小豆AUX/IAA 基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

羅永堅(jiān)，葛 蓉，劉 軍，李 清

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】生長素是一種普遍存在的激素，在多種植物發(fā)育過程中起著重要作用，如細(xì)胞分裂、胚胎發(fā)生、維管束伸展、側(cè)根起始、葉片伸展、開花、果實(shí)成熟、頂端優(yōu)勢(shì)、向下生長和抗逆性［1］。生長素并不直接參與這些調(diào)節(jié)作用，而是通過的生長素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，如AUX/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）、ARF（auxin response factor）、GH3（Gretchen hagen 3）和SAUR（small auxin-up RNA）［2-3］。其中，AUX/IAA 蛋白作為生長素信號(hào)通路的重要組成部分，該蛋白主要存在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中且存在時(shí)間較短［4-5］，通過釋放生長素反應(yīng)因子（Auxin Response Factors）參與生長素信號(hào)通路調(diào)控下游大量的基因表達(dá)［6-8］。小豆（Vigna angularis），又名紅豆、紅小豆，豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）豇豆屬（Vigna）的一種1 年生直立或纏繞草本作物［9］，已有12 000 年的栽培歷史［10］。在當(dāng)今大力發(fā)展優(yōu)質(zhì)、高效農(nóng)業(yè)的時(shí)代背景下，小豆已成為首選作物之一。但在實(shí)際生產(chǎn)中，作物常常會(huì)因不可避免的環(huán)境脅迫而減產(chǎn)，甚至絕收［11］。而AUX/IAA基因家族在植物的生長發(fā)育和植物逆境脅迫應(yīng)答過程中都起著重要作用，目前已在多種植物中開展了相關(guān)研究，但在小豆中AUX/IAA基因家族還尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究和報(bào)道。【前人研究進(jìn)展】Aux/IAA蛋白一般具有4 個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域（Domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），該基因家族中也包括缺失一個(gè)或兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)［7］。其中，Domain Ⅰ是由一個(gè)亮氨酸重復(fù)基序（“LxLxL”）組成，充當(dāng)乙烯應(yīng)答因子（ERF）與EAR 基序結(jié)合的阻遏域［12-14］，結(jié)構(gòu)域Ⅱ是AUX/IAA 不穩(wěn)定的關(guān)鍵成分，存在與降解子高度保守序列（GWPPV），能被泛素酶體蛋白（TIP1）所識(shí)別并降解［15-17］。結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ中C 末端結(jié)構(gòu)域上存在介導(dǎo)AUX/IAA 蛋白和生長素反應(yīng)因子同源或異源二聚化［7,18-19］。自從AUX/IAA基因首次從大豆中被鑒定出來［20］，目前，已從多個(gè)植物的全基因組中鑒定出AUX/IAA基因家族，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）［21］、毛果楊（Populus trichocarpaTorr）［22］、番茄（Lycopersicon esculentum）［23］、高粱（Sorghum bicolor）［24］、葡萄（Vitis vinifera）［25］、水稻（Oryza sativa）［26］和玉米（Zea mays）［27］。據(jù)相關(guān)報(bào)道，AUX/IAA基因家族的成員在植物的生長發(fā)育過程中具有不同的生物學(xué)功能，對(duì)植物的性狀起著重要的調(diào)控作用［28］。如：在白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）中，HcIAA2和HcIAA4在花香形成過程中起著重要作用［29］。紫花苜蓿（Medicago sativa）的MtIAA6和MtIAA7具有根特異性表達(dá)，MtIAA9在花中的表達(dá)水平較高［30］。在中華龍竹（Dendrocalamus barbatus）中，DsIAA3、DsIAA4、DsIAA15和DsIAA20可能是調(diào)控新梢發(fā)育的重要基因［31］。VvIAA4［32］、VvIAA9［33］、SlIAA15［34］、SlIAA17［35］是果實(shí)結(jié)實(shí)過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。OsIAA5［36］和OsIAA6［37］與水稻的耐旱性具有關(guān)聯(lián)性。在擬南芥中，AtIAA5、AtIAA6和AtIAA9阻遏蛋白通過特異性調(diào)控脂肪族芥子油苷的表達(dá)來影響植物的耐旱性［38］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于已公布的小豆基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法鑒定小豆中的AUX/IAA基因，并從理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)互作分析、各組織的基因表達(dá)水平等進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究為后續(xù)闡明AUX/IAA基因的相關(guān)功能研究提供一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家族成員鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

