蛋白質(zhì)互作組學(xué)技術(shù)及其在植物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

張文洋，張 勝，易干軍，晏石娟

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.康奈爾大學(xué)生物技術(shù)研究所，美國 伊薩卡 14850；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣東 廣州 510640）

植物由于其固著的生長方式，一直暴露于自然環(huán)境的各種壓力中［1］。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來感知外部脅迫并觸發(fā)生理、分子和細(xì)胞水平的多層次反應(yīng)［2-3］。構(gòu)建如此復(fù)雜且精細(xì)的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)需要數(shù)千種分子的協(xié)作，在較早的研究中，人們對核酸、蛋白質(zhì)、代謝物進(jìn)行鑒定和量化，試圖闡明代謝調(diào)控機(jī)理［4-5］。然而單純的豐度變化信息所能提供的證據(jù)有限，僅能大致預(yù)測各種分子之前的潛在聯(lián)系，卻難以成為它們之間相互關(guān)聯(lián)的直接證據(jù)，也無法確認(rèn)這種關(guān)聯(lián)是直接還是間接的，而且很多分子發(fā)揮功能并不需要體現(xiàn)在豐度的改變［6］。分子間的物理相互作用是一切信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)或代謝物可對外部刺激迅速作出反應(yīng)，通過與其他代謝物和蛋白的相互作用推動細(xì)胞調(diào)節(jié)過程以維持細(xì)胞和生物體的穩(wěn)態(tài)［7］。

過去10 年，受益于樣品制備技術(shù)的改進(jìn)和質(zhì)譜儀、譜圖檢索算法的更新迭代，基于質(zhì)譜的組學(xué)技術(shù)已能勝任對各類生物的代謝物及蛋白質(zhì)進(jìn)行全局的定性定量分析。在這些技術(shù)的基礎(chǔ)上，還不斷衍生出多種用于表征分子間相互作用的組學(xué)技術(shù)。為區(qū)別于常規(guī)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，這類旨在鑒定及量化蛋白質(zhì)與其他分子之間相互作用的技術(shù)被定義為“蛋白質(zhì)互作組學(xué)技術(shù)”［8］。根據(jù)研究對象，這類技術(shù)被分為表征蛋白質(zhì)-核酸、蛋白質(zhì)-代謝物、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用幾大類別，每一個(gè)類別的技術(shù)又根據(jù)不同實(shí)施原理進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分。相比于傳統(tǒng)的生化方法，蛋白質(zhì)互作組學(xué)技術(shù)具有全局性、高通量的優(yōu)點(diǎn)，已在蛋白質(zhì)功能研究中扮演重要角色，但在植物系統(tǒng)中的應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)橹参锎x途徑多種多樣，很多植物的基因組復(fù)雜且注釋嚴(yán)重不足［9］，許多互作組學(xué)分析方法依賴遺傳操作，而這在植物系統(tǒng)中也具有較大難度，特別是在多倍體中。同時(shí)，沒有一種方法可以評估相互作用的所有特征（定位、互作模式、親和力和周期等），通常需要組合不同的方法才能更全面地了解感興趣的代謝物或蛋白質(zhì)的相互作用情況。盡管存在這些固有的挑戰(zhàn)，但全面了解植物復(fù)雜性狀形成的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不僅是解決現(xiàn)代農(nóng)業(yè)最緊迫問題的先決條件，也為守護(hù)糧食安全、應(yīng)對全球極端氣候以及可再生材料和燃料需求提供保障。

本文重點(diǎn)介紹了用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證蛋白質(zhì)-代謝物相互作用（Protein-metabolite interaction,PMI）、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interaction,PPI）的多種前沿蛋白互作組學(xué)技術(shù)，分析它們各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用的相互作用類型，并且介紹了這些技術(shù)在植物領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀及最新進(jìn)展。

