鎘（Cd）脅迫下蓖麻蛋白質組學篩查及RcBSK7抗性功能研究

趙慧博 趙志強 包春光 溫 琦 李茹鑫 黃鳳蘭

（1. 內蒙古民族大學生命科學與食品學院，通遼 028000；2. 內蒙古民族大學農學院，通遼 028000；3. 通遼市農畜產(chǎn)品質量安全中心，通遼 028000；4. 蓖麻育種國家民委重點實驗室，通遼 028000；5. 內蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術研究中心，通遼 028000；6.內蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點實驗室，通遼 028000）

全國土壤污染狀況調查表明，重金屬無機污染物超標點位數(shù)占全部超標點位的82.8%，其中重金屬鎘（Cd）點位超標率約7.0%，成為最高無機污染物，這引起人們對土壤中重金屬Cd 污染更廣泛的關注［1］。植物長期生長在Cd 脅迫下，會加速細胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成從而破壞氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)［2-3］；通過抑制葉綠素合成、破壞光反應和電子傳遞鏈等非氣孔限制因素以及影響氣孔導度、抑制碳固定等途徑影響植物的光合作用［4-5］；此外，Cd2+可以與植物細胞核相互作用，并通過影響DNA 堿基修飾等過程對DNA 產(chǎn)生損傷，這可能也是造成其蛋白質合成受阻的直接原因。

土壤重金屬具有隱蔽性、長期性和不可逆性的特點，重金屬污染的治理是一個世界性的難題，目前，重金屬的防治主要有物理修復方法、化學修復方法和生物修復方法。其中生物修復具有投資少、效率高、不給環(huán)境造成二次污染的特點，該修復方法是一項既環(huán)保又便宜的“綠色”技術，具有巨大的潛力［6］。

蓖麻（Ricinus communis）為大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricinus）一年或多年生草本植物。由于蓖麻枝葉茂盛、莖稈粗壯、根系發(fā)達，能防風固沙，因此被廣泛種植在高鹽堿等環(huán)境瘠薄地區(qū)［7］，同時蓖麻也因其抗逆性強、適應性廣等特點而被稱為理想的綠色環(huán)保植物［8］。研究發(fā)現(xiàn)［9］，蓖麻對重金屬Cd 具有較強的吸附性，同時非食用植物蓖麻具有對鉛（Pd）、鋅（Zn）等多種重金屬的超富集轉運系數(shù)和修復能力，因此被稱為新型重金屬富集植物并廣泛應用于重金屬污染土壤修復中。

近年來，隨著植物基因組測序技術的推動發(fā)展，轉錄組學、差異蛋白質組學和比較代謝組學等多種高通量組學技術傳播迅速并廣泛應用于植物響應重金屬脅迫的分子機制研究中，這對多角度闡明植物對重金屬的耐受和解毒機制具有重要的意義。鑒于此，本研究通過對Cd 脅迫下蓖麻根系進行差異蛋白質組學分析，揭示不同濃度Cd 脅迫對蓖麻生長發(fā)育的影響以及蓖麻對重金屬Cd 耐受性的分子機制；同時篩選出差異顯著基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中完成異源表達以驗證其基因功能，為蓖麻的耐Cd 基因鑒定以及土壤中重金屬Cd污染修復奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料處理

植物材料：“2129”優(yōu)良蓖麻品系和哥倫比亞野生型擬南芥（Columbia，Col-0），由內蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術研究中心提供；擬南芥缺失突變體atbsk7（SALK_077982C）購自AraShare 網(wǎng)站（http：//www.arashare.cn/）。

篩選過程：將蓖麻種子置于蛭石內，分別澆入700 mL 水溶液和Cd 溶液（0～4 000 mg·L-1），28 ℃培養(yǎng)72 h后，觀察記錄蓖麻種子的發(fā)芽狀態(tài)，對Cd濃度進行初步篩選；根據(jù)初篩結果，將萌發(fā)的蓖麻種子移栽至白沙內，分別加以Cd溶液（0～1 000 mg·L-1），持續(xù)生長21 d 后，觀察記錄蓖麻植株的發(fā)育狀態(tài)。本試驗中所用沙土均為標準1 mm 無粉塵白沙，研究過程中所產(chǎn)生的Cd 污染物均按照環(huán)保部門要求進行處理、回收。

