多花黃精組培快繁技術(shù)優(yōu)化

黃碧華

(福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心，福建 南靖 363600)

多花黃精(Polygonatumcyrtonema)系百合科黃精屬多年生草本植物，集食用、藥用、觀賞于一身。黃精屬的種和品種很多，作為中藥使用的有黃精、滇黃精、多花黃精，以多花黃精品質(zhì)最佳。黃精主要含多糖、低聚糖、黃酮、蒽醌、皂苷、木脂素等化合物，性平、味甘，為滋補(bǔ)上品，具有滋陰潤(rùn)燥、補(bǔ)腎益精、提高人體免疫力、抗衰老等功效[1-3]。隨著黃精市場(chǎng)需求量的增長(zhǎng)，規(guī)范化人工栽培勢(shì)在必行，但黃精種苗問(wèn)題成為限制人工大面積栽培的瓶頸，多年來(lái)，人工栽培黃精塊莖繁殖生長(zhǎng)慢、成活率低，限制了黃精的生產(chǎn)規(guī)模，而傳統(tǒng)的種子繁殖，萌芽能力低且容易變異。因此，組培技術(shù)成為生產(chǎn)黃精優(yōu)良種苗的有效途徑，有關(guān)黃精包括多花黃精的組培快繁技術(shù)已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道[1-10]，但是已有研究結(jié)果得出的組培過(guò)程各種培養(yǎng)基的配置方案相差較大，在快繁生產(chǎn)上有的生根效果差甚至不可用，可能與外植體的種質(zhì)材料及其取材部位、組培室條件等有關(guān)。為此，借鑒已有黃精組培快繁中各種培養(yǎng)基植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如6-BA、NAA、2，4-D、GA，TDZ 、kT等不同濃度配比的可行性和局限性，針對(duì)福建省多花黃精的種質(zhì)資源及其藥用特性以及組培室條件等因素，針對(duì)性開(kāi)展外植體消毒及組培各個(gè)環(huán)節(jié)的培養(yǎng)基配置改進(jìn)與優(yōu)化試驗(yàn)，建立優(yōu)化組培技術(shù)體系，為多花黃精種苗工廠化育苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

于2020年，在福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心南靖縣五板橋試驗(yàn)基地，選取2年生多花黃精芽眼飽滿(mǎn)的地下莖塊為外植體材料。

1.2 試驗(yàn)方法

各基本培養(yǎng)基均加入蔗糖25 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH值5.5～5.8。培養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2) ℃，前7 d進(jìn)行弱光培養(yǎng)，7 d后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000～5000 lx，光照時(shí)間10～16 h·d-1。

1.2.1 外植體污染控制方案優(yōu)化試驗(yàn) 采用雙因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置因素A：0.1%氯化汞、0.15%氯化汞2個(gè)水平，因素B：浸泡消毒外植體時(shí)間2、4、6、8、10、12 min共6個(gè)水平，組成12個(gè)處理組合，每處理共30個(gè)塊莖。

將多花黃精地下塊莖去除泥土和根系及葉片，用清水刷洗干凈，切取當(dāng)年生長(zhǎng)較嫩且?guī)а垦鄣膲K莖長(zhǎng)約3～5 cm，按組培常規(guī)方法用70%～75%的酒精浸泡20 s，無(wú)菌水沖洗后[1-2]，按試驗(yàn)方案投入相應(yīng)的氯化汞溶液消毒處理。之后，將消毒后的外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2，4-D 0.5 mg·L-1)上進(jìn)行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)，30 d后調(diào)查記錄各處理的污染、死亡情況。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) 采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)因素A(基本培養(yǎng)基)：B5、1/2 MS和MS，因素B(6-BA)：0.5、0.8、1.6 mg·L-1，因素C(NAA)：0.3、0.6、0.9 mg·L-1，因素D(2，4-D)：0.2、0.5、1.0 mg·L-1，共9個(gè)處理組合，每處理30瓶，每瓶1個(gè)小塊莖。誘導(dǎo)培養(yǎng)40 d后調(diào)查記錄不定芽萌芽數(shù)。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) 試驗(yàn)采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，設(shè)因素A：基本培養(yǎng)基WPM、1/2 MS和MS 3個(gè)水平；因素B：6-BA 0.6、1.2、2.4 mg·L-13個(gè)水平；因素C：GA 1、2、3 mg·L-13個(gè)水平；因素D：NAA 0、0.2、0.8 mg·L-13個(gè)水平，共9個(gè)處理組合，每處理30個(gè)帶芽小塊莖。培養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度4000～6000 lx，光照時(shí)間12～14 h·d-1。培養(yǎng)50 d后，觀察并統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖生長(zhǎng)數(shù)[3-4]。