1 蛋白質(zhì)-代謝物相互作用（PMI）

植物是自然界中小分子的“倉庫”，目前已發(fā)現(xiàn)了超過20 萬種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝物［10］，次級代謝物在結(jié)構(gòu)上更加多樣化，顯示出廣泛的生物活性［11］。在細(xì)胞水平上，代謝物可以作為信使（如配體）或作為代謝組分（如酶的底物、產(chǎn)物、輔因子或調(diào)節(jié)劑）與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)幾乎所有的細(xì)胞過程。了解代謝物生物活性的關(guān)鍵在于發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)伴侶，經(jīng)典的生物化學(xué)和遺傳學(xué)方法一直是研究代謝物功能的常用選擇，但受限于過長的實(shí)驗(yàn)周期，無法高通量篩選代謝物-蛋白質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致當(dāng)前對代謝物-蛋白質(zhì)相互作用的探索仍嚴(yán)重不足，特別是對于植物特有的代謝物，而這些信息對于理解植物穩(wěn)態(tài)和育種研發(fā)都非常關(guān)鍵。

近年來，組學(xué)技術(shù)已在多個(gè)分子領(lǐng)域取得巨大成功，越來越多的生化與組學(xué)相結(jié)合的蛋白質(zhì)互作組學(xué)技術(shù)陸續(xù)被用于系統(tǒng)識別小分子-蛋白質(zhì)相互作用，這些方法大多首先被用于藥物研發(fā)領(lǐng)域，使得相關(guān)研究的通量和效率得到跨越性提升，在植物代謝物的功能研究中也逐漸展示出應(yīng)用潛力。這些方法根據(jù)研究內(nèi)容分為3 類，分別為以代謝物為中心尋找靶標(biāo)蛋白、以蛋白質(zhì)為中心尋找互作代謝物以及全局互作組分析。

1.1 以代謝物為中心尋找靶標(biāo)蛋白

根據(jù)實(shí)施的原理，以代謝物為中心尋找靶標(biāo)蛋白的方法可分為化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)（Chemical proteomics）和生物物理蛋白質(zhì)組學(xué)（Biophysical proteomics）兩大類別。

化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法需要對代謝物進(jìn)行化學(xué)修飾或標(biāo)記，并將其作為“誘餌”從天然細(xì)胞裂解物中對蛋白質(zhì)進(jìn)行“誘捕”，隨后利用質(zhì)譜鑒定互作蛋白［12］，由于發(fā)展較早，這類技術(shù)的應(yīng)用已非常廣泛，且不斷得到多方面的改進(jìn)。最簡單的方式是將代謝物固定在固相基質(zhì)表面進(jìn)行富集，如利用光反應(yīng)性水楊酸（SA）類似物4AzSA進(jìn)行篩選，從擬南芥葉提取物中檢測到35 種4AzSA 的互作蛋白，特別是病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（NPR1），結(jié)束了關(guān)于這種蛋白質(zhì)功能的長期爭論［13］。該技術(shù)近期在植物中的另一個(gè)應(yīng)用是鑒定RNA 的小分子降解產(chǎn)物2',3'-環(huán)磷酸腺苷（cAMP）與RNA 結(jié)合蛋白Rbp47b 之間的相互作用，繼而發(fā)現(xiàn)這一互作可以促進(jìn)擬南芥幼苗在暗脅迫和熱脅迫下產(chǎn)生應(yīng)激顆粒［14］。

雖然使用廣泛且方便，但固定造成的空間位阻和藥效團(tuán)阻塞可能在一定程度上干擾代謝物與靶標(biāo)蛋白間的相互作用。針對這一限制，基于活性的蛋白質(zhì)分析（ABPP）用生物素或熒光標(biāo)簽修飾天然產(chǎn)物，以便其與蛋白質(zhì)充分接觸，從而更好地反映生理?xiàng)l件下的代謝物-靶標(biāo)結(jié)合。雙環(huán)乙內(nèi)酰脲作為紫丁香素合成中的副產(chǎn)物引起人們關(guān)注，用生物素將其標(biāo)記后，利用親和純化結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定出甘油醛3-磷酸脫氫酶GAPC1和GAPC2 是雙環(huán)乙內(nèi)酰脲的靶標(biāo)［15］。BRI1 是植物中一種定位于質(zhì)膜的富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶，是油菜素內(nèi)酯受體復(fù)合物的關(guān)鍵成分，Kinoshita 等使用生物素標(biāo)記的油菜素甾酮（BPCS，活性油菜素內(nèi)酯），提供了活性油菜素內(nèi)酯與BRI1 直接結(jié)合的第一個(gè)證據(jù)，并確定了最小結(jié)合域的序列［16］。

