冠突散囊菌LJSC.2005對(duì)茯茶主體黑毛茶發(fā)花品質(zhì)影響

湯依鈺，俞夢(mèng)瑤，禹利君,2,3,4*，黃建安,2,3,4，王坤波,2,3,4，劉仲華,2,3,4*

1. 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128

茯茶是黑茶中深受消費(fèi)者喜愛(ài)的茶類(lèi)，主產(chǎn)于湖南安化，以櫧葉齊、云臺(tái)大葉、桃源大葉等品種制成的黑毛茶作為主要加工原料，具有獨(dú)特的風(fēng)味。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）在茯茶發(fā)花過(guò)程中的酶促氧化作用，是形成茯茶獨(dú)特的滋味成分及菌花香特征的關(guān)鍵[1]。研究發(fā)現(xiàn)，茯茶具有降脂減肥[2]、抗癌細(xì)胞增殖[3]、抗菌消炎[4]、改善吸煙造成的肺損傷[5]等諸多功效。發(fā)花散茶兼顧傳統(tǒng)茯茶功效的同時(shí)，還具有沖泡方便、“金花”（冠突散囊菌孢子囊）茂盛、菌香明顯等特點(diǎn)。通過(guò)使用冠突散囊菌單一菌種進(jìn)行散茶發(fā)花，得到的發(fā)花散茶品質(zhì)穩(wěn)定、安全。

香氣是茶葉品質(zhì)判別的重要指標(biāo)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）精確性好、靈敏度高，已成為分析茶葉香氣品質(zhì)的重要方法。Shi等[6]運(yùn)用 GC-MS檢測(cè)到茯磚茶的主要香氣成分包括酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)等。頂空固相微萃取法（HS-SPME）作為茶葉香氣收集的方法之一，可以有效防止檢測(cè)過(guò)程中香氣成分的降解、氧化及組分間二次反應(yīng)[7]，是 GC-MS前處理的優(yōu)選方法。茯茶發(fā)花期間香氣組成變化已有一些研究報(bào)道[8-10]，但研究選擇的多為傳統(tǒng)工藝發(fā)花的茯磚茶成品，發(fā)花環(huán)境因素復(fù)雜。本研究收集了湖南具有代表性的黑毛茶，并對(duì)其工藝特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)考究，通過(guò)提取純化的冠突散囊菌LJSC.2005（GenBank accession numbers: MZ147024）進(jìn)行散茶發(fā)花，將發(fā)花前后的茶樣進(jìn)行感官審評(píng)、茶葉生化成分檢測(cè)和 HP-SPME/GC-MS香氣分析，探究冠突散囊菌 LJSC.2005參與不同湖南茯茶主體黑毛茶發(fā)花前后的滋味品質(zhì)及香氣成分變化，為湖南茯茶品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑毛茶由湖南代表性茶廠提供（編號(hào)1、3、5、7、9、11），其對(duì)應(yīng)發(fā)花散茶（編號(hào)2、4、6、8、10、12）參考 Xu等[11]方法，以冠突散囊菌LJSC.2005為單一菌種發(fā)花所得，試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。部分毛茶經(jīng)歷了七星灶熏煙、去梗工序，具體信息詳見(jiàn)表1。

表1 茶樣信息Table 1 The information of tea samples

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-1750型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、LC-M20A型分析型高效液相色譜、GC/MS-QP2010型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、PDMS/DVB固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)試劑

甲醇（HPLC級(jí)）、乙腈（HPLC級(jí)）購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司；沒(méi)食子酸、茶堿、可可堿和兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma有限公司；槲皮素、楊梅素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；碳酸鈉、福林酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、氯化鋁、蒽酮、濃硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 感官審評(píng)

參考 GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》中黑茶散茶的審評(píng)方法，將12個(gè)茶樣分為黑毛茶和發(fā)花散茶2組進(jìn)行密碼審評(píng)。審評(píng)小組由具有長(zhǎng)期茶葉審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的 3名教授及2名碩士研究生組成。按照外形、湯色、香氣、滋味、葉底的順序，逐項(xiàng)對(duì)茶樣進(jìn)行百分制審評(píng)打分，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行加權(quán)計(jì)算得到總分。

1.5 生化成分檢測(cè)

茶多酚含量測(cè)定采用福林酚比色法，參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》；水浸出物含量測(cè)定參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》；游離氨基酸含量測(cè)定采用茚三酮比色法，參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》；黃酮類(lèi)化合物總量的測(cè)定采用三氯化鋁比色法，可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法。

兒茶素、生物堿檢測(cè)方法參照Samanidou等[12]方法，試液制備浸提方法參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》，浸提液經(jīng) 0.45 μm 纖維膜過(guò)濾。色譜柱為 Welchrom C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.2%磷酸，流動(dòng)相B為V甲醇∶V乙腈=95∶5，梯度洗脫，流速0.8 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。