材料獲?。簩⒈吐榉N子種植于白沙內，無Cd 條件下正常培養(yǎng)生長14 d 后，隨機分配幼苗并分別以0、300、700、1 000 mg·L-1的Cd 溶液（CdCl2·5H2O）處理，持續(xù)生長21 d 后，分別取植株根、莖、葉部經(jīng)液氮超低溫冷凍后于冰箱-80 ℃保存，用于重金屬濃度測定和差異蛋白質組學分析，分別記作CK、ZA、ZB、ZC。每個處理取3個生物學重復，每個重復由3株樣株混合獲得。

對比策略：300、700、1 000 mg·L-1的Cd溶液處理蓖麻植株根部分別與水處理對照植株根部比對，分別記作：ZA_VS_CK，ZB_VS_CK，ZC_VS_CK。

1.2 Cd含量測定

重金屬Cd 含量測定由青島科創(chuàng)質量檢測有限公司完成，具體方法如下：稱取1.0 g樣品經(jīng)液氮研磨至粉末后置于聚四氟乙烯消解罐內，加入5 mL硝酸，待反應結束后，放入微波消解儀（MILESTONE ETHOS1，意大利）內消解；待溫度降至50 ℃以下時，超純水潤洗3～4 次后經(jīng)電感耦合等離子質譜儀（Thermo iCAPQ，美國）測定，每個處理取3個生物學重復，每個重復由3株樣本混樣獲得。

1.3 蛋白質組學

利用酚提取法提取蓖麻材料根部的總蛋白質，經(jīng)胰酶酶解后，根據(jù)iTRAQ 試劑盒（AB SCIEX，美國）操作說明標記肽段，被標記肽段被加載至Agilent 300Extend C18 色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）中經(jīng)液相色譜流動相A（2%乙腈；0.1%甲酸）溶解后進入nanoACQUITY UPLC M-Class system（Waters，美國）超高效液相系統(tǒng)進行分離。經(jīng)超高效液相系統(tǒng)分離后的肽段被注入NSI 離子源中進行電離后，進入Q Exactive HF質譜進行分析。

經(jīng)質譜鑒定得到的差異蛋白質通過UniProt蓖麻蛋白質數(shù)據(jù)庫進行檢索，利用Proteome Discoverer 2.2 軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索、譜肽、蛋白質定量。將每個蛋白質在2 個比較對樣品中的相對定量值進行t-test 檢驗，以P≤0.05 作為顯著性指標，并使用R 語言進行聚類分析，同時通過對所有差異蛋白質向Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org/）的各個term 映射，找出與所有蛋白質背景相比，在差異蛋白質中顯著富集的GO條目。

1.4 RT-qPCR驗證

在對差異蛋白質組學分析的基礎上，選取9個差異蛋白質進行熒光定量PCR（RT-qPCR）分析，研究其在轉錄水平上的表達模式，其中以Actin（LOC8273907）作為內參對基因進行歸一化。使用GoTaq?qPCR and RT-qPCR Systems（普洛麥格，北京）進行RT-qPCR，每個處理3 個生物學重復。Ct 值取平均值，采用2-ΔΔCt法計算獲得RT-qPCR 結果（引物序列見表1）。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

1.5 異源表達

選擇在蛋白質組學以及RT-qPCR 中均顯著上調的基因，對其進行參與Cd脅迫響應的功能驗證。通過在NCBI進行blastp 搜索得知它編碼了一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，本研究中命名為RcBSK7。

利用CaMV35s 啟動子將基因RcBSK7的CDS序列克隆至pCAMBIA1305.2 載體，并將重組表達載體pCAMBIA1305.2-RcBSK7轉化至GV3101 農桿菌（Agrobacterium）感受態(tài)。通過浸花法將重組農桿菌菌液轉入擬南芥（野生型Col-0 系及突變體atbsk7），通過50 mg·L-1潮霉素抗性篩選分別獲得過表達抗性植株RcBSK7-OE 和回補表達抗性植株RcBSK7-CE（引物序列見表2）。

