乳蛋白對甜菜紅苷熱穩(wěn)定性的影響

蘆霞，胡飛

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510640）

甜菜色素（Betalain）是一種含氮水溶性色素，主要存在于藜科、莧科、紫茉莉科以及仙人掌科等多種植物中[1]。其中，人們最為熟悉的植物是藜科中的紅甜菜及仙人掌科的火龍果皮和果肉。甜菜色素屬于吡啶類衍生物，基本發(fā)色團是1，7-二偶氮庚甲堿，其顏色由1，7-二偶氮庚甲堿共振所產(chǎn)生。甜菜色素主要包含甜菜紅素（Betacyanin）和甜菜黃素（Betaxanthin）兩大類，其中甜菜紅素的主要成分為甜菜紅苷（Betanin，Bt，分子式C24H26N2O13）[2]。甜菜紅苷是從紅甜菜根中提取出的成分，被歐盟批準(zhǔn)為紅色食品著色劑，被廣泛用作果醬、冰激凌、蛋糕、酸奶等食品著色[3-4]。目前，因甜菜紅苷安全無毒[2]且具有抗炎[5-6]、護肝[7-9]、降血壓[10-12]、降血脂[13-14]等特性，而獲得研究人員的廣泛關(guān)注[15]。雖然甜菜紅苷具有諸多有益特性，但是其易受溫度、酸堿度、光、氧氣等因素的影響，穩(wěn)定性較差[16]。國內(nèi)外研究者通過形成絡(luò)合物[17]、微膠囊化[18]等嘗試改善甜菜紅苷的穩(wěn)定性，然而，形成的絡(luò)合物易分解，降低了甜菜紅苷的長期護色效果。微膠囊化也有明顯的局限性，有的壁材對pH 值有極強的依賴性，且在合成中可能引入對人體有害的物質(zhì)，這些限制了甜菜紅苷的深入開發(fā)和應(yīng)用[19]。

通過生物大分子與甜菜紅苷相互作用來保護甜菜紅苷是一種良好的思路和技術(shù)途徑。在食品大分子中脂類溶解性不好，多糖類消化性較差，而蛋白質(zhì)具有兩親性、消化性好等優(yōu)點，利用蛋白質(zhì)與小分子相互作用來實現(xiàn)保護小分子的活性，是目前研究的熱點之一[19]。目前對蛋白質(zhì)與花青素結(jié)合方面的研究已較為成熟[20-21]，而對于蛋白質(zhì)與甜菜紅苷相互作用的研究較少。本文采用乳蛋白中的乳清蛋白（Whey Protein，WP）和牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）分別與甜菜紅苷作用，研究生成的復(fù)合物中乳蛋白組分對甜菜紅苷熱穩(wěn)定性的影響，并用熒光光譜（MFS）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）以及圓二色光譜（CD）分析甜菜紅苷與乳清蛋白和牛血清白蛋白的作用機制，乳蛋白與甜菜紅苷復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征及構(gòu)型。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甜菜紅苷、牛血清白蛋白，生物技術(shù)級，阿拉丁試劑有限公司；乳清蛋白，麥克林試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸，以上均為AR 級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Nicolet IS50 -Nicolet Continuum 型傅里葉變換紅外光譜儀，Thermo Fisher Scientific 公司；F-7000 分子熒光儀，日立高新技術(shù)公司；Chirascan 型圓二色光譜儀，英國Applied Photophysics公司；雷磁PXSJ-226 型離子計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；722N 可見分光光度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FDU-2110 冷凍干燥機，杭州嘉維創(chuàng)新科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 熱穩(wěn)定性分析

1.2.1.1 溫度對甜菜紅苷穩(wěn)定性的影響 稱取適量的甜菜紅苷（Bt）溶于pH6.3 的PBS 緩沖液中，得到質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 的Bt 溶液，將50，100，150 mg 乳清蛋白（WP）和牛血清白蛋白（BSA）分別溶于上述PBS 緩沖液中，得到質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，1.5 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液。將配好的Bt 溶液和蛋白質(zhì)溶液在常溫下按體積比1∶1 混合，渦旋振蕩20 min 使其混合充分，然后，分別在不同溫度（35，45，55，65，75 ℃）下水浴加熱3 h，用可見分光光度計測定在最大吸收波長535 nm[22]處處理前、后的吸光度，計算甜菜紅苷的保留率。以不加蛋白質(zhì)的Bt 溶液為空白對照。重復(fù)3次試驗，取平均值。