黃酮醇類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)參照劉雁等[13]方法，試液制備參考張紀(jì)偉等[14]方法，色譜柱為Welchrom C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.2%磷酸，流動(dòng)相B為100%甲醇，梯度洗脫，流速1 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

1.6 GC-MS檢測(cè)分析

稱(chēng)取2.0 g磨碎茶樣于20 mL萃取瓶，80℃水浴平衡 10 min，萃取頭 210℃老化 50 min，吸附50 min，250℃解吸附5 min。

GC條件：HP-88石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm），進(jìn)樣口溫度 240℃，流速1.37 mL·min-1。升溫程序：初始溫度60℃保持5 min；以3℃·min-1升至140℃，保持5 min；以 5℃·min-1升至 210℃，保持 10 min；以5℃·min-1升至 240℃，保持 10 min。進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，載氣為He。

MS條件：離子源（EI），離子源溫度200℃，轉(zhuǎn)接口溫度220℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為45～500m/z。

1.7 數(shù)據(jù)整理

采用 SIMCA-P 14.1軟件、IBM SPSS Statistics 19軟件、WPS 2019教育版、聯(lián)川生物云平臺(tái)（www.omicstudio.cn/tool）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。根據(jù)GC-MS分析得到各色譜峰的質(zhì)譜信息，參考NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，結(jié)合文獻(xiàn)篩選相似度大于 80%的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析；根據(jù)香氣成分的峰面積采用峰面積歸一法得到各個(gè)香氣成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑毛茶及發(fā)花散茶感官審評(píng)結(jié)果分析

發(fā)花前后茶樣感官品質(zhì)有明顯改變（表2）。發(fā)花后，干茶色澤加深，茶條平伏卷緊，金花滿(mǎn)披、顆粒顏色亮黃，油潤(rùn)發(fā)亮有光澤；氣味純正無(wú)異味，香氣更加濃郁，菌花香顯露；茶湯清澈明亮，顏色變紅、加深；滋味更加醇和厚重；葉底顏色加深，葉片、嫩梗變軟。冠突散囊菌 LJSC.2005發(fā)花能夠明顯降低黑毛茶過(guò)重?zé)熝?，減輕茶樣青氣及澀味，使得茶樣茶香、菌香、松煙香調(diào)和，整體評(píng)分上升。黑毛茶初制工藝影響冠突散囊菌 LJSC.2005發(fā)花品質(zhì)，主要表現(xiàn)在缺少煙熏且同時(shí)伴有剔梗的桃源大葉A發(fā)花過(guò)度、略帶酸味。

表2 黑毛茶及發(fā)花散茶感官審評(píng)結(jié)果Table 2Sensory evaluation results of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatumLJSC.2005

2.2 黑毛茶及發(fā)花散茶生化成分分析

主要內(nèi)含成分檢測(cè)結(jié)果表明（表3），黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花后，發(fā)花散茶中黃酮類(lèi)、茶多酚和游離氨基酸含量下降，水浸出物和可溶性糖含量總體呈下降趨勢(shì)。黃酮類(lèi)、茶多酚和游離氨基酸含量降幅最大的茶樣分別為云臺(tái)大葉B、櫧葉齊B和云臺(tái)大葉B，分別為33.87%、39.62%和47.74%。安化云臺(tái)山八角茶葉有限公司和湖南省云上茶業(yè)有限公司朱沖茶廠的黑毛茶經(jīng)發(fā)花后水浸出物含量有所下降，其中云臺(tái)大葉 A降幅最大，為9.69%，其余茶樣則有不同幅度的上升，其中櫧葉齊B增幅最大，達(dá)9.71%?？扇苄蕴呛拷Y(jié)果顯示，僅有湖南省白沙溪茶廠股份有限公司的黑毛茶發(fā)花后有所上升，其中櫧葉齊 B增幅較大，達(dá) 42.38%，而其余黑毛茶茶樣發(fā)花后可溶性糖含量下降，桃源大葉 A降幅達(dá)28.42%。

表3 黑毛茶及發(fā)花散茶主要內(nèi)含成分含量Table 3The main contents of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatum LJSC.2005%