從Esembl Plant 數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org/index.html）下載小豆全部蛋白質(zhì)序列，從Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載AUX/IAA 保守結(jié)構(gòu)域的HMM 模型，利用HMMER3.0軟件和本地BLASTP 程序設(shè)置閾值E-value 值≤e-10 鑒定含有AUX/IAA 蛋白結(jié)構(gòu)域的序列，通過SMARTG1，CDD［39-40］在線軟件預(yù)測候選蛋白質(zhì)序列。利用Expasy［41］分析小豆AUX/IAA成員的蛋白質(zhì)序列長度、分子量及等電點(diǎn)。利用Euk-mP-Loc2.0 進(jìn)行亞細(xì)胞定位。利用prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）在線分析軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

AUX/IAA 氨基酸序列在MEGA X 軟件采用鄰近法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中Bootstrap 設(shè)置為1000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，用iTOL（https://itol.embl.de/itol.cgi）對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行分類和注釋。

1.3 保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件MEME（https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對(duì)小豆AUX/IAA 蛋白保守基序，其中利用在線網(wǎng)站CSDS2.0（https://www.csds2.0.in/）對(duì)小豆AUX/IAA基因家族成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，通過Tbtools 軟件對(duì)小豆AUX/IAA 蛋白保守基序和保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合其系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行可視化分析。

1.4 加倍復(fù)制分析及Ka、Ks 計(jì)算

使用Linux 版本的MCScan-X［42］軟件，分別對(duì)小豆基因組內(nèi)共線性進(jìn)行分析，并利用TBtools［43］軟件和繪圖程序?qū)⒔Y(jié)果可視化，將共線性基因計(jì)算Ka/Ks 值。

1.5 順式作用元件分析

提取AUX/IAA家族基因上游1 500 bp 長度的序列作為啟動(dòng)子序列，提交到Plant CARE［44］（http://bioinformatics.psb.ugent.be/）數(shù)據(jù)庫，對(duì)小豆AUX/IAA家族基因進(jìn)行上游順式作用元件分析，預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子可識(shí)別并特異性結(jié)合的順式作用元件。

1.6 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及GO 功能注釋

基于在線分析軟件STRING（https://string-db.org/），將小豆AUX/IAA基因家族氨基酸序列與模式植物擬南芥庫作為參考進(jìn)行比對(duì)，對(duì)AUX/IAA基因的蛋白-蛋白互作信息進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測。

1.7 基因表達(dá)模式分析

在NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫下載8 個(gè)小豆組織（葉、根、胚軸、花、根瘤、頂端、幼莢、子葉）以及0.9 mmol/L NaCl 幼苗鹽脅迫的RNA-seq 數(shù)據(jù)（PRJDB3778,PRJNA576763）［45］，計(jì)算表達(dá)量FPKM，繪制表達(dá)圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

從小豆全基因組中篩選出41 個(gè)完整和非重復(fù)冗余的AUX/IAA 蛋白序列，根據(jù)基因在染色體位置上進(jìn)行排序，分析AUX/IAA基因的理化性質(zhì)。結(jié)果（表1）表明，小豆AUX/IAA基因編碼的多肽為86～1 120 個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為9 461.5～125 292.9 u，等電點(diǎn)為4.53～10.37。在蛋白親水性方面41 個(gè)VaIAA蛋白親水性系數(shù)均小于1，為親水性蛋白，亞細(xì)胞定位顯示均為定位為細(xì)胞核，與其響應(yīng)生長素轉(zhuǎn)導(dǎo)位置相同。預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋占比為7.93%～43.02%，β-轉(zhuǎn)角占比為1.86%～8.39%，延伸鏈占比為12.88%～25.00%，無規(guī)則卷曲占比為34.88%～65.37%，從結(jié)果來看，VaIAA蛋白以無規(guī)則卷曲和a-螺旋為主體結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角及延伸鏈為次要結(jié)構(gòu)。