1.2.4 生根培養(yǎng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比優(yōu)化試驗(yàn) 采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，設(shè)因素A：IBA 0.2、0.4、0.8 mg·L-13個(gè)水平；因素B：NAA 0.2、0.5、1.0 mg·L-1；因素C：AC 0、0.3、0.6 mg·L-1，共9個(gè)處理組合，每處理30個(gè)不定芽(有3～4片葉)進(jìn)行生根培養(yǎng)試驗(yàn)?；九囵B(yǎng)基均為1/2 MS，培養(yǎng)40 d后，記錄各處理的根長(zhǎng)情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

按公式：萌發(fā)率(%)=萌芽數(shù)量(個(gè))/樣本數(shù)量(個(gè))×100%[1-2]，計(jì)算外植體萌發(fā)率。采用Excel 2003軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化汞濃度及消毒時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)的影響

由表1可知，外植體不同消毒處理方法，污染數(shù)量、萌芽率相差較大。方差分析結(jié)果表明，氯化汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%與0.15%的消毒效果沒(méi)差異(f=2.6650，P=0.1156)，即0.10%和0.15%的氯化汞都可以用來(lái)外植體消毒，但是不同消毒時(shí)間(f=22.8970**，P=0.0001)以及氯化汞濃度與消毒時(shí)間的互作效應(yīng)(f=32.6630**，P=0.0001)差異達(dá)極顯著水平。從消毒時(shí)間看，在氯化汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%或0.15%下，外植體消毒時(shí)間在6～10 min較適宜，當(dāng)消毒時(shí)間5 min時(shí)，真菌污染較嚴(yán)重；而無(wú)論質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%或0.15%的氯化汞，若處理時(shí)間超過(guò)12 min，則外植體出現(xiàn)發(fā)黑死苗的現(xiàn)象嚴(yán)重。整體趨勢(shì)是氯化汞濃度高則消毒時(shí)間短些；濃度低則消毒時(shí)間相應(yīng)長(zhǎng)些。對(duì)各處理組合的萌芽率進(jìn)行差異性LSD多重比較表明，第5組和第10組的消毒效果最佳，即0.10%氯化汞消毒10 min或0.15%氯化汞消毒8 min，萌芽率達(dá)到40.0%～46.67%，極顯著高于其它處理組合。該優(yōu)化消毒方案，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后，可以看到基部膨大鼓起，綠色愈傷膨大明顯；在培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至40 d，可觀察到基部小芽點(diǎn)已經(jīng)開(kāi)始萌動(dòng)，并分化出不定芽。

表1 外植體消毒處理試驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同基本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

從表2看出，不同處理組合的萌芽率相差較大，其中誘導(dǎo)不定芽數(shù)量最多的是處理2，平均17個(gè)，平均萌芽率56.67%；其次是處理3，平均萌芽率46.67%；其余處理誘導(dǎo)的不定芽數(shù)均較少。方差分析及多重比較結(jié)果表明，各因素對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)均有顯著或極顯著的影響(F基本培養(yǎng)基=4.1836*，P=0.0483；F6-BA=10.6127**，P=0.00053；FNAA=11.9501**，P=0.0041；F2，4-D=6.1902*，P=0.0101)，各因素均以2水平的萌芽率最高且顯著或極顯著高于相應(yīng)因素的其它水平。結(jié)合極差值大小判斷，4個(gè)因素對(duì)多花黃精誘導(dǎo)萌芽的影響力的大小順序?yàn)椋?-BA>NAA>2，4-D>基本培養(yǎng)基，即6-BA和NAA在誘導(dǎo)不定芽萌芽中起了主要作用。綜合上述分析結(jié)果，不定芽誘導(dǎo)數(shù)以處理2為最佳，即多花黃精誘導(dǎo)初代的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2，4-D 0.5 mg·L-1。

表2 不同基本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2.3 不同基本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)增殖倍數(shù)的影響