表2 目的基因PCR引物序列Table 2 Primer sequences of double primers PCR

1.6 擬南芥抗性植株分子水平鑒定

使用M5 超光速mix 試劑盒（聚合酶，北京）對擬南芥抗性植株進行DNA 水平鑒定，最終確定過表達和回補表達擬南芥陽性植株。

1.7 過表達擬南芥抗性植株的生物學水平鑒定

以野生型和缺失突變體擬南芥植株作為對照，對過表達擬南芥植株進行Cd 耐受性分析。取適量種子經(jīng)消毒清洗后點種于MS 固體培養(yǎng)基，在4 ℃春化72 h 后，移至16 h/8 h 光周期、23 ℃/20 ℃晝/夜循環(huán)的環(huán)境下培養(yǎng)14 d，分別移至Cd 濃 度 為0、50、75 μmol·L-1的MS 固體培養(yǎng)基內培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)條件同上。使用10 X 智能S生 物 顯 微 鏡（DM6，德 國）及LAS X 軟 件（v3.0.16120.2）對擬南芥植株根系及葉片生長狀態(tài)進行觀察統(tǒng)計，每組數(shù)據(jù)取5 個生物學重復的平均值。

(1)灌漿料的本構模型可參考混凝土的本構模型進行模擬，經(jīng)過對比分析，試驗結果與數(shù)值分析結果吻合較好，驗證了模型參數(shù)選取的合理性。

2 結果與分析

2.1 重金屬Cd溶液濃度篩選

為了研究Cd 脅迫對蓖麻生長發(fā)育的影響，篩選觀察不同濃度Cd 脅迫對蓖麻種子發(fā)芽及蓖麻植株生長狀態(tài)（見圖1～2，表3）。根據(jù)篩選試驗，選取0、300、700、1 000 mg·L-1Cd 處理后的蓖麻植株作為后續(xù)研究材料（見圖3）。

圖1 0～4 000 mg·L-1重金屬Cd處理蓖麻種子發(fā)芽結果Fig.1 Germination results of castor bean seeds treated with 0-4 000 mg·L-1 heavy metal Cd concentration

圖3 不同劑量Cd脅迫下蓖麻植株及根系生長狀態(tài)A～D.0、300、700、1 000 mg·L-1的Cd處理完整植株Fig.3 Growth status of castor plant and root system under different doses of Cd stress A-D.Intact plants under 0，300，700，1 000 mg·L-1 Cd treatment

表3 0～1 000 mg·L-1重金屬Cd處理蓖麻植株生長情況測定結果Table 3 0-1 000 mg·L-1 heavy metal Cd concentration treatment of castor plant growth status results

2.2 蓖麻植株Cd含量分析

由Cd 含量測定結果可知（見圖4），隨著Cd 脅迫濃度的增加，蓖麻根部、莖部以及葉部檢測到的Cd濃度亦隨之增加。其中，重金屬Cd在蓖麻根部顯著積累，Cd 含量分別為莖和葉部的25.6、33.5倍。由此推測，植物在Cd 脅迫下，作為土壤的第一接觸器官的根系可能為Cd 富集的主要部位，并通過莖—芽轉運至莖部以及葉部，此結果與John等［10］的研究一致。結合以上結果，選取蓖麻根部作為后續(xù)蛋白質組學研究材料。

圖4 不同質量濃度重金屬Cd處理蓖麻植株Cd含量測定結果*0.01＜P≤0.05；**0＜P≤0.01Fig.4 Cd content determination results of castor plants treated with different heavy metal Cd concentrations*0.01＜P≤0.05；**0＜P≤0.01

圖2 0～1 000 mg·L-1重金屬Cd處理蓖麻植株生長狀態(tài)A～L分別為0～1 000 mg·L-1的Cd脅迫下蓖麻植株的生長狀態(tài)Fig.2 The growth status of castor plant plants treated with 0-1 000 mg·L-1 heavy metal Cd concentration A-L are respectively 0-1 000 mg·L-1 of the growth status of castor plant under Cd stress

2.3 差異蛋白質的功能分析

基于同位素標記相對定量（iTRAQ）技術對不同Cd 脅迫處理的蓖麻植株根部進行蛋白質組學分析，共檢測到217個、156種蛋白質點差異表達顯著（Ratio≥1.2，P≤0.01），其中75 個差異蛋白質表達量顯著下調，142個差異蛋白質表達量顯著上調。