采用高冬菊等[23]的方法計算色素保留率，公式如下：

式中：A——甜菜紅苷處理后的吸光度；A0——甜菜紅苷處理前的吸光度。

1.2.1.2 不同pH 值條件下甜菜紅苷的降解規(guī)律

用0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L NaH2PO4溶液配制母液，氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH 值，最終配成pH 值分別為1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 的緩沖液。稱取適量甜菜紅苷、WP 和BSA 分別溶于上述緩沖液中，以獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.0 mg/mL 的Bt 溶液和1.0 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液。將配好的Bt 溶液和蛋白質(zhì)溶液在常溫下按體積比1∶1 混合，渦旋振蕩20 min，使其混合充分，然后，在65 ℃下避光加熱5 h，每隔1 h 測定各組甜菜紅苷含量變化。以不加蛋白質(zhì)的Bt 溶液為空白對照。每組試驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.2 光譜測試

1.2.2.1 樣品制備 用pH 6.3 的PBS 緩沖液溶解甜菜紅苷，渦旋振蕩10 min，使甜菜紅苷最終質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL。用上述PBS 緩沖液溶解適量的WP 和BSA，以得到最終質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL 的WP 溶液和0.5 mg/mL 的BSA 溶液。

將配好的Bt 溶液和蛋白質(zhì)溶液在常溫下按體積比1 ∶1 混合，渦旋振蕩20 min 使其混合充分，最終樣品中WP 的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，BSA的質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，Bt 的質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL。在溫度4 ℃下避光保存，備用。同時，取部分樣品于冷凍干燥機內(nèi)，設(shè)置預(yù)凍溫度-20 ℃，冷阱溫度低于-40 ℃，凍干48 h，得到Bt-pro 固體樣品。

1.2.2.2 熒光光譜測試 取1.2.2.1 節(jié)樣品3 mL于1 cm 石英比色池中，熒光掃描條件為激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長300～540 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度240 nm/s，電壓700 V。同時，以波長差分別為Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm測定樣品的同步熒光光譜。采用Origin 9.0 軟件分析。

1.2.2.3 傅里葉變換紅外光譜測試 取1.2.2.1 節(jié)經(jīng)冷凍干燥的1 mg 樣品與100 mg KBr 混合，用研缽研細后制得透明樣品薄片，以空白KBr 來調(diào)整基線水平并對差異化光譜進行歸一化處理，以空氣為參比，測定波段為4 000～500 cm-1，掃描32次，采用Omnic 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.2.4 圓二色譜測試 取1.2.2.1 節(jié)1 mL 樣品，稀釋一定倍數(shù)使蛋白質(zhì)量濃度至0.1 mg/mL，吸取300 μL 于1 mm 樣品池中，設(shè)置掃描波長范圍190～260 nm，掃描速度60 nm/min，光譜分辨率0.2 nm，響應(yīng)時間0.25 s，光譜帶寬1.0 nm，重復(fù)掃描3次。采用Pro-Data Viewer 和CDNN 軟件分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成及含量。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)采用單因素方差法分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱穩(wěn)定性

2.1.1 溫度對甜菜紅苷穩(wěn)定性的影響 甜菜紅苷的穩(wěn)定性可用保留率的變化來表示，保留率越高，甜菜紅苷的穩(wěn)定性越好。由圖1 可知，隨著水浴加熱溫度的升高，所有樣品組的甜菜紅苷含量呈下降趨勢，此時甜菜紅苷因受熱而發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成脫羧甜菜紅苷[24]。此外，添加WP 組的保留率明顯高于對照組，而添加BSA 組的效果不明顯，表明WP 能更有效抑制甜菜紅苷的降解，保護其穩(wěn)定性。隨著WP 濃度的增加，其抑制效果變好。在75 ℃加熱3 h 條件下，當(dāng)添加WP 的質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL 時，甜菜紅苷保留率約為對照組保留率的2 倍。