表1 小豆AUX/IAA 家族成員理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of AUX/IAA family members in Vigna angularis

2.2 AUX/IAA 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化

將本研究鑒定出的41 個(gè)VaIAAs基因與擬南芥和水稻AUX/IAA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，共分為6 個(gè)類別（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ），Ⅰ類包含10 個(gè)IAA 基因（9 個(gè)VaIAAs、1 個(gè)AtIAAs），Ⅱ類包含22 個(gè)IAA 基因（8 個(gè)AtIAAs、6 個(gè)OsIAAs、8 個(gè)VaIAAs），Ⅲ類包含20 個(gè)IAA 基因（6個(gè)AtIAAs、8 個(gè)OsIAAs、6 個(gè)VaIAAs），Ⅳ類包含21 個(gè)IAA 基因（10 個(gè)AtIAAs、5 個(gè)OsIAAs、6 個(gè)VaIAAs），Ⅴ類包含15 個(gè)IAA 基因（4 個(gè)AtIAAs、9 個(gè)OsIAAs、2 個(gè)VaIAAs），Ⅵ類包含31 個(gè)IAA 基因（12 個(gè)AtIAAs、6 個(gè)OsIAAs、13個(gè)VaIAAs）。進(jìn)化關(guān)系中呈現(xiàn)7 對(duì)姐妹對(duì)，其余為擬南芥與水稻；旁系同源蛋白占75.86%（22對(duì)），小豆10 對(duì)、擬南芥11 對(duì)、水稻11 對(duì)，其余全為直系同源蛋白（圖1）。

圖1 小豆 AUX/IAA 基因家族進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AUX/IAA gene family in Vigna angularis

2.3 蛋白基序及基因結(jié)構(gòu)分析

為探究VaIAAs家族的保守性，在可信范圍（e-value ≤e-5）內(nèi)，VaIAA家族成員編碼蛋白共含有10 種motif，分別命名為motif 1～motif 10。結(jié)果（圖2）顯示，共有41 個(gè)成員具有4 個(gè)完整的典型保守結(jié)構(gòu)域（保守基序）：Domain Ⅰ（motif 3）、Domain Ⅱ（motif 9）、Domain Ⅲ（motif 10）、Domain Ⅳ（motif 2）。其中Domain Ⅰ（motif 3）在所有AUX/IAA基因中均鑒定到，有4 個(gè)成員（VaIAA08/04/015/07）發(fā)生了Domain Ⅳ（motif 9）缺失；而Domain Ⅱ（motif 9）、Domain Ⅲ（motif 10）只在部分基因中鑒定得到。而基因的結(jié)構(gòu)在決定基因的表達(dá)和功能中起著重要因素，而且基因結(jié)構(gòu)多樣性是許多基因家族進(jìn)化的主要?jiǎng)恿?。因此，?duì)小豆AUX/IAA基因家族結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果（圖2）表明，多數(shù)VaAUX/IAA包含4 個(gè)內(nèi)含子，即多具有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子的典型基因結(jié)構(gòu)模式，相同的基因結(jié)構(gòu)和保守基序的基因在聚類在一起提高了系統(tǒng)發(fā)育樹的準(zhǔn)確性。

圖2 小豆AUX/IAA 家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序Fig.2 Gene structure and conserved motifs of AUX/IAA family in Vigna angularis

2.4 小豆AUX/IAA 家族基因的染色體定位、種內(nèi)共線性和選擇壓力分析

通過染色體定位，結(jié)果（圖3）表明41 條VaIAA基因不均勻地分布在9 條染色體上，其中2 號(hào)染色體上分布最多，有9 個(gè)VaIAA成員；共線性分析結(jié)果（圖3）顯示，41 個(gè)VaIAA家族成員存在13 對(duì)共線性關(guān)系，所有基因均為片段復(fù)制。通過計(jì)算基因?qū)Φ腒a/Ks 值，發(fā)現(xiàn)Ka/Ks 值均小于1，說明VaIAA基因在進(jìn)化過程中可能經(jīng)歷受到純化選擇壓力的影響。