某些較大體積的生物素通常不能滲透膜，也會對內(nèi)源性生物素化蛋白質(zhì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此采用炔烴或疊氮化物標(biāo)簽代替生物素，在小分子上引入用于點(diǎn)擊化學(xué)的生物正交基團(tuán)，能盡可能保持天然產(chǎn)物的理化性質(zhì)，并允許其進(jìn)入細(xì)胞與靶蛋白進(jìn)行原位結(jié)合。這種方法常用于醫(yī)學(xué)研究，在植物科學(xué)也出現(xiàn)了使用小型標(biāo)記的E-64和乙烯基砜探針的案例，通過標(biāo)記擬南芥葉、幼苗或細(xì)胞培養(yǎng)物來證明該方法的穩(wěn)健性和多功能性，可檢測和鑒定以前通過體外標(biāo)記未檢測到的靶標(biāo)［17］。

一些天然產(chǎn)物通過非共價(jià)鍵（如氫鍵、離子鍵和疏水相互作用）與其蛋白質(zhì)靶標(biāo)相互作用。點(diǎn)擊化學(xué)探針并不適合這類小分子，因?yàn)榛钚苑肿雍桶械鞍字g的非共價(jià)結(jié)合會在點(diǎn)擊反應(yīng)和富集過程中被破壞。光親和力標(biāo)記（Photo-affinity labeling,PAL）適合研究這類非共價(jià)結(jié)合的相互作用，為避免小分子和靶標(biāo)蛋白之間的結(jié)合被破壞，光親和探針可在特定波長的光下共價(jià)結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)，隨后對靶標(biāo)進(jìn)行富集。例如，在探究控制合歡葉感夜運(yùn)動的茉莉酸糖苷靶標(biāo)中，三功能探針由感興趣的小分子茉莉酸糖苷、作為反應(yīng)功能的二苯甲酮和作為富集功能的生物素組成，探針在365 nm 照射下被激活，經(jīng)鏈霉親和素富集后，成功發(fā)現(xiàn)了一種膜蛋白是參與 茉莉酸糖苷控制感夜性的靶蛋白［18］。

對天然產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾難免影響其理化性質(zhì)，且有些天然產(chǎn)物缺乏合適的修飾位點(diǎn)。因此，近年來涌現(xiàn)出一系列不對天然產(chǎn)物作任何修飾的生物物理蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，它們利用靶標(biāo)蛋白與天然產(chǎn)物結(jié)合后的理化性質(zhì)變化來鑒定各類小分子的 互作靶標(biāo)蛋白。其中，藥物親和反應(yīng)目標(biāo)穩(wěn)定性（Drug affinity responsive target stability,DARTS）和有限蛋白水解質(zhì)譜（Limited proteolysis-coupled mass spectrometry,LiP-MS）技術(shù)，利用蛋白與小分子結(jié)合后形成不易被蛋白酶水解的穩(wěn)定構(gòu)象，來鑒定天然產(chǎn)物的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，還能提供結(jié)合的界面信息［19-20］。蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性分析（Stability of proteins from rates of oxidation,SPROX）利用甲硫氨酸殘基的氧化速率差異來顯示蛋白質(zhì)折疊或解折疊的熱力學(xué)特性，鑒定與小分子相互作用的靶標(biāo)蛋白，還能量化其結(jié)合親和力［21］。上述兩類方法有相似優(yōu)勢，但要求在結(jié)合區(qū)域有特異性酶切位點(diǎn)或甲硫氨酸殘基，而細(xì)胞熱位移分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）利用靶蛋白與配體結(jié)合后的熱穩(wěn)定性提升，能從完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中識別藥物結(jié)合靶標(biāo)［22］，這項(xiàng)技術(shù)隨后與等壓質(zhì)量標(biāo)簽定量技術(shù)（Tandem mass tag,TMT）結(jié)合而成的熱蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（Thermal proteome profiling,TPP），能同時(shí)描繪出數(shù)千種蛋白質(zhì)的熔解曲線，用于體外、原位或體內(nèi)鑒定配體與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合及其蛋白的互作［23］。