圖1 不同溫度下不同濃度乳蛋白對甜菜紅苷保留率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of milk protein on the retention of Bt at different temperatures

2.1.2 不同pH 值條件下甜菜紅苷的降解規(guī)律研究[25]表明，甜菜紅苷的降解規(guī)律遵循一級動力學(xué)，可用其模擬不同pH 值條件下甜菜紅苷的降解。動力學(xué)公式如下：

式中：C0——甜菜紅苷的初始質(zhì)量濃度（mg/mL）；t——加熱時間（h）；Ct——t 時刻甜菜紅苷的質(zhì)量濃度（mg/mL）；k——速率常數(shù)；t1/2——半衰期（h）。

依據(jù)公式（2）、（3）擬合得出不同pH 值條件下甜菜紅苷及其蛋白復(fù)合物的降解動力學(xué)參數(shù)，見表1。不同pH 條件下甜菜紅苷及其蛋白復(fù)合物的熱穩(wěn)定性不同。隨著pH 值的增大，甜菜紅苷及其蛋白復(fù)合物的降解k 呈先下降后上升的趨勢，表明對甜菜紅苷的破壞程度先減弱后增大，在pH 5.0 時各組樣品的穩(wěn)定性最佳，甜菜紅苷的半衰期最長，其中Bt-WP 復(fù)合物的半衰期達2.99 h。這是由于甜菜紅苷在酸性溶液中加熱或堿性條件下甜菜紅苷會被水解為環(huán)多巴-5-葡萄糖苷和甜菜醛氨酸，而在加熱數(shù)小時后，甜菜醛氨酸的醛基和環(huán)多巴-5-葡萄糖的氨基間發(fā)生親核反應(yīng)，生成相應(yīng)的Schiff 堿，又有部分甜菜紅苷重新生成[24]。甜菜紅苷的重生在pH 5.0 附近最多，這與各組甜菜紅苷在pH=5.0 左右時降解速率k 最小相一致。此外，甜菜紅苷和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后，甜菜紅苷降解得到有效抑制，WP 對甜菜紅苷的保護作用優(yōu)于BSA，這與2.1.2 節(jié)結(jié)果一致。

表1 不同pH 值甜菜紅苷及其蛋白復(fù)合物在65 ℃條件下的降解動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for degradation of Bt and Bt-pro under different pH values at 65°C

2.2 光譜分析甜菜紅苷與蛋白質(zhì)互作

2.2.1 紅外光譜分析結(jié)果 通過FTIR 光譜評價添加蛋白質(zhì)后Bt-pro 復(fù)合物間的相互作用和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化[26]。冷凍干燥后的Bt、蛋白質(zhì)及Bt-WP、Bt-BSA 的FTIR 光譜如圖2 所示。添加蛋白質(zhì)前Bt 在酰胺Ⅱ帶（＜1 548 cm-1）未出現(xiàn)峰值，而加入WP 和BSA 后分別在1 545.18 cm-1和1 545.73 cm-1處出現(xiàn)新峰，推斷形成Bt-pro 復(fù)合物。該復(fù)合物中WP 酰胺Ⅰ帶（1 600-1 700 cm-1）的峰值位置從1 650.23 cm-1移至1 650.16 cm-1，酰胺Ⅱ帶的峰值位置從1 543.96 cm-1移至1 545.18 cm-1，表明Bt 與WP 發(fā)生作用導(dǎo)致C=O、N-H、CN 變化。Bt 組分的結(jié)合使BSA 二級結(jié)構(gòu)發(fā)生類似變化，其酰胺Ⅰ帶的峰值位置從1 657.50 cm-1變到1 655.86 cm-1，酰胺Ⅱ帶1 543.43 cm-1變到1 545.73 cm-1，酰胺A 帶（3 300～3 400 cm-1）范圍的特征峰從3 334.13 cm-1變到3 425.15 cm-1，說明Bt 與BSA 間相互作用導(dǎo)致BSA 中C=O 伸縮振動，N-H 彎曲振動，C-N 伸縮振動發(fā)生改變。