將上述差異蛋白質進行功能分類（見圖5），將156種差異蛋白質分為7個類別：其中參與脅迫/防御/解毒的蛋白質數(shù)量最多，約占總蛋白質數(shù)量的34%；其次是參與能量與碳代謝的蛋白質，約為總蛋白質的21%；而參與蛋白質折疊與降解、DNA 損傷修復、氨基酸代謝等蛋白質分別約為總蛋白質的14%、4%、3%等。

圖5 差異蛋白質功能分類Fig.5 Differential protein function classification

2.4 差異蛋白質聚類分析

對各組差異蛋白質聚類分析結果如下（見圖6）：300 mg·L-1的Cd 脅迫下，與防御解毒和能量碳代謝相關的蛋白質上調顯著；700 mg·L-1的Cd 脅迫下，除較多營養(yǎng)貯存相關的蛋白質表達量顯著上調外，參與葉綠素合成、CO2固定以及某些參與非生物脅迫的膜轉運相關蛋白質的表達量均呈現(xiàn)不同程度的上調；1 000 mg·L-1的Cd 脅迫下，少數(shù)參與細胞程序性死亡及急性創(chuàng)傷誘導相關蛋白質表達量特異性上調，這是在其他兩組比對中T 未觀察到的結果。

圖6 差異蛋白質層次聚類分析A.ZA_VS_CK 差異蛋白質聚類分析；B.ZB_VS_CK差異蛋白質聚類分析；C.ZC_VS_CK差異蛋白質聚類分析；列表示分組；行表示差異蛋白質Fig.6 Differential protein cluster analysis A. ZA_VS_CK differential protein cluster analysis；B. ZB_VS_CK differential protein cluster analysis；C. ZC_VS_CK differential protein cluster analysis；Column represents grouping；Row represents the difference protein

2.5 差異蛋白質GO功能注釋

對各組差異蛋白質進行GO功能注釋。由圖7可知，GO 功能注釋共分生物過程、細胞成分、分子功能3 大類。其中，各組中參與細胞呼吸、能量代謝等生物過程的差異蛋白質比例較大；其次分別是參與細胞骨架、細胞內非膜細胞器等細胞組成成分，以及ATP 結合蛋白、K+通道蛋白等參與分子功能相關的差異蛋白質。以上結果與上述差異蛋白質層次聚類分析一致，即各差異蛋白質與生物學功能保持一定的相關性。

圖7 差異蛋白質GO功能注釋分析A.ZA_VS_CK差異蛋白質GO注釋；B.ZB_VS_CK差異蛋白質GO注釋；C.ZC_VS_CK差異蛋白質GO注釋Fig.7 Differential protein GO function annotation analysis A. ZA_VS_CK differential protein GO function annotation analysis；B. ZB_VS_CK differential protein GO function annotation analysis；C.ZC_VS_CK differential protein GO function annotation analysis

2.6 差異蛋白質的RT-qPCR分析

在以上分析結果的基礎上，選取差異顯著且可能參與Cd 脅迫響應的蛋白質進行RT-qPCR 分析，研究其在轉錄水平的表達模式（見圖8）。結果發(fā)現(xiàn)響應Cd 脅迫的各差異蛋白質在轉錄水平也呈現(xiàn)出相同的表達模式，即可以從各差異蛋白質編碼基因出發(fā)，在轉錄水平研究蓖麻根系對Cd 脅迫的響應機制。其中，ZA 中B9RCB9和B9RGI8分別在轉錄水平顯示出更顯著的上調和下調趨勢；而B9T1G7 在ZA、ZB 中均顯示出較高的上調表達量，且結果與蛋白質組學分析結果高度一致，故編碼以上蛋白質的基因引起高度的注意。

圖8 蓖麻植株響應Cd脅迫的部分差異蛋白質RT-qPCR檢測結果Fig.8 RT-qPCR detection results of some differential proteins in castor plants in response to Cd stress

2.7 擬南芥抗性植株鑒定

為了分析基因RcBSK7在蓖麻響應Cd 脅迫研究中的作用，以WT 及突變體為對照，對RcBSK7-OE 進行Cd 耐受性分析（見圖9～10）。在無Cd 處理下，Col-0、atbsk7和RcBSK7-OE 的根系、葉片均發(fā)育良好。在50 μmol·L-1Cd 處理下，Col-0 和atbsk7根系的相對伸長長度明顯低于RcBSK7-OE，除此之外，Col-0 和atbsk7的葉片生長受到較明顯抑制，其中atbsk7個別植株葉片出現(xiàn)較明顯的黃化、枯萎等現(xiàn)象。在75 μmol·L-1Cd 處理下，比對觀察發(fā)現(xiàn)Col-0、atbsk7、RcBSK7-OE 在受損傷程度加深的基礎上，表現(xiàn)出同50 μmol·L-1Cd 脅迫相似的響應趨勢，即RcBSK7-OE 對Cd 的承受能力更強、更穩(wěn)定。