DARTS/LiP-MS、SPROX 和CETSA/TPP 等生物物理蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)自建立后得到持續(xù)改進(jìn)和完善，已廣泛應(yīng)用于動物細(xì)胞和微生物研究，但直到近幾年才被陸續(xù)用于植物領(lǐng)域，包括用DARTS 驗(yàn)證藥物endosidin2 與擬南芥外囊復(fù)合物亞基EXO70 之間的相互作用［24］，驗(yàn)證藥物endosidin4 與擬南芥ADP-核糖基化因子鳥嘌呤核苷酸交換因子（ARF-GEFs）之間的關(guān)聯(lián)［25］，還有用TPP 技術(shù)對擬南芥Mg-ATP 相互作用組進(jìn)行熱蛋白質(zhì)組學(xué)表征以鑒定靶標(biāo)蛋白［26］。雖然實(shí)例較少，但從原理而言，以上3 類技術(shù)均能勝任植物細(xì)胞研究工作，由于植物細(xì)胞與動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組分存在差異，這些技術(shù)還需要經(jīng)過針對性的優(yōu)化及改進(jìn)，但它們無以倫比的高通量、無需對小分子標(biāo)記的優(yōu)勢已經(jīng)顯示出廣泛應(yīng)用前景。

1.2 以蛋白質(zhì)為中心尋找互作代謝物

在以蛋白質(zhì)為中心的互作組學(xué)方法中，感興趣的蛋白被用作“誘餌”來識別與它們相互作用的代謝物。串聯(lián)親和純化（Tandem affinity purification,TAP）是第一種在體內(nèi)實(shí)施的用于系統(tǒng)鑒定代謝物-蛋白質(zhì)相互作用的方法，它將感興趣的蛋白與生物素標(biāo)簽在體內(nèi)融合表達(dá)，以便從天然裂解液中純化代謝物-目標(biāo)蛋白復(fù)合物，隨后將結(jié)合的代謝物洗脫并使用質(zhì)譜平臺進(jìn)行分析［27］。TAP 與基于LC-MS/MS 的代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，被成功用于鑒定擬南芥中與核苷二磷酸激酶（NDPK）相互作用的多種蛋白質(zhì)和小分子伴侶，包括一些極性代謝物［28］。類似的策略還被用于系統(tǒng)篩選與START 結(jié)構(gòu)域蛋白相關(guān)的內(nèi)源性小分子，該技術(shù)促進(jìn)了兩種尚未確定功能的START 結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白質(zhì)配體的發(fā)現(xiàn)［29］。

雖然TAP 方法的準(zhǔn)確性較高，但由于涉及在植物體內(nèi)表達(dá)融合蛋白導(dǎo)致通量很低。另一種技術(shù)——天然質(zhì)譜法（Native MS）無需在植物體內(nèi)表達(dá)融合蛋白，便可以檢測與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的配體，從復(fù)雜的化合物庫中篩選蛋白底物。其原理大致為將目標(biāo)蛋白與天然粗提物一起孵育，隨后進(jìn)行快速凝膠過濾以純化蛋白質(zhì)-代謝物復(fù)合物，在天然質(zhì)譜分析時(shí)，利用一級質(zhì)譜（MS1）選取完整的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物，通過多級碰撞誘導(dǎo)解離（MSn）對配體進(jìn)行釋放、片段化和分析，將譜圖與代謝組數(shù)據(jù)庫比對以實(shí)現(xiàn)鑒定。由于多個(gè)配體在同一位點(diǎn)競爭結(jié)合靶標(biāo)，因此更容易發(fā)現(xiàn)具有最高親和力或濃度的化合物，這一原理表明天然MS 不但能用于胞內(nèi)PMI 的分析，還能從眾多植物天然產(chǎn)物中高通量地篩選先導(dǎo)化合物，此外，天然MS 還可以提供相互作用的組成、化學(xué)計(jì)量、熱力學(xué)和動力學(xué)常數(shù)等重要信息［30］。Nguyen 等［31］從來自紅洋蔥皮、紅三葉草、歐芹、桉樹葉和橙皮的數(shù)千種天然產(chǎn)物粗提物中篩選出碳酸酐酶（CA）同工酶的14 種小分子結(jié)合物，它們大部分屬于黃酮類化合物，其中有12 種曾被報(bào)道為一種CA 同工酶的抑制劑，還鑒定了一種新的CA 同工酶配體Ambocin。在蛋白與配體結(jié)合前對混合天然產(chǎn)物進(jìn)行液相分離有助于降低天然產(chǎn)物庫的復(fù)雜度，而在實(shí)際應(yīng)用中，由于UHPLC 流動相的酸性條件和高有機(jī)溶劑含量，不利于蛋白質(zhì)與配體的非共價(jià)結(jié)合，是天然MS 應(yīng)用的一大瓶頸。Daniel Petras 團(tuán)隊(duì)近期對這一方法進(jìn)行了改進(jìn)，首先通過低pH、高有機(jī)溶劑含量的液相條件對混合的天然化合物庫進(jìn)行分離，隨后增加柱后流動相的pH、值和水含量，并在ESI 源前注入待測結(jié)合蛋白，結(jié)合并行的非靶向代謝組學(xué)分析，可以對這些結(jié)合的天然代謝物進(jìn)行鑒定，他們利用這一技術(shù)從海洋藍(lán)藻群落中鑒定糜蛋白酶的天然抑制劑，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)高效蛋白酶抑制劑家族的靶向分離和結(jié)構(gòu)闡析，并將該抑制劑家族命名為Rivulariapeptolides［32］。