2.5 小豆AUX/IAA 轉(zhuǎn)錄因子順式作用元件分析

通過plantCARE 對(duì)VaIAAs基因上游1.5 kb進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)共有51 種順式作用元件，對(duì)VaIAAs基因順式作用元件分類可分為響應(yīng)生物/非生物脅迫、植物激素、生長發(fā)育的順式作用元件。其中參與響應(yīng)生物/非生物脅迫順式作用元件最多，包括最常識(shí)別到的ATTATA.bos、G-box 和sp1 基序，還發(fā)現(xiàn)富集在厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE 和植物抗逆相關(guān)的MYB 元件。植物激素響應(yīng)元件共12 種，包括赤霉素響應(yīng)元件（P-box）、茉莉酸響應(yīng)元件（TGAGG-motif）和水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）和乙烯響應(yīng)元件（ERE）。在參與植物生長發(fā)育順式元件共有14 個(gè)，其中VaIAA基因富集在TATA.box、CAAT.box、ABRE，其 中TATA-box基序在預(yù)測元件中數(shù)目最多。順式作用元件分析結(jié)果表明，VaIAA基因存在不同的反應(yīng)基序，不同的VaIAA成員在基序上富集情況和作用模式不盡相同，說明VaIAA基因在植物生長及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2.6 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及GO 功能富集分析

為研究VaIAAs家族蛋白間的相互作用，以擬南芥為參考對(duì)象構(gòu)建VaIAAs蛋白與其他蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。預(yù)測結(jié)果（圖5）表明，整個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中共有25 個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)間存在227 組蛋白互作關(guān)系，所有VaIAAs均與ARF 蛋白產(chǎn)生互作關(guān)系，其中存在一些IAA 之間存在蛋白互作關(guān)系，15 個(gè)VaIAA基因與AXR3（生長素誘導(dǎo)阻遏因子），20 個(gè)VaIAAs基因與MP（轉(zhuǎn)錄因子B3 家族蛋白），暗示VaIAAs蛋白可能受多種蛋白調(diào)控。

圖5 小豆 VaIAAs 家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein interaction network of VaIAAs family in Vigna angularis

為更好理解VaIAAs的功能，將所有VaIAAs轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因本體注釋（Gene ontology），結(jié)果見圖6，GO 功能注釋主要富集在生物過程（Biological Process）、細(xì)胞組分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3大類。其中，生物進(jìn)程富集的基因通路最多，分子功能次之，細(xì)胞成分最少，在生物過程分類中，所有主要富集在生長素信號(hào)激活通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，細(xì)胞組成分類中AUX/IAA基因主要參與細(xì)胞和細(xì)胞核的組成，在分子功能中主要富集在DNA 結(jié)合和DNA 轉(zhuǎn)錄因子活性。

圖6 小豆 VaIAAs 家族基因GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of VaIAAs gene family in Vigna angularis

2.7 小豆不同組織基因表達(dá)分析

VaIAAs基因的組織特異性表達(dá)模式與生物學(xué)功能密切相關(guān)，利用小豆在葉、根、胚軸和花等不同組織的RNA-seq 數(shù)據(jù)對(duì)41 個(gè)VaIAAs成員在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果（圖7A）表明有10 個(gè)基因在各組織表達(dá)量較低（FPKM＜10），包括7 個(gè)成員（VaI AA0 8/17/18/05/15/23/12/31/32/22）。大多數(shù)AUX/IAA基因在莖和花組織上表達(dá)較高，在幼莢和子葉這兩個(gè)組織中VaIAAs表達(dá)水平相對(duì)于其他組織低。還發(fā)現(xiàn)VaIAA08/17/22/15/12在組織間的表達(dá)差異最小，表明這些基因的調(diào)控可能主要發(fā)生在翻譯后水平。而VaIAA39/29在多個(gè)組中均表達(dá)較高，可這能參與小豆整個(gè)生長過程。此外還發(fā)現(xiàn)VaAUX/IAA基因在不同組織的優(yōu)先表達(dá)，表明這些基因可能在組織特異性轉(zhuǎn)錄因子下發(fā)揮作用，參與小豆特定組織的發(fā)育進(jìn)程。基于NaCl脅迫下RNA-seq 數(shù)據(jù)比較18 個(gè)DlIAAs 的表達(dá)水平，結(jié)果（圖7B）顯示有10 個(gè)V aIAAs（VaI AA12/20/40/14/03/26/32/01/07/31）表達(dá)顯著上調(diào)，推測這10 個(gè)成員可能在鹽脅迫下起關(guān)鍵的作用。

