)酵乳桿菌的篩選及其潛在益生性能

張艷彬，王素峰，張健玲，劉書欣，鄧俊勁，王志林，陳 莊

（1.喀什大學生命與地理科學學院，新疆 喀什 844000；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.江門海關技術中心，廣東 江門 529085）

【研究意義】抗生素濫用導致的耐藥性、人類健康和環(huán)境危害問題已經(jīng)嚴重影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展。隨著過去10 年中禁抗替抗力度的加大，作為一種安全有效的抗生素替代品，乳酸菌添加劑已經(jīng)得到了越來越多的關注［1-3］。乳酸菌是動物腸道中最重要的細菌群之一，具有各種優(yōu)異的益生性能，可以產(chǎn)生多種抑菌物質抑制病原菌生長定植，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮著越來越重要的作用。大多數(shù)乳酸菌被歸類為“普遍公認安全”的微生物，因為它們是非致病性的［4］。但益生菌的特性和特征具有菌株特異性［5］，不同乳酸菌的性能差異很大，而且目前適合在各種不同動物體內(nèi)環(huán)境下發(fā)揮作用的乳酸菌資源仍然不多，因此需要進行更多的研究來篩選新型乳酸菌菌株和揭示其益生特性和潛力。【前人研究進展】乳酸菌可以促進動物健康發(fā)育、提高畜禽生長性能，預防疾病和提高動物免疫力［6］，其作用機制包括維持腸道菌群生態(tài)平衡、抑制病原菌生長、形成生物屏障阻止病原菌定植、增加營養(yǎng)物質利用率、改善乳糖耐受性［7］、改善消化［8］和刺激免疫系統(tǒng)［9］等。夏億［10］研究發(fā)現(xiàn)，在雞日糧中添加發(fā)酵乳桿菌和凝結芽孢桿菌可以顯著增強雞腸道屏障作用和調(diào)控免疫相關基因表達，促進后腸乳酸菌增殖，減輕腸道損傷。Shin 等［11］發(fā)現(xiàn)給斷奶仔豬飼喂乳酸菌顯著增加了腸道微生物群落多樣性，并減弱了腸道炎癥的發(fā)生，促進斷奶仔豬腸道發(fā)育。乳酸菌作為益生菌添加到動物日糧中可有效抑制病原菌生長，促進動物腸道生長發(fā)育，這是乳酸菌益生功能的重要部分。此外，部分乳酸菌分泌的抗菌物質也在動物的健康生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。最新報道表明，乳酸菌的無細胞上清液可以替代抗生素抑制動物體內(nèi)的沙門氏菌，具有作為飼料添加劑替抗產(chǎn)品的潛力，可以最大限度減少與抗生素耐藥性相關問題［12］。還有研究表明，乳酸菌分泌的細菌素、有機酸和胞外多糖等物質是乳酸菌發(fā)揮作用的重要載體［8］。目前對于乳酸菌產(chǎn)生抗菌物質的研究較多，也是乳酸菌益生功能研究的熱點之一?！颈狙芯壳腥朦c】發(fā)酵乳桿菌具有典型的耐酸、耐膽鹽、粘附能力強等益生功能，其于2009、2013 年分別被歐洲食品安全局、美國食品和藥品管理局認定為是安全的。但目前發(fā)酵乳桿菌大多從乳制品［13］、酸菜［14］中篩選，而從動物腸道中篩選較少，應用于畜禽養(yǎng)殖中的發(fā)酵乳桿菌菌株仍然不多。來源于畜禽動物的益生菌更有利于其在腸道環(huán)境中發(fā)揮最大的功效，更適合在畜禽動物養(yǎng)殖業(yè)中使用。【擬解決的關鍵問題】本研究以從豬糞便中篩選出的106 株菌為材料，根據(jù)其在酸性MRS 肉湯和膽鹽MRS 肉湯中的生長情況，選取1 株乳桿菌進行深入的耐酸、耐膽鹽以及粘附能力、抑菌能力研究，并探究其抑菌作用的機理，以期為其應用于畜禽動物飼料添加劑提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與細胞 大腸桿菌K88（O149: K91,K88ac）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，金黃色葡萄球菌（CAU0225）由華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院贈予，豬野生型鏈球菌D 型和2 型由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所贈予，仔豬小腸上皮細胞系由美國德州農(nóng)工大學伍國耀教授惠贈，無乳鏈球菌GDMCC 1.408 和惡臭假單胞GDMCC 554 購自廣東省微生物保藏中心，大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌ATCC14028、副溶血弧菌V4、創(chuàng)傷弧菌1676-80、霍亂弧菌CH-GX-YL-ZY-R-2021、嗜水氣單胞菌CH-GX-GL-GLS5-R-1-2021 均為本實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 Rogosa SL 培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、酸性MRS 肉湯培養(yǎng)基（以1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)MRS 肉湯培養(yǎng)基的pH 至2.5）、LB 培養(yǎng)基、鏈球菌培養(yǎng)基、細胞完全培養(yǎng)液（DMEM），均為本實驗室配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 糞便樣品采集 2019 年3 月在廣東省農(nóng)業(yè)科學院白云實驗基地選取5 頭35 日齡三元雜（杜洛克×長白×大洛克）健康斷奶仔豬，用無菌棉簽分別從豬肛門處快速獲取約1 g 糞便裝于無菌采樣袋中，迅速冷凍保存。