HPLC對(duì)兒茶素、生物堿和黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的生化檢測(cè)結(jié)果顯示（表4），黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花后，發(fā)花散茶沒(méi)食子酸和咖啡堿呈上升趨勢(shì)，可可堿變化不明顯，兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚呈下降趨勢(shì)。沒(méi)食子酸僅有櫧葉齊 B發(fā)花后含量下降，降幅19.07%，云臺(tái)大葉B發(fā)花后沒(méi)食子酸含量增幅最大，達(dá)440.46%?？煽蓧A含量結(jié)果中，安化云臺(tái)山八角茶葉有限公司和湖南省云上茶業(yè)有限公司朱沖茶廠的黑毛茶發(fā)花后含量下降，其中云臺(tái)大葉A降幅最大，達(dá)60.00%，其余茶樣中桃源大葉A可可堿含量增幅最大，為19.57%。云臺(tái)大葉品種發(fā)花后咖啡堿含量下降，其中云臺(tái)大葉A降幅較大，為16.10%；桃源大葉B發(fā)花后咖啡堿含量增幅最大，為16.86%。各茶樣中的兒茶素含量在發(fā)花后基本呈下降趨勢(shì)，EG和DL-C含量降幅最大的分別為云臺(tái)大葉A（50.75%）和云臺(tái)大葉B（34.23%）；EGCG、EC、GCG、ECG含量降幅最大的均為櫧葉齊A，分別為 96.46%、53.70%、92.46%、96.14%；櫧葉齊A、云臺(tái)大葉A和桃源大葉B發(fā)花后DL-C含量上升，云臺(tái)大葉A增幅最大（262.10%）。各茶樣中楊梅素、槲皮素和山奈酚含量在發(fā)花后大多呈下降趨勢(shì)，降幅最大的分別為云臺(tái)大葉B（64.55%）、云臺(tái)大葉B（64.52%）、桃源大葉B（25.83%）。

表4 黑毛茶及發(fā)花散茶生化成分含量Table 4Biochemical component contents of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatum LJSC.2005 mg·g-1

2.3 黑毛茶及發(fā)花散茶香氣組成和相對(duì)成分分析

所有茶樣共檢測(cè)到71種香氣成分（表5），其中碳?xì)浠衔?4種，醇類(lèi)16種，醛類(lèi)10種，酯類(lèi)6種，酚類(lèi)4種，內(nèi)酯類(lèi)1種，含氮化合物6種，含氧化合物4種，含量較多的為碳?xì)浠衔铮?2.85%）、醇類(lèi)（20.78%）、酮類(lèi)（12.49%）、醛類(lèi)（12.49%）。在黑毛茶中檢測(cè)到香氣成分 55種，特有香氣成分 8種；在發(fā)花散茶中檢測(cè)到香氣成分63種，特有香氣成分16種，兩者共有香氣成分47種（圖1-A）。12個(gè)茶樣都含有的香氣成分共 12種（圖1-C），除了櫧葉齊B之外，所有茶樣發(fā)花后香氣成分種類(lèi)增多（圖1-B）。苯乙烯和異丁酸葉醇酯為黑毛茶共有香氣成分；(E)-芳樟醇3,7-氧化物、異植物醇和苯乙酮為發(fā)花散茶共有香氣成分（圖1）。黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花后，所有茶樣醛類(lèi)和酯類(lèi)香氣成分含量上升，安化云臺(tái)山八角茶葉有限公司和湖南省云上茶業(yè)有限公司朱沖茶廠的茶樣出現(xiàn)含氧化合物，其他種類(lèi)香氣成分基本呈下降趨勢(shì)（圖2）。

表5 黑毛茶及發(fā)花散茶主要香氣成分和相對(duì)含量Table 5 Main aroma components and their relative contents in the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005%

續(xù)表5

圖1 黑毛茶及發(fā)花散茶共有及特有香氣成分?jǐn)?shù)量Fig. 1 Quantity of common and unique aroma components of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

圖2 黑毛茶及發(fā)花散茶香氣成分組成Fig. 2 Composition of aroma components of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

2.4 黑毛茶及發(fā)花散茶特征香氣成分分析

在SIMCA軟件中對(duì)茶樣香氣成分相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析（PCA），所構(gòu)成的模型中R2X=0.451，Q2=0.126，模型質(zhì)量較好，分析結(jié)果所作Biplot圖中（圖3-A），同一坐標(biāo)軸上同方向的樣品和香氣成分呈正相關(guān)。PCA結(jié)果表明，發(fā)花前后茶樣區(qū)別明顯且發(fā)花后香氣近似。根據(jù)是否發(fā)花將所有茶樣分為黑毛茶和發(fā)花散茶兩組，構(gòu)建OPLS-DA模型進(jìn)行兩兩比較，擬合參數(shù)R2X=0.496，R2Y=0.99，Q2=0.931，說(shuō)明該模型具有較好區(qū)分能力和預(yù)測(cè)能力，并作Biplot圖（圖3-B）、permutation圖（圖3-C）（n=200）和S-plot圖（圖3-D）。VIP predictive共篩選出 20種差異香氣成分（VIP值≥1），t檢測(cè)（Students’t-test）中P值≥0.05的香氣成分共4種，分別為(E,E)-2,4-