由表3可知，9種處理組合都能使黃精塊莖發(fā)芽生長(zhǎng)，在細(xì)胞分裂素(6-BA)較低的情況下，以8號(hào)處理不定芽長(zhǎng)勢(shì)最好，增殖倍數(shù)達(dá)5.3，基部愈傷膨大明顯、叢芽多、苗綠、健壯；在細(xì)胞分裂素(6-BA)較高的情況，3號(hào)和6號(hào)處理的平均增殖倍數(shù)比7號(hào)、8號(hào)低；在低濃度的NAA生長(zhǎng)素情況下，1號(hào)、5號(hào)處理的增殖效果較差。經(jīng)方差分析及多重比較結(jié)果表明，8號(hào)處理，即MS+6-BA 1.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1的增殖效果最佳，增殖倍數(shù)顯著或極顯著高于其它處理組合。相比之下該組合更適合多花黃精的繼代增殖培養(yǎng)，即在適當(dāng)?shù)募?xì)胞分裂素(6-BA)和生長(zhǎng)素(GA+NAA)的配置下，誘導(dǎo)的愈傷組織可分化出嫩芽，而過(guò)高的6-BA分裂素誘導(dǎo)的愈傷組織無(wú)法分化出不定芽，這與有關(guān)報(bào)道[11-13]一致。

表3 不同基本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)增殖倍數(shù)的影響

2.4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)組培生根的影響

由表4看出，不同處理組合的生根數(shù)和生根率相差較大。以生根率為指標(biāo)，方差分析及其多重比較結(jié)果表明，IBA不同水平間的生根率沒(méi)有差異(FIBA=1.1312，P=0.3445)；即IBA在0.2～0.8 mg·L-1范圍內(nèi)對(duì)生根沒(méi)有影響。而NAA、AC在不同水平間的生根率均達(dá)顯著或極顯著差異水平(FNAA=20.7384，P=0.0001；FAC=4.1902，P=0.0321)，NAA為1.0 mg·L-1時(shí)生根率最高；AC為0.3、0.6 mg·L-1時(shí)生根率最高，且兩水平間的生根率沒(méi)有差異。不同處理組合間，以處理7，即1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+AC 0.3 mg·L-1的生根數(shù)和生根率最高，分別為5.62條和97.62%，顯著或極顯著高于其它組合，是多花黃精誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基配方。

表4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)生根的影響

3 結(jié)論與討論

通過(guò)多花黃精組培優(yōu)化試驗(yàn)，建立了組培快繁技術(shù)體系：多花黃精外植體的優(yōu)化消毒方案為0.15% HgCl2消毒8 min或0.10% HgCl2消毒10 min；啟動(dòng)誘導(dǎo)的優(yōu)化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2，4-D 0.5 mg·L-1；最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1，繼代增殖倍數(shù)達(dá)到5.3以上；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+AC 0.3 mg·L-1，生根率達(dá)97.62%，平均根數(shù)為5.62條。

細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)黃精組培苗生長(zhǎng)具有顯著影響，已有研究表明6-BA的最佳濃度為1.0～4.0 mg·L-1之間[10，15]，本研究得出多花黃精的增值培養(yǎng)基添加6-BA的最佳濃度為1.2 mg·L-1，與劉芳源等[11]認(rèn)為6-BA最佳濃度為1.0 mg·L-1比較接近。此外，本試驗(yàn)認(rèn)為啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基同時(shí)添加適量的6-BA與NAA、2，4-D配合效果比劉紅美等[9-12]認(rèn)為6-BA與2，4-D配比以及周建金等[5、13-15]認(rèn)為6-BA與NAA配比的更優(yōu)，更有利于多花黃精組培苗的誘導(dǎo)、增值培養(yǎng)。

另外，在本試驗(yàn)及前期組培過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)在生根時(shí)加入適量配比的萘乙酸和活性炭，基部的莖塊明顯，根系都從莖塊發(fā)根，后期可以嘗試在組培試驗(yàn)室直接把生根苗基部的莖塊培養(yǎng)到2～3 cm，這有利于種植的成活率和節(jié)省戶(hù)外的管理時(shí)間，從而降低種植養(yǎng)護(hù)的成本，也就是說(shuō)如果能使黃精在生根的過(guò)程中地下莖同時(shí)生長(zhǎng)，那么得到的種苗在來(lái)年的春季就可移栽入大田使其直接生長(zhǎng)。