1.3 全局互作組分析（Global analysis of all proteinmetabolite interactions,PROMIS）

上述兩類方法僅限于圍繞某個(gè)指定的感興趣小分子或蛋白質(zhì)為中心展開分析，因此不適用于對相互作用組進(jìn)行全局范疇的研究。針對這一限制，Ewelina 等提出一種名為PROMIS（Proteinmetabolite interactions using size separation）的新策略，用于擬南芥的互作組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了多種新的相互作用，且得到AP-MS（Affinity purification mass spectrometry）的驗(yàn)證［33］。PROMIS 方法旨在對天然裂解物內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-代謝物復(fù)合物進(jìn)行全局分析，且無需對任何小分子或蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，其原理大致為：將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-小分子復(fù)合物通過尺寸排阻色譜法進(jìn)行分餾，對各餾分分別進(jìn)行代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量分析，以色譜共流出作為依據(jù)來推定相互作用關(guān)系。但“共流出”僅是存在相互作用的線索而非證據(jù)，通常每種代謝物會與數(shù)百種蛋白質(zhì)共流出，而實(shí)際上可能只與其中一種蛋白真正地結(jié)合，因此PROMIS 應(yīng)被視為一種發(fā)現(xiàn)工具，用于繪制相互作用組圖，但還必須結(jié)合正交方法來定義復(fù)合物的確切組成。這與基因表達(dá)研究類似，多個(gè)PROMIS 數(shù)據(jù)集的整合具有更高的可信度，如將尺寸過濾與離子交換色譜相結(jié)合，首先根據(jù)尺寸排阻色譜法分離蛋白質(zhì)-代謝物復(fù)合物，取得一組PROMIS 數(shù)據(jù)集，隨后將感興趣代謝物所在的餾分經(jīng)離子交換進(jìn)行進(jìn)一步分離，取得正交的PROMIS 數(shù)據(jù)集，二者組合可用于蛋白質(zhì)配體的高可信度鑒定。

2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）

蛋白質(zhì)很少單獨(dú)發(fā)揮作用，而是與其他蛋白質(zhì)組成復(fù)合物或相互作用來發(fā)揮大部分生物學(xué)功能［34］。一般來說，PPI 大致可以分為兩種類型，即構(gòu)成型和調(diào)節(jié)型［35］。構(gòu)成型PPI 非常牢固，主要形成永久性復(fù)合物的亞基，很容易通過體內(nèi)和體外的方法檢測。而調(diào)節(jié)型PPI 作為生化級聯(lián)反應(yīng)的一部分，僅發(fā)生在特定的細(xì)胞或環(huán)境狀態(tài)下，通常對調(diào)節(jié)刺激非常敏感，在大多數(shù)情況下是弱和短暫的，對這類相互作用的研究更具挑戰(zhàn)性［36］。