圖9 Col-1、atbsk7、RcBSK7-OE對重金屬Cd耐受性分析A1～A3.無Cd 脅迫Col-1、atbsk7、RcBSK7-OE；B1～B3. 50 μmol·L-1 Cd 脅迫Col-1、atbsk7、RcBSK7-OE；C1～C3. 75 μmol·L-1 Cd 脅迫Col-1、atbsk7、RcBSK7-OEFig.9 Analysis of tolerance of Col-1，atbsk 7，RcBSK7-OE to heavy metal Cd A1-A3.Col-1，atbsk7，RcBSK7-OE without Cd stress；B1-B3.Col-1，atbsk7，RcBSK7-OE under 50 μmo·lL-1 Cd stress；C1-C3.Col-under 75 μmo·lL-1 Cd stress Col-1，atbsk7，RcBSK7-OE

圖10 不同質量濃度Cd 脅迫下Col-1、atbsk7、RcBSK7-OE根長及側根數(shù)分析A.側根數(shù)量統(tǒng)計結果；B.根長統(tǒng)計結果；*0.01＜P≤0.05，**0＜P≤0.01Fig.10 Analysis results of the root length and lateral root number of Col-1，atbsk7，RcBSK7-OE under different Cd stress concentrations A.Statistical result of the number of lateral roots；B.Statistical result of the root length；*0.01＜P≤0.05，**0＜P≤0.01

3 討論

關于蓖麻植株響應Cd 脅迫的生理學研究已有 文 獻 記 載［11-12］，在Cd 脅 迫 下，蓖 麻 植 株 的H2O2、丙二醛含量隨Cd 脅迫濃度的增加而顯著增加，結果導致細胞內ROS 積累。即生理水平研究結果主要強調Cd 脅迫對蓖麻植株產(chǎn)生氧化損傷，同時蓖麻植株通過提高抗氧化能力以維持氧化系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，此結果同樣在蛋白質水平上得到驗證。

3.1 蓖麻植株響應Cd 脅迫的差異蛋白質組學研究與討論

3 種劑量的Cd 脅迫下，蓖麻根系中主要的下調蛋白質包括微管蛋白α鏈、果膠酯酶等參與細胞骨架及細胞壁合成相關蛋白質；鐵氧還蛋白-NADP+還原酶、檸檬酸1，2-加氧酶等參與光合作用和能量代謝的蛋白質以及與DNA損傷修復相關蛋白質，隨Cd 脅迫濃度的增加，蛋白質表達量下調越顯著。

分析3 種劑量Cd 脅迫下，蓖麻根系中顯著上調的蛋白質可知，300 mg·L-1的Cd 脅迫下，環(huán)氧水解酶、琥珀酸脫氫酶、細胞色素b5 蛋白（Cyt-b5）等多種參與三羧酸循環(huán)和細胞氧化磷酸化等途徑的蛋白質表達量顯著上調。以上蛋白質一方面可以作為中間電子傳遞體參與細胞中的各種氧化還原反應而調節(jié)蓖麻體內ROS 平衡，另一方面參與細胞氧化磷酸化途徑并合成供植物直接吸收的能量ATP，其活性的提高對蓖麻抵抗Cd 脅迫具有重要的作用。值得注意的是，O-甲基轉移酶、差向異構酶等參與木質素合成的蛋白質表達量特異性上調。研究發(fā)現(xiàn)［13］，木質素是植物次生細胞壁的重要組分，不僅能維持植物的正常生命活動，還可以通過增強植物細胞壁隔水性和機械強度進而提高植物的抗逆性，即蓖麻根系細胞壁的固持作用有助于降低和緩解Cd 毒害。結合以上結果可知：300 mg·L-1的Cd 脅迫下，蓖麻主要通過阻隔根系對重金屬Cd 的吸收以及提高自身抗氧化能力而抵抗Cd脅迫損傷。