1.2.2 乳酸菌篩選與純化 用滅菌的PBS 沖洗帶有糞便的無菌棉簽，沖洗液漩渦震蕩40 s，梯度稀釋至10-6，吸取200 μL 稀釋后的樣品涂布Rogosa SL 固體培養(yǎng)基，以燭缸法進行厭氧培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取長出的單菌落進行繼續(xù)劃線純化，純化進行兩代，取第2 代純化后的菌落進行革蘭氏染色。

1.2.3 菌株鑒定 菌株（第2 代純化后的菌株）采用16S rDNA 序列測序鑒定，委托北京三博遠志生物技術有限責任公司進行。測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對。

1.2.4 耐酸性能力測定 將菌株培養(yǎng)24 h 后的菌液按4%的接種量（V/V）接種到酸性MRS 肉湯培養(yǎng)基（pH 2.5），3 次重復，于80 r/min、37 ℃培養(yǎng)。接種后0、3、6 h 分別收集1 mL 菌液，以10 倍梯度稀釋，取10-4、10-5的稀釋菌液各0.1 mL 涂布MRS 平板，37 ℃培養(yǎng)48 h 后計數(shù)菌落數(shù)，計算平均存活率。

S（%）=Nn/N0

式中，S為經(jīng)過處理后的乳桿菌存活率，N0為處理0 h 時每毫升活菌數(shù)，Nn為處理nh 后每毫升活菌數(shù)。

1.2.5 耐膽鹽能力測定 將菌株培養(yǎng)24 h 后的菌液按4%的接種量（V/V）接種到質量分數(shù)0.3%膽鹽MRS 肉湯培養(yǎng)基，于80 r/min、37 ℃培養(yǎng)，3 次重復。按耐酸能力測試的方法進行平板菌落計數(shù)，計算乳酸菌的平均存活率。

1.2.6 粘附能力測定 在6 孔板培養(yǎng)豬小腸上皮細胞貼壁鋪滿后，棄去培養(yǎng)基，以無菌PBS 洗滌1 次。然后分別將含有1×108CFU/mL 待測菌的DMEM 加入孔中，加入2 mL DMEM 培養(yǎng)基，輕輕搖勻。37 ℃培養(yǎng)2 h 后棄去培養(yǎng)基，用滅菌PBS 洗滌3 次后，用細胞刮刀收集細胞并轉移到EP 管中，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入1 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基，震蕩混勻。以10 倍梯度稀釋進行平板菌落計數(shù)并計算粘附率，每個稀釋度涂3 個平板，每個試驗重復3 次，同時設同體積的未接種菌液為陰性對照一、同體積未接種細胞的菌液為陰性對照二。

AR（%）=N1/N2×100

式中，AR為粘附率，N1為粘附后的活菌數(shù)（CFU/mL），N2為粘附前的活菌數(shù)（CFU/mL）。

1.2.7 抑菌能力測定 將MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵液離心，上清以0.22 μm 濾膜過濾除菌，得到無菌發(fā)酵液。抑菌圈實驗選取大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌D 型和2 型為指示菌，將18 mL 相應培養(yǎng)基與200 μL 指示菌菌液混勻后傾注到無菌培養(yǎng)皿中，待其凝固后，放入7.8 mm 牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基表面接觸無空隙。在杯中加入無菌發(fā)酵液200 μL，設3 個平行，于37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察結果，測定抑菌圈大小，每個試驗重復3 次，設同體積的未接種上清液為陰性對照。

將無菌發(fā)酵液用MRS 培養(yǎng)基分別稀釋2 倍、4 倍、20 倍、100 倍，在96 孔深孔板的1～6 孔中各加入900 μL 菌液濃度為105CFU/mL 的大腸桿菌K88，在1～6 孔依次加入100 μL 不同濃度的無菌發(fā)酵液，濃度依次為10%、5%、2.5%、0.5%、0.1%、0%，每個濃度做3 個平行，置于37 ℃、120 r/min 培養(yǎng)10 h 后，用分光光度計在600 nm 處測定吸光值并計算抑制率。依次分別測定無菌發(fā)酵液對大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌25923、沙門氏菌ATCC14028、副溶血弧菌V4、創(chuàng)傷弧菌1676-80、霍亂弧菌CHGX-YL-ZY-R-2021、嗜水氣單胞菌CH-GXGL-GLS5-R-1-2021、豬鏈球菌D 型、豬鏈球菌2 型、無乳鏈球菌GDMCC 1.408、惡臭假單胞菌GDMCC 554 的抑制能力。