2.1 親和純化質(zhì)譜（Affinity purification mass spectrometry,AP-MS）

AP-MS 是一種快速、選擇性和靈敏的工具，用于檢測近生理?xiàng)l件下感興趣的蛋白（誘餌）和相互作用伙伴（獵物）之間的相互作用［37］。與免疫沉淀（IP）相似，AP-MS 可以使用抗體靶向誘餌蛋白，從而在天然條件下從細(xì)胞裂解物中捕獲蛋白質(zhì)復(fù)合物。然而，靶向植物蛋白的抗體有限，還存在屏蔽誘餌蛋白相互作用位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，因此，基于親和力的AP-MS 技術(shù)將誘餌蛋白與親和標(biāo)簽融合，利用親和富集的方法將誘餌與其相互作用的復(fù)合物一起純化，洗滌除去非特異性結(jié)合的蛋白，蛋白質(zhì)復(fù)合物被洗脫進(jìn)行LC-MS/MS分析［38］。最初的AP-MS 采用單步純化法，導(dǎo)致大量與固相支持物、親和試劑或表位標(biāo)簽相互作用的假陽性獵物蛋白被鑒定，為提高準(zhǔn)確性，需要大量統(tǒng)計(jì)測試和陽性對照［39-40］。針對這一問題，最新的串聯(lián)親和純化質(zhì)譜（TAP-MS）技術(shù)利用2個(gè)不同的表位標(biāo)簽與誘餌蛋白融合，通過在接近生理?xiàng)l件的兩步親和純化以更大限度地去除假陽性蛋白［37］。

AP-MS 可用于研究相關(guān)生物環(huán)境中的植物特定器官的生長發(fā)育，如花、葉和根，提供蛋白質(zhì)復(fù)合物組成信息［41-43］，此外，AP-MS 可以深入了解由翻譯后修飾所調(diào)節(jié)的空間或時(shí)間依賴性相互作用［44］。一種用于擬南芥植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的 TAP 技術(shù)可以在較低樣品量下對蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行高通量鑒定［37］。也有TAP 技術(shù)將黃色熒光標(biāo)簽與鏈霉親和素結(jié)合肽標(biāo)簽相結(jié)合，除能鑒定蛋白復(fù)合物外，還可以確定蛋白在體內(nèi)的亞細(xì)胞定位，擴(kuò)大了雙親和標(biāo)簽的用途［45］。TAP-MS可助力植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究工作，如鑒定茉莉酸途徑中的NINJA 及RING E3 連接酶的相關(guān)蛋白［46-47］、油菜素類固醇信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子BZR1 的相關(guān)蛋白［48］、生長素轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)磷酸酶2A 的相關(guān)蛋白ROTUNDA3 等［49］。最近的工作將AP-MS 與非標(biāo)（Label-free）定量蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，以解析擬南芥中獨(dú)腳金內(nèi)酯途徑的動態(tài)性質(zhì)，證明該方法以時(shí)間分辨率表征蛋白質(zhì)伙伴交換的潛力［50］。

2.2 鄰近標(biāo)記法（Proximity labeling mass spectrometry,PL-MS）

植物信號通路中各組分之間的調(diào)節(jié)型PPI 往往是瞬時(shí)和動態(tài)的［51］。了解這些瞬時(shí)和動態(tài)PPI是研究植物信號網(wǎng)絡(luò)的主要挑戰(zhàn)之一。Co-IP 和AP-MS 需要在細(xì)胞裂解后捕獲PPI，這會導(dǎo)致一些瞬時(shí)的、弱的相互作用被破壞，另外，在全細(xì)胞裂解液中，一些處于不同亞細(xì)胞區(qū)室的蛋白會產(chǎn)生生理?xiàng)l件下不存在的相互作用，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果［52］，導(dǎo)致經(jīng)典PPI 技術(shù)在植物脅迫響應(yīng)系統(tǒng)研究中的進(jìn)一步應(yīng)用受到很大阻礙。

適用于體內(nèi)PPI 分析的鄰近標(biāo)記技術(shù)（PLMS）已成為一種新的替代方法，可以克服上述問題并保留有關(guān)相互作用的空間信息［52］。例如，在鄰近依賴性生物素標(biāo)記（BioID）中，誘餌蛋白與非特異性生物素連接酶（如BirA）在胞內(nèi)融合表達(dá)，這種酶可以在10 nm 半徑內(nèi)對接近誘餌（相互作用）的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)生物素化修飾，由于該反應(yīng)僅發(fā)生在活細(xì)胞中，故排除了在細(xì)胞裂解后發(fā)生的生理?xiàng)l件下不存在的相互作用，生物素化的互作蛋白可被鏈霉親和素富集，以便免疫印跡或質(zhì)譜鑒定［52］。