圖7 小豆 VaIAAs 家族基因在RNA-seq 的表達(dá)Fig.7 Expression of VaIAAs gene f amily of Vigna angularis in different RNA-seq databases

3 討論

植物在生長過程中受到多種激素的影響，生長素是植物生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵信號(hào)分子。作為最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，其生理作用廣泛，影響細(xì)胞的分裂、擴(kuò)大和分化。AUX/IAA 蛋白在植物生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中被認(rèn)為與ARFs結(jié)合，在沒有生長素的情況下阻止生長素反應(yīng)基因的激活，以調(diào)控植物的生長［46］。研究AUX/IAA 的功能和表達(dá)圖譜有助于揭示生長素是如何調(diào)控植物體的生長發(fā)育和響應(yīng)特定時(shí)空上的環(huán)境變化。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)對(duì)許多植物的全基因組進(jìn)行了測序，并在多種植物中發(fā)現(xiàn)了大量的AUX/IAA基因。小豆的全基因組公布使得在基因組水平上鑒定分析AUX/IAA 基因家族成為可能。在本研究中，在小豆全基因組中共鑒定出41個(gè)AUX/IAA 基因家族，而在前人的研究中如：擬南芥鑒定出29 個(gè)成員［21］，毛果楊中鑒定出35個(gè)成員［22］，番茄［23］、高粱［24］、葡萄［25］中均包含26 個(gè)成員，水稻［26］和玉米［27］中鑒定出31個(gè)成員，這表明不同植物物種之間AUX/IAA基因家族的數(shù)量存在很大差異。

利用NJ 法將41 個(gè)VaIAAs基因與雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻AUX/IAA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果分為6 類，其中VaIAAs主要集中在Ⅰ類和Ⅵ類（58.53%），因此，推斷聚類在一起的IAAs基因結(jié)構(gòu)或功能可能為高度相同且具有保守性。在進(jìn)化關(guān)系中呈現(xiàn)7 對(duì)姐妹對(duì)，其中3 對(duì)姐妹對(duì)是小豆與擬南芥，其余均為擬南芥與水稻形成的姐妹對(duì)，這可能是因?yàn)樾《购蛿M南芥都為雙子葉植物VaIAAs與AtIAAs在進(jìn)化關(guān)系上更近，而相近的蛋白序列在植物生理上具有相似功能?；蚣易鍞U(kuò)張的主要?jiǎng)恿κ瞧螐?fù)制和串聯(lián)復(fù)制［47］，VaIAAs家族中10 對(duì)旁系同源蛋白，均無串聯(lián)復(fù)制事件，由小豆基因組內(nèi)共線性分析，發(fā)現(xiàn)VaIAAs基因家族中共有13 對(duì)復(fù)制基因，且Ka/Ks 均小于1，說明片段復(fù)制為VaIAAs基因家族進(jìn)化擴(kuò)張的主要?jiǎng)恿?，這可能與其基因組在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了多次全基因組復(fù)制事件有關(guān)［48］。