圖2 Bt 與WP、BSA 相互作用的FTIR 光譜Fig.2 The FTIR spectra of WP and BSA in absence and presence of Bt

2.2.2 熒光光譜分析結(jié)果

2.2.2.1 甜菜紅苷含量對蛋白質(zhì)熒光猝滅光譜的影響 蛋白質(zhì)因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基而具有內(nèi)源熒光性[27]。在激發(fā)波長280 nm 處，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要取決于Trp 和Tyr[28]?？筛鶕?jù)熒光強度值的變化來判斷WP和BSA 是否與Bt 發(fā)生相互作用，研究WP 和BSA構(gòu)象的變化以及發(fā)色團附近微環(huán)境的改變。

波長280 nm 處WP 和BSA 的熒光發(fā)射光譜如圖3 所示。WP 的最大熒光發(fā)射波長（λmax）在329 nm 附近，BSA 的λmax在338 nm 附近。在Bt 加入之后，WP 和BSA 的熒光強度均顯著降低，且隨Bt 濃度的增加，WP 的熒光強度從3 827.96 降至1 692.20，BSA 的熒光強度從9 899.83 降至4 062.81，說明甜菜紅苷的加入使WP 和BSA 出現(xiàn)內(nèi)源性熒光猝滅現(xiàn)象，即WP、BSA 分別和Bt 發(fā)生作用。此外，隨著Bt 濃度的增加，WP 的λmax從329 nm紅移到335 nm，BSA 的λmax從338 nm 紅移到342 nm。紅移現(xiàn)象表明WP 和BSA 中Trp 和Tyr 殘基附近的微環(huán)境極性發(fā)生變化。

圖3 Bt 對乳清蛋白（a）及牛血清白蛋白（b）的熒光強度的影響Fig.3 Effect of Bt on the fluorescence intensity of WP（a）and BSA（b）

2.2.2.2 甜菜紅苷對蛋白質(zhì)熒光猝滅方式的影響通過Stern-Volmer 方程可判斷Bt 與蛋白質(zhì)相互作用的猝滅類型[29]：

要以矯正為主要目的，切實推進勞動改造功能回歸，在按體施勞、勞動保護等制度的基礎(chǔ)上，對勞動改造制度進行理性化設(shè)計，從而適應(yīng)罪犯作為人的本質(zhì)需要和重新社會化的需要，充分發(fā)揮勞動改造在矯正罪犯惡習(xí)、培養(yǎng)勞動習(xí)慣、培訓(xùn)勞動技能等方面的作用。

式中：F0——未添加猝滅劑甜菜紅苷時的熒光強度；F——添加猝滅劑甜菜紅苷時的熒光強度；KSV——Stern-Volmer 猝滅常數(shù)（L/mol）；[Q]——甜菜紅苷的濃度（mol/L）；τ0——不存在猝滅劑時熒光分子的平均熒光壽命，一般為10-8s；Kq——生物大分子猝滅速率常數(shù)【L/（mol/s）】。

不同溫度（308.15，318.15，328.15 K）下 的Stern-Volmer 特征參數(shù)見表2。兩種蛋白質(zhì)與Bt相互作用的Stern-Volmer 方程呈良好的線性關(guān)系，表明存在單一的靜態(tài)或動態(tài)猝滅機制[30]。動態(tài)猝滅通過碰撞和擴散形成，導(dǎo)致其猝滅常數(shù)KSV隨溫度的升高而增大；靜態(tài)猝滅是由于分子間的相互作用形成新的復(fù)合物，其猝滅常數(shù)KSV隨溫度的升高而降低[31]。在WP 和BSA 與Bt 相互作用過程中，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)KSV值逐漸降低，表明Bt 通過靜態(tài)猝滅的形式對兩種蛋白質(zhì)的固有熒光進行有效抑制，WP 和BSA 與Bt 形成復(fù)合物。BSA 與Bt 結(jié)合后，猝滅速率常數(shù)Kq遠大于極限擴散速率常數(shù)[2×1010L/（mol/s）]，說明Bt-BSA 復(fù)合物的生成。