PL-MS 已在哺乳動物細(xì)胞和微生物的PPI 研究中有大量應(yīng)用案例，但在植物中的應(yīng)用較為滯后。主要難點(diǎn)在于鄰近標(biāo)記使用的大多數(shù)酶最適溫度為37 ℃，而這一溫度不利于大部分植物的生長［53］。另一方面，雖然植物細(xì)胞能合成生物素，但其豐度不足以進(jìn)行酶促的生物素化標(biāo)記，因此生物素連接酶蛋白表達(dá)水平、外源生物素濃度和孵育時(shí)間等都需要優(yōu)化，第1 種在植物中建立的PL-MS 技術(shù)基于BioID，被應(yīng)用于水稻原生質(zhì)體，鑒定與植物營養(yǎng)生長有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子OsFD2 的相互作用蛋白和鄰近蛋白［54］，以及控制籽粒大小的GS3 蛋白的互作蛋白［55］。Zhang等用新一代TurboID 識別植物免疫受體N 的相互作用子，發(fā)現(xiàn)一種新的泛素蛋白連接酶E3 的組件N-Recognin 7 充當(dāng)調(diào)節(jié)劑，它直接與免疫受體N 相互作用，介導(dǎo)免疫受體導(dǎo)對植物病原體的免疫［56］。類似技術(shù)還被應(yīng)用于識別氣孔特異性轉(zhuǎn)錄因子FAMA 的伙伴，并幫助獲得擬南芥幼苗幼小保衛(wèi)細(xì)胞的核蛋白質(zhì)組，為未來開展空間分辨相互作用組學(xué)研究提供關(guān)鍵的技術(shù)框架［57］。迄今，PL-MS 已成功應(yīng)用于水稻、番茄、煙草和擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的多個(gè)相互作用蛋白質(zhì)組研究，還能有效捕獲膜相關(guān)蛋白的相互作用［58］。

2.3 交聯(lián)質(zhì)譜法（Cross-linking mass spectrometry,XL-MS）

由于AP-MS 和PL-MS 都需要將感興趣的蛋白與標(biāo)簽或酶進(jìn)行融合表達(dá)，導(dǎo)致分析通量受限，這意味著要想實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)組范圍PPI 網(wǎng)絡(luò)的剖析，需要對大量誘餌蛋白進(jìn)行迭代標(biāo)記，工作量非常繁重。為了在全細(xì)胞范圍表征PPI，新興技術(shù)交聯(lián)質(zhì)譜（XL-MS）顯示了廣闊的應(yīng)用前景，該方法利用小分子交聯(lián)劑將相互作用蛋白質(zhì)的近端氨基酸（～30 ?）進(jìn)行共價(jià)連接，使得質(zhì)譜能同時(shí)鑒定相互作用的蛋白質(zhì)和交聯(lián)位點(diǎn)［59］。XL-MS 代表一種在全局層面定義PPI 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的高通量方法，其結(jié)果除用于PPI 映射外，獲取的接觸位點(diǎn)信息還可用于驗(yàn)證和微調(diào)現(xiàn)有蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息［60］。從問世至今，XL-MS 在多個(gè)方面得到增強(qiáng)。首先是MS 可裂解交聯(lián)劑及不斷革新的演算法［61-62］，允許使用多級MS（MSn）有效選擇交聯(lián)肽對，以便通過MS3可靠識別每個(gè)交聯(lián)肽，快速準(zhǔn)確鑒定交聯(lián)肽，使其能夠應(yīng)用在組學(xué)級別的PPI 映射中，且更有利于闡明蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；其次是具有富集能力的交聯(lián)劑顯著提高了復(fù)雜混合物中低豐度交聯(lián)肽的可檢測性［63］，具有膜通透性的交聯(lián)劑使得XL-MS 被成功應(yīng)用于獲得活體細(xì)胞中PPI 全局景觀［64］以及超高效交聯(lián)劑［65］等。目前最先進(jìn)的交聯(lián)劑Azide-A-DSBSO 和Alkyne-A-DSBSO 兼具膜滲透性、可富集性和MS 可裂解性，均帶有一個(gè)小生物正交反應(yīng)基團(tuán)，允許以“點(diǎn)擊化學(xué)”進(jìn)行生物素綴合以富集交聯(lián)肽；還具有兩個(gè)對稱的含亞砜的MS 可裂解鍵，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的交聯(lián)分離和鑒定；此外，通過去除生物素手柄、加入酸可裂解位點(diǎn)，提高了交聯(lián)恢復(fù)和識別，這種方法可用于在體內(nèi)外對任何生物體和樣品開展蛋白質(zhì)組范圍的PPI研究［64］。另外，XL-MS 技術(shù)可以與基于TMT 的標(biāo)記技術(shù)或無標(biāo)記方法進(jìn)行定量交聯(lián)分析，用于探測PPI 在不同生理?xiàng)l件下或時(shí)程中的變化。