基因的表達(dá)往往受到啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件的調(diào)控，本研究鑒定了3 類直接參與生長素信號(hào)通路的順式元件。鑒于AUX/IAA蛋白作為光信號(hào)和生長素反應(yīng)之間的連接物，在VaIAAs基因的啟動(dòng)子區(qū)域中觀察到12 種對(duì)光信號(hào)有反應(yīng)的順式元件。此外，生長素還可以在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［49］。在VaIAAs基因啟動(dòng)子序列中還發(fā)現(xiàn)了4 種與病原菌抗性相關(guān)的順式元件。此外，在VaIAA基因的啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了與非生物脅迫適應(yīng)相關(guān)的順式元件，如DRE（脫水反應(yīng)元件）、LTRE（低溫反應(yīng)元件）。VaIAAs基因啟動(dòng)子中存在不同的順式元件說明生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以與其他代謝途徑相互作用。生長素和非生物脅迫信號(hào)通路之間的串?dāng)_已經(jīng)在水稻中得到證實(shí)［50］。毫無疑問，VaIAAs基因啟動(dòng)子中順式元件的多樣性也與AUX/IAA蛋白在植物生命中起著關(guān)鍵作用有關(guān)。

植物的基因在不同組織中的特異性表達(dá)在不同發(fā)育階段調(diào)控中起著重要作用，基因表達(dá)調(diào)控導(dǎo)致植物對(duì)生長、發(fā)育、非生物和生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)［51］。RNA-seq 顯示幾乎所有VaIAAs基因均有表達(dá)，但在不同發(fā)育階段，其表達(dá)水平有較大差異。許多變量可能導(dǎo)致Aux/IAA基因表達(dá)的差異，包括組織特異性生長素受體、細(xì)胞類型依賴性、游離生長素濃度的差異調(diào)節(jié)、生長素依賴性轉(zhuǎn)錄的不同模式和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等［52］。而值得注意的是，在本研究發(fā)現(xiàn)VaIAA41基因在小豆根瘤組織的基因中表達(dá)水平較高。豆科植物與根瘤菌共生固氮是植物氮素營養(yǎng)的一個(gè)重要來源［53］，因此根瘤的發(fā)育對(duì)節(jié)約氮肥具有重要作用，有研究表明IAA的積累對(duì)根瘤菌的形成具有正向效應(yīng)［54］，推測該基因可能在小豆根瘤組織或者在根的發(fā)育和生長過程中發(fā)揮重要作用。而在0.9 mmol/L NaCl 脅迫處理的RNA-seq 數(shù)據(jù)中，有10個(gè)VaIAA（VaIAA12/20/40/14/03/26/32/01/07/31）在NaCl 處理1 h 后表達(dá)量顯著上調(diào)，是對(duì)照組的7 倍，此外對(duì)這10 個(gè)基因順式作用元件檢索發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)MYB 和ARF 作用元件。有研究表明，Aux/IAA 通過與植株生長素反應(yīng)因子ARF（auxin response factor）結(jié)合抑制了生長素誘導(dǎo)基因的表達(dá)，在生長素所調(diào)控的對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過程中起著核心作用［55］,表明這些基因可能直接或間接響應(yīng)調(diào)控小豆的抗鹽能力。

4 結(jié)論

本研究以小豆基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，鑒定并分析了小豆中AUX/IAA轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、保守基序、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體定位、共線性關(guān)系和順式作用元件。分析結(jié)果表明，從小豆全基因組中共鑒定出41 個(gè)AUX/IAA基因，系統(tǒng)進(jìn)化將其分為6 個(gè)亞族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ）?；蚨ㄎ伙@示，41 個(gè)AUX/IAA基因不均勻地分布在9 條染色體上?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，AUX/IAA中外顯子的數(shù)目從1～17 個(gè)不等，同一亞族內(nèi)的成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)和基序組成。AUX/IAA轉(zhuǎn)錄因子氨基酸數(shù)目為86～1 120 個(gè)；蛋白質(zhì)分子量為9 461.5～123 898.4 u；等電點(diǎn)在4.53～10.37，AUX/IAA基因都定位在細(xì)胞核上。順式作用元件分析表明，大多數(shù)AUX/IAA基因含有1 個(gè)或多個(gè)順式作用元件，表明AUX/IAA基因可能響應(yīng)不同的非生物脅迫。不同條件下的表達(dá)模式分析結(jié)果為進(jìn)一步研究AUX/IAA基因在小豆生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中潛在的功能提供有價(jià)值的信息，進(jìn)而促進(jìn)AUX/IAA基因在小豆抗逆分子育種中的應(yīng)用。