2-Cys 過氧化物酶、超氧化物歧化酶等作為植物內重要的抗氧化酶系統(tǒng)，其表達量在700 mg·L-1的Cd 脅迫下的增加對清除細胞內的ROS 具有重要的作用，這一結果也與已往研究結果一致，Zhang 等［14］通過研究Cd 對蓖麻抗氧化酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，蓖麻根系中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性較高，它們能誘導根部有效解毒以提高蓖麻對Cd 的耐受性。此外，參與植物光合作用的蛋白質在本組中特異性上調，包括碳固定過程的關鍵酶（S）-2-羥酸氧化酶、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）及參與葉綠素合成的4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶等，以上蛋白質的積累表達可提高蓖麻的光合速率以抵抗Cd 脅迫。有研究表明［15］，Cd 脅迫下，蓖麻葉片中鎂（Mg）含量未出現(xiàn)明顯下降趨勢，Mg 能夠防止Cd 阻礙葉綠體合成葉綠素，即同樣證實蓖麻通過維持光合作用，從而減緩Cd 毒害作用。值得注意的是，亞精胺合酶1 的蛋白質表達量特異性上調，而亞精胺合酶作為多胺生物合成代謝中的關鍵酶，所合成的多胺（PA）對促進植物生長發(fā)育、提高植物抗逆性具有重要的作用。此外，有研究證實亞精胺合酶因可以抑制重金屬Cd 向地上部分轉運而被應用于重金屬Cd 的解毒效應中［16］。當Cd脅迫質量濃度增加至700 mg·L-1時，蓖麻植株主要通過提高抗氧化酶活性、抑制Cd2+運轉等防御解毒過程而提高對重金屬Cd的耐受性。

1 000 mg·L-1的Cd 脅迫下主要的上調蛋白質中，除參與木質素合成、抗氧化酶系統(tǒng)、光呼吸途徑及離子穩(wěn)態(tài)等相關蛋白質呈現(xiàn)一定數(shù)量的積累外，發(fā)現(xiàn)催化半乳糖代謝的UDP-葡萄糖4-表異構酶及參與細胞程序性死亡的CASP 樣蛋白1D1、急性創(chuàng)傷誘導產(chǎn)生的蛋白WIN1、缺氧條件下被誘導的乙醇脫氫酶［17］的表達量特異性上調。其中UDP-葡萄糖4-表異構酶催化半乳糖代謝在生成ATP 的同時，其生成的代謝產(chǎn)物UDP-葡萄糖可進一步參與葡萄糖醛酸及戊糖磷酸等代謝途徑而參與植物逆境脅迫。CASP 樣蛋白1D1、創(chuàng)傷誘導蛋白WIN1 等氧化應激蛋白質可能是蓖麻受到更嚴重的損傷時，機體通過啟動自身免疫防御系統(tǒng)、激活壞死細胞的死亡程序以響應Cd 脅迫。以上結果說明，1 000 mg·L-1的Cd 脅迫下，蓖麻植株受損嚴重，即使通過阻隔根系對重金屬Cd 的吸收、抑制Cd2+運轉、提高抗氧化能力和光合作用也無法徹底恢復Cd 脅迫損傷。在此情況下，蓖麻通過誘導激活細胞程序性死亡以響應Cd脅迫。