雖然XL-MS 已廣泛應(yīng)用于哺乳動物系統(tǒng)，但其在植物中的應(yīng)用因細(xì)胞壁的存在而受到一定限制，近年來隨著交聯(lián)劑種類的增多，植物活體XL-MS 研究成為可能，如高滲透性、酸可裂解的疊氮標(biāo)簽修飾二琥珀酰亞胺庚二酸酯（AMDSP）實(shí)現(xiàn)了擬南芥植物XL-MS 定量蛋白質(zhì)組分析，識別出354 種獨(dú)特的交聯(lián)肽［66］。最近有研究將體外交聯(lián)與磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析相結(jié)合，以在空間上解析擬南芥TOR 途徑的244 種底物，這種XL-MS 與PTM 的結(jié)合分析將為繪制植物系統(tǒng)基本信號網(wǎng)絡(luò)提供新的強(qiáng)大工具［67］。

3 結(jié)語與展望

蛋白質(zhì)-代謝物相互作用（PMI）、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）的發(fā)現(xiàn)和表征為研究特定代謝物、蛋白質(zhì)的生物活性提供了非常有價(jià)值的信息，有助于我們深入了解生命活動的調(diào)節(jié)過程。組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜儀的應(yīng)用先后建立了多種表征不同類型相互作用的技術(shù)，它們在植物研究領(lǐng)域也展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力，本文對這些蛋白質(zhì)互作組學(xué)分析技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)作了介紹。在實(shí)際應(yīng)用中，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇適宜的分析技術(shù)，有以下幾個(gè)因素可供參考：首先是考慮相互作用的類型，有較穩(wěn)固的結(jié)合，也有弱的、瞬態(tài)的相互作用，研究者可根據(jù)所研究的互作類型選擇合適的方法；其次，除對相互作用伙伴進(jìn)行鑒定外，相互作用的其他特征（時(shí)空信息、互作模式、結(jié)合序列、親和力等）對功能研究也同樣很重要，也應(yīng)根據(jù)這些信息需求選擇適宜的分析方法；最后，有些研究有預(yù)先確定的感興趣代謝物或蛋白質(zhì)，有些研究旨在繪制全局性的相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究者需要在鑒定的準(zhǔn)確性、通量和規(guī)模之間做出取舍。

對于未來的植物蛋白質(zhì)互作組學(xué)研究的發(fā)展，一些關(guān)鍵技術(shù)瓶頸仍有待克服：一是鑒于各類植物組織的異質(zhì)性，應(yīng)重視樣品制備程序，如合適的緩沖液、pH 水平、表面活性劑、輔因子、處理?xiàng)l件等，以確保蛋白質(zhì)質(zhì)量和正確構(gòu)象；二是目前的活性提取方法均較為溫和，大多數(shù)膜結(jié)合蛋白被排除在外，應(yīng)盡可能多地納入膜結(jié)合蛋白，這能增加相互作用組的覆蓋范圍和深度；三是迄今為止，大多數(shù)非模式植物的數(shù)據(jù)庫尚未建立或注釋嚴(yán)重不足，應(yīng)積極共享各類植物的蛋白質(zhì)及代謝物數(shù)據(jù)庫；四是在多種植物體系建立融合蛋白表達(dá)技術(shù)體系，這在很多相互作用分析技術(shù)中都是重要環(huán)節(jié)；五是生物體內(nèi)驗(yàn)證和功能評估對于排除假陽性互作至關(guān)重要，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)較為繁瑣和低通量，是隨著效率提升的一大瓶頸。

相信在不久的將來，蛋白質(zhì)互作組學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確性、效率、通量的提升，將極大地增加PMI、PPI 的鑒定數(shù)目，越來越多地應(yīng)用于植物研究中，推動新型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及代謝調(diào)控通路的解析、新型除草劑或殺蟲劑研發(fā)、分子設(shè)計(jì)育種等基礎(chǔ)研究的開展。