試驗數(shù)據(jù)以SPSS22.0 進行單因素方差分析與顯著性 檢驗。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

本試驗從豬糞中分離出的106 株乳酸菌的在Rogosa SL 培養(yǎng)基上的形態(tài)基本一致，均為圓形、乳白色、表面凸起、直徑0.5～2.0 mm。經(jīng)革蘭氏染色確定86 株為陽性細菌，呈桿狀、多排列成長短不一的鏈狀。簡單觀察在酸性MRS 肉湯和膽鹽MRS 肉湯培養(yǎng)基中的生長情況，選擇其中1 株進行深入研究，該菌株的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結果如圖1 所示。16S r DNA 序列測序結果（圖2）顯示，該菌株屬于發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum），命名為LF1，該菌的細菌形態(tài)和革蘭氏染色結果如圖1 所示，為直桿狀革蘭氏陽性細菌，無鞭毛，不產(chǎn)芽孢。

圖1 發(fā)酵乳桿菌LF1 的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色結果（B）Fig.1 Colony morphology (A) and Gram staining (B)of Lactobacillus fermentum LF1

圖2 以發(fā)酵乳桿菌LF1 16S rDNA 基因序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Lactobacillus fermentum LF1 by 16S rDNA gene sequence

2.2 發(fā)酵乳桿菌耐酸能力

從圖3 可以看出，發(fā)酵乳桿菌LF1 在pH 2.5下處理3 h 后存活率達63.64%，處理6 h 后存活率下降到36.61%，表明發(fā)酵乳桿菌LF1 對強酸的耐受能力較強。

圖3 發(fā)酵乳桿菌LF1 在pH2.5 不同處理時間的存活率Fig.3 Survival rate of Lactobacillus fermentum LF1 exposed to pH2.5 treatment at different times

2.3 發(fā)酵乳桿菌耐膽鹽能力

從圖4 可以看出，發(fā)酵乳桿菌LF1 在0.3%膽鹽的條件下處理3 h 后存活率達87.25%，處理6 h 后存活率略微下降到80.16%，表明發(fā)酵乳桿菌LF1 具有很強的耐膽鹽能力。

圖4 發(fā)酵乳桿菌LF1 經(jīng)0.3%膽鹽不同處理時間的存活 率Fig.4 Survival rate of Lactobacillus fermentum LF1 treated with 0.3% bile salt at different times

2.4 發(fā)酵乳桿菌粘附能力

試驗結果顯示，發(fā)酵乳桿菌LF1 對豬小腸上皮細胞具有一定的粘附性能，但粘附率僅為0.18%，表明菌株LF1 對腸道上皮細胞的粘附能力并不強。

2.5 發(fā)酵乳桿菌抑菌能力

從圖5 可以看出，發(fā)酵乳桿菌LF1 具有較強的抑制病原菌生長的能力，其中對豬鏈球菌D 型生長的抑制最強、抑菌圈直徑達17.56 mm，其次是豬鏈球菌2 型、抑菌圈直徑為14.12 mm；對大腸桿菌K88 和金黃色葡萄球菌也有很好的抑制作用，抑菌圈直徑分別為11.20 mm 和9.87 mm。表明發(fā)酵乳桿菌LF1 對常見的豬病原微生物具有良好的生物拮抗作用。

圖5 發(fā)酵乳桿菌LF1 發(fā)酵液對4 種病原菌的抑制效果Fig.5 Antagonistic effects of Lactobacillus fermentum LF1 fermentation broth against four pathogens

通過抑菌圈發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌LF1 發(fā)酵液對豬的常見病原菌具有較好的抑菌能力，因此進一步就發(fā)酵液對更多病原菌的抑制特性進行研究。由圖6 可知，隨著發(fā)酵乳桿菌LF1 上清液濃度的增加，抑制率逐漸上升，當上清液濃度為10%時，對大部分的菌都有較強的抑制作用，抑制率接近100%；發(fā)酵乳桿菌LF1 上清液對革蘭氏陰性菌和陽性菌的抑制效果無顯著差異，其中對沙門氏菌ATCC14028 和嗜水氣單胞菌CH-GX-GLGLS5-R-1-2021 的抑制效果最強，其半數(shù)抑制濃度IC50均為0.051。表明發(fā)酵乳桿菌LF1 發(fā)酵液中含有的某些物質對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有很強的拮抗作用。