3.2 蛋白激酶響應Cd脅迫機制研究與討論

目前，關于螯合肽（PCs）、金屬硫蛋白（MTs）、ABC 運轉蛋白、重金屬ATP 酶（HMAs）轉運蛋白等蛋白質通過螯合作用響應重金屬Cd 脅迫的分子機制已被多數(shù)研究證實［18］，而與絲/蘇氨酸蛋白激酶響應重金屬Cd 脅迫相關的分子機制還未明確。本研究中通過蛋白質組學和RT-qPCR 驗證結果選取蛋白激酶作為研究對象對其進行功能驗證，一方面因其在轉錄水平、蛋白質水平的高表達量，另一方面希望可以尋找并探索蓖麻參與重金屬Cd解毒的特異性分子機制。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是植物體內參與植物生長發(fā)育調控和抗逆研究的一類重要的蛋白激酶，常見的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶包括類受體蛋白激酶（RLKs）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs）等。本研究通過蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+誘導蓖麻根系內1種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的表達，且在分子水平和生物學水平上均證實該蛋白質的表達對擬南芥響應Cd脅迫具有重要作用。類受體蛋白激酶在植物細胞外信號的感知和傳導中起關鍵作用，葉瑤瑤［19］在水稻（Oryza sativa）響應Cd 脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，RLK在水稻中的過表達可以增強抗氧化保護酶活性、減少水稻體內的Cd 含量，因此推測RLK 可能通過調節(jié)參與Cd 轉運的基因表達以及減輕Cd 誘導產(chǎn)生的氧化脅迫等途徑而增強植物對重金屬Cd 的耐 受 性。此 外Ouelhadj 等［20］研 究 中 發(fā) 現(xiàn)，Hv-LysMR1在受Cd 脅迫和衰老損傷的大麥（Hordeum vulgare）葉片中被顯著誘導，但還無法證實Hv-LysMR1的誘導表達是由于感知衰老信號、還是由于感知重金屬脅迫、或者是由于因Cd 脅迫損害而引起的葉片衰老所導致，這可能需要進一步證實。絲裂原活化蛋白激酶通過3 種蛋白激酶MAPKKK，MAPKK和MAPK組成了級聯(lián)信號系統(tǒng)以參與胞外信號傳導通路，Jonak 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，將紫花苜蓿（Medicago sativa）幼苗暴露在過量的Cu2+或Cd2+下，激活了SIMK、MMK2、MMK3 和SAMK 4 種不同的絲原激活蛋白激酶，但通過對激酶進行動力學分析發(fā)現(xiàn)，Cu、Cd 誘導的應激似乎是通過不同的信號轉導通路介導的，Cu 作為氧化還原活性金屬離子，可能通過誘導產(chǎn)生ROS 進而激活SIMKK 觸 發(fā)SIMK 和SAMK 活 化，而 介 導Cd 激 活SIMK、MMK2、MMK3 和SAMK 的上游成分仍有待確定。而Ye 等［22］在擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫下，一氧化氮（NO）與MAPKs存在相互作用，即NO可能是MAPKs 的上游信號。與此同時，熊兵［23］通過在釀酒細胞中研究發(fā)現(xiàn)，Cd 鎘脅迫應答參與細胞壁完整性（Cell Wall Integrity，CWI）和高滲透壓甘油（High Osmolarity Glycerol，HOG）2 個MAPK 信號傳導途徑。鈣依賴性蛋白激酶作為一種Ca2+傳感器在響應逆境脅迫中發(fā)揮重要的作用［24］。結合鈣依賴蛋白激酶響應逆境脅迫機制發(fā)現(xiàn)，其主要通過調節(jié)K+跨膜運輸進而提高離子穩(wěn)態(tài)和ROS穩(wěn)態(tài)，從而緩解逆境脅迫對植物的氧化損傷。此外，14-3-3 蛋白與鈣依賴蛋白激酶之間的交叉磷酸化及協(xié)同作用為其響應逆境脅迫提供了更多可能［25］。以上各類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的作用機制為后續(xù)對RcBSK 7響應Cd脅迫機制的探索提供了更多的研究方法。

4 結論

結合已有研究及本研究結果來看，蓖麻根系作為Cd 富集的主要部位，并通過莖-芽轉運至莖部以及葉部。蛋白質組學分析強調，暴露于Cd 脅迫中會導致蓖麻植株氧化還原系統(tǒng)的改變，ATP合成失調，離子穩(wěn)態(tài)破壞等反應。這可能是Cd 脅迫造成蓖麻植株生長抑制的主要原因。

總之，根據(jù)iTRAQ 蛋白質組學研究分析，了解并揭示了蓖麻在不同劑量Cd 脅迫下的響應機制。同時，篩選出顯著上調的蛋白質并完成其編碼基因（RcBSK7）在擬南芥中的過表達，鑒定結果驗證了該基因可以顯著增強擬南芥對Cd 脅迫的耐受性，后續(xù)將在蓖麻中完成RcBSK7的過表達，并對其參與植物響應Cd 脅迫進行驗證并對其響應機制進行探究，以期將該基因用于培育高Cd 耐受性的蓖麻品種。本研究加深了對蓖麻響應Cd 脅迫機制的認識，為蓖麻響應Cd 脅迫的基因鑒定和土壤中重金屬污染修復提供了有價值的理論依據(jù)。