表2 不同溫度下Bt-pro 的猝滅常數(shù)Table 2 Quenching constants of Bt-pro at different temperatures

2.2.2.3 甜菜紅苷與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)分析 因Bt 與WP、BSA 之間的猝滅機制為靜態(tài)猝滅，依據(jù)公式[30]（5）分析兩種蛋白質(zhì)在3 個溫度下與Bt 復(fù)合的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）：

式中：Ka——Bt 與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)；n——Bt 與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點數(shù)。

lg[（F0-F）/F]和lg[Q]的雙對數(shù)回歸曲線如圖4所示，根據(jù)回歸曲線的斜率和截距可知復(fù)合物的結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)，見表3。

圖4 Bt 與蛋白質(zhì)相互作用的雙對數(shù)曲線Fig.4 Double logarithmic curve of Bt-pro interaction

由表3 可知，隨著溫度的升高，兩種蛋白質(zhì)與Bt 的結(jié)合常數(shù)Ka均逐漸減小，表明溫度升高不利于蛋白質(zhì)與甜菜紅苷的結(jié)合。當(dāng)溫度為308.15 K時，復(fù)合物Bt-WP 的Ka值高于Bt-BSA，說明此條件下WP 對Bt 的結(jié)合親和力強于BSA，這與WP能有效抑制Bt 的熱降解作用結(jié)果一致。此外，兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合位點數(shù)n 值均在1 附近，表明Bt與WP 和BSA 都只有一個結(jié)合位點，即Bt 與WP和BSA 反應(yīng)后生成物質(zhì)的量比為1∶1 的復(fù)合物。

通過熱力學(xué)方程可以判斷大分子蛋白質(zhì)與Bt小分子間的主要結(jié)合作用力，通過Vant' Hoff 公式（6）、（7）、（8）可計算熱力學(xué)參數(shù)吉布斯自由能變化（ΔG）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）[32]。其中，當(dāng)ΔH＞0 且ΔS＞0 時，為疏水相互作用；當(dāng)ΔH＜0 且ΔS＜0 時，為范德華力和氫鍵作用；當(dāng)ΔH＜0 且ΔS＞0 時，為靜電相互作用；當(dāng)ΔH＞0 且ΔS＜0 時，為靜電力和疏水相互作用[31]。

式中：T——絕對溫度（K）；Ka——與溫度相關(guān)的結(jié)合常數(shù)；R——氣體常數(shù)[8.314 J/（mol·K）]。當(dāng)溫度變化不大時，反應(yīng)的ΔH 和ΔS 可看作常數(shù)。

由表3 可知，Bt-WP 和Bt-BSA 的ΔH 均小于0，且ΔS 均大于0，說明Bt 與WP 及BSA 的分子間作用力主要表現(xiàn)為靜電相互作用。此外，Bt-WP 和Bt-BSA 的ΔH 值分別為-2.4 kJ/mol和-2.1 kJ/mol，表明Bt 與兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)為放熱反應(yīng)；ΔG 均為負值，表明Bt 與兩種蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用均為自發(fā)進行的。

表3 不同溫度下Bt-pro 的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點及熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Binding constants，binding sites and thermodynamic parameters of Bt-pro at different temperatures

2.2.3 甜菜紅苷與蛋白質(zhì)相互作用的同步熒光光譜 Bt 與蛋白質(zhì)相互作用的同步熒光光譜如圖5所示。當(dāng)Δλ=15 nm 時的同步熒光譜圖為Tyr 殘基周圍的微環(huán)境變化，Δλ=60 nm 時所得譜圖為Trp殘基周圍微環(huán)境的變化[33]。如圖5a、5c 所示，當(dāng)Δλ=15 nm 時，固定蛋白質(zhì)濃度，逐漸增加Bt 的濃度，兩種蛋白質(zhì)Tyr 殘基的熒光強度均逐漸降低，WP 和BSA 的λmax均發(fā)生紅移（WP：從292.78 nm變到294.02 nm；BSA：從286.21 nm 變到287.01 nm），表明Tyr 殘基的疏水性減弱，極性變強，Tyr殘基隨Bt 的加入逐漸暴露出來。如圖5b、5d 所示，當(dāng)Δλ=60 nm 時，兩種蛋白質(zhì)Trp 殘基的熒光強度隨Bt 的加入逐漸降低，WP 和BSA 的λmax同樣也發(fā)生紅移（WP：從274.69 nm 變到277.04 nm；BSA：從279.66 nm 變到283.20 nm），說明隨著Bt的加入，Trp 殘基的疏水性減弱，極性逐漸增強。Tyr 殘基和Trp 殘基周圍微環(huán)境的變化表明兩種蛋白質(zhì)的構(gòu)象因與Bt 結(jié)合形成復(fù)合物而改變。