圖6 發(fā)酵乳桿菌LF1 發(fā)酵液對革蘭氏陰性菌(A)和革蘭氏陽性菌(B)的抑制曲線Fig.6 Inhibition curves of Lactobacillus fermentum LF1 fermentation broth against gram-negative bacteria (A) and gram-positive bacteria (B)

3 討論

乳酸菌是仔豬消化道中的重要益生菌，在健康個體中是優(yōu)勢種群。目前已有較多研究從豬腸道中分離得到乳酸菌，而本研究從仔豬腸道中分離出發(fā)酵乳桿菌LF1 菌株。發(fā)酵乳桿菌廣泛存在于動物腸道和植物中，Barrow 等［15］發(fā)現(xiàn)無論在斷奶仔豬或不斷奶仔豬的腸道中，發(fā)酵乳桿菌都是腸道乳酸菌種群中關鍵且典型的物種。Mach等［16］對仔豬和母豬的腸道微生物進行分析，也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌是機體內(nèi)重要的乳酸菌，而且可能通過母乳或糞便從母豬垂直傳播到仔豬腸道。

耐酸、耐膽鹽與粘附能力是乳酸菌發(fā)揮益生功效的關鍵特性，乳酸菌必須具有較強的耐酸、耐膽鹽和粘附能力才能順利通過胃中的酸性環(huán)境與小腸中的高膽鹽環(huán)境而到達特定部位定植并發(fā)揮其益生功能。從耐酸、耐膽鹽和粘附能力的試驗結果可以看出，從仔豬腸道分離出的發(fā)酵乳桿菌LF1 具有較好的耐酸和耐膽鹽的性能，能很好地適應腸道環(huán)境，這與韓瑨等［17］的試驗結果類似。

對致病菌的抑制作用也是益生菌的一個重要特征，乳酸菌可以產(chǎn)生大量的有機酸、H2O2、細菌素、類細菌素等多種物質來抑制致病菌的生長，從而達到生物拮抗作用［18］。同時，與病原菌競爭粘附在胃腸上皮細胞，形成一層致密性保護膜發(fā)揮生物屏障作用。Davoodabadi 等［19］從健康嬰兒糞便中獲得4 株發(fā)酵乳桿菌，發(fā)現(xiàn)它們能有效抑制大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌和耶爾森菌等腸道致病菌的生長。Fuochi 等［20］研究報道，從消化道分離出的8 株發(fā)酵乳桿菌對多種病原菌均有較強的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌LF1 發(fā)酵液對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌D 型與豬鏈球菌2 型等12 種常見病原菌均有較強的抑制作用。有文獻報道羅伊氏乳桿菌能夠產(chǎn)生多種細菌素和抗菌肽［21］，能有效抑制病原微生物的生長，還能產(chǎn)生大量有機酸和肉桂酰酯酶等抑制殺滅腸道中的病原微生物［22］。而本試驗中的菌株產(chǎn)生的上清能有效抑制病原菌生長，可能也是通過產(chǎn)生類似的抑菌物質來實現(xiàn)。

綜上，發(fā)酵乳桿菌LF1 具有較強的耐酸和耐膽鹽的能力，同時還具有較強的抑菌作用，可以作為畜禽養(yǎng)殖益生菌的候選菌株。但是LF1 對腸道的粘附能力并不強，因此仍需不斷地篩選出更加優(yōu)良的益生菌與其進行復配用于畜禽動物的生產(chǎn)養(yǎng)殖。

4 結論

本研究通過從健康仔豬糞便中分離純化，鑒定出1 株發(fā)酵乳桿菌LF1，并從體外實驗中對該發(fā)酵乳桿菌的耐酸、耐膽鹽、粘附能力和抑菌能力進行測試，結果表明，發(fā)酵乳桿菌LF1 具有較強的耐酸和耐膽鹽的能力，耐酸和耐膽鹽的能力使其可以在動物胃腸道內(nèi)存活，從而更好地發(fā)揮其作用。發(fā)酵乳桿菌LF1 發(fā)酵液對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌D 型與豬鏈球菌2 型等12 種常見病原菌均有較強的抑制作用，可以有效抑制動物體內(nèi)病原菌生長。這表明本研究從健康仔豬糞便中分離出的發(fā)酵乳桿菌LF1 具有較好的益生特性，可以作為畜禽動物生態(tài)健康養(yǎng)殖中的飼料添加劑的益生菌的候選菌株，具有良好的抑菌能力，可以調(diào)節(jié)動物腸道菌群，從而促進動物健康生長。