圖5 Δλ=15 nm（a、c）和Δλ=60 nm（b、d）時Bt 與蛋白質(zhì)相互作用的同步熒光光譜圖Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of the interaction between Bt-pro at 15 nm（a，c）and 60 nm（b，d）

2.2.4 甜菜紅苷與蛋白質(zhì)相互作用的圓二光譜蛋白質(zhì)具有圓二色性，不同的構(gòu)象表現(xiàn)出不同的光譜性質(zhì)，通過圓二色譜可以定量分析形成Btpro 復(fù)合物前、后WP 和BSA 二級結(jié)構(gòu)組成類型的變化，進一步驗證Bt 與WP 和BSA 的相互作用。由圖6 和表4 可知，WP 在92 nm 附近有一正峰，在210 nm 處有一負峰，為典型的蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰。形成Bt-WP 復(fù)合物之后，特征峰的強度顯著降低，WP 二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，α-螺旋含量減少，從19.57%降至16.17%；β-折疊含量增加，從31.52%增至33.63%；β-轉(zhuǎn)角含量減少，從16.80%降至15.93%；無規(guī)則卷曲含量增加，從32.12%增至34.28%。BSA 在遠紫外區(qū)表現(xiàn)出兩個明顯的負峰（208 nm 和223 nm），添加Bt 后其特征峰強度降低，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，α-螺旋含量減少，從80.53%降至75.05%；β-折疊含量增加，從2.32%增至3.25%；β-轉(zhuǎn)角含量增加，從10.09%增至10.85%；無規(guī)則卷曲含量增加，從7.06%增至10.85%，說明Bt-pro 復(fù)合物的形成對WP、BSA 的二級結(jié)構(gòu)有很大影響。

表4 WP 和BSA 及其Bt 復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)含量Table 4 Secondary structure analysis of WP and BSA in absence and presence of Bt

圖6 Bt 與WP、BSA 相互作用的圓二色譜圖Fig.6 The CD spectra of WP and BSA in absence and presence of Bt

3 結(jié)論

利用光譜技術(shù)研究甜菜紅苷與WP 和BSA 之間的作用機制，并探究甜菜紅苷及其Bt-pro 復(fù)合物的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明：添加WP 和BSA 能有效抑制甜菜紅苷的熱降解，其中WP 對甜菜紅苷的保護作用優(yōu)于BSA。同時，pH 值的變化對甜菜紅苷的熱降解也有影響，在pH 5.0 時各組樣品中甜菜紅苷的半衰期最長。此外，復(fù)合物中Bt 組分導(dǎo)致WP 及BSA 發(fā)生熒光猝滅，猝滅類型均為靜態(tài)猝滅，Bt 與兩種蛋白質(zhì)均按照1∶1 物質(zhì)的量比形成復(fù)合物，其結(jié)合過程為自發(fā)的放熱反應(yīng)，Bt 與蛋白質(zhì)分子間作用力主要表現(xiàn)為靜電相互作用。形成Bt-pro 復(fù)合物后，WP 和BSA 兩種蛋白質(zhì)中Trp 和Tyr 殘基附近的疏水性減弱，極性增強，殘基周圍微環(huán)境發(fā)生改變。同時，Bt-pro 復(fù)合物的形成導(dǎo)致兩種蛋白質(zhì)在酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的特征峰位置發(fā)生改變，其中WP 的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減少，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加；BSA 的α-螺旋含量減少，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲含量增加。