庚二烯醛、正十二烷、雪松醇、香葉基丙酮；P值≤0.05的香氣成分共16種，分別為水楊酸甲酯、(E)-氧化芳樟醇（呋喃類(lèi)）、正十三烷、(E)-芳樟醇3,7-氧化物、苯甲醇、苯乙醇、苯乙烯、橙花醇、(E)-2-已烯醛、(E)-橙花叔醇、正十四烷、苯乙酮、(E)-2-辛烯醛、β-紫羅蘭酮、異丁酸葉醇酯、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮，為檢測(cè)得到的湖南黑毛茶經(jīng)冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花前后差異性香氣成分。

圖3 黑毛茶及發(fā)花散茶香氣成分SIMCA分析結(jié)果Fig. 3 SIMCA analysis of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

3 討論與結(jié)論

結(jié)合感官審評(píng)與生化成分檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用冠突散囊菌 LJSC.2005對(duì)湖南茯茶主體黑毛茶進(jìn)行發(fā)花后，發(fā)花散茶的茶湯呈現(xiàn)出更加醇和的口感，黃酮類(lèi)、茶多酚和游離氨基酸呈下降趨勢(shì)，特別是酯型兒茶素中的 EGCG降幅顯著，可能是茶湯苦澀味消失的主要原因。發(fā)花散茶可溶性糖含量變化中，僅湖南省白沙溪茶廠股份有限公司茶樣的含量上升；水浸出物含量變化中，僅桃源縣君和野茶開(kāi)發(fā)有限公司與湖南省白沙溪茶廠股份有限公司茶樣的含量有所上升，與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花變化存在差異[15]。大部分茶樣發(fā)花后沒(méi)食子酸含量上升，兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚等黃酮類(lèi)化合物呈下降趨。茶葉中的可可堿和咖啡堿，性質(zhì)穩(wěn)定、微生物利用度低，在茯茶加工過(guò)程中一般呈緩慢下降趨勢(shì)[15]，但本研究中，部分茶樣發(fā)花后可可堿和咖啡堿含量有所上升，推測(cè)是品種和工藝多因素導(dǎo)致的結(jié)果。

碳?xì)浠衔镏袑?duì)茯磚茶香氣有較大貢獻(xiàn)的一般為烯烴類(lèi)[9]，如差異性成分苯乙烯具輕微甜味。本研究發(fā)現(xiàn)，黑毛茶發(fā)花后，醇類(lèi)中具有花香和木香的(E)-氧化芳樟醇（呋喃類(lèi)）相對(duì)含量上升，可能源于真菌對(duì)芳樟醇的轉(zhuǎn)化[16]，(E)-芳樟醇 3,7-氧化物為醇類(lèi)香氣物質(zhì)前體，最早在烏龍茶中[17]被提取得到；苯甲醇和苯乙醇分別具有果香和甜花香，發(fā)花后相對(duì)含量下降；具有花果香和木香的橙花醇和(E)-橙花叔醇等萜醇類(lèi)化合物發(fā)花后也有不同程度的下降，與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花過(guò)程中物質(zhì)的變化趨勢(shì)相同[18]。酮類(lèi)中的β-紫羅蘭酮具有紫羅蘭香，為茯磚茶菌花香重要貢獻(xiàn)物質(zhì)，6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮略帶刺激性肉桂香，兩者在發(fā)花后含量皆下降；苯乙酮具有花香，與“菌花香”“薄荷”等氣味正相關(guān)，在發(fā)花后含量上升，以上結(jié)果與Li等[18]研究結(jié)果相似。醛類(lèi)中，(E)-2-已烯醛和(E)-2-辛烯醛具有青氣味，發(fā)花后相對(duì)含量有所增加，其主要源于脂肪酸轉(zhuǎn)化，在茯磚茶中含量明顯高于普洱茶[10]。酯類(lèi)中，水楊酸甲酯增幅顯著，呈現(xiàn)冬青油草藥香，同樣為茯磚茶高于普洱茶的特征香氣成分[19]；異丁酸葉醇酯具有花果香，發(fā)花后完全消失。內(nèi)酯類(lèi)化合物中，二氫獼猴桃內(nèi)酯具有香豆素和麝香味，發(fā)花后相對(duì)含量減少，趨勢(shì)與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花過(guò)程一致[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用冠突散囊菌LJSC.2005對(duì)湖南茯茶主體黑毛茶進(jìn)行發(fā)花能夠很好地促進(jìn)茶葉品質(zhì)轉(zhuǎn)化。感官審評(píng)結(jié)果顯示，發(fā)花能夠削弱工藝與品種對(duì)茶樣感官品質(zhì)的影響，使茶樣獲得濃郁純正的菌花香味和醇厚口感。生化成分檢測(cè)結(jié)果表明，茯茶發(fā)花過(guò)程中水浸出物含量、可溶性糖含量變化趨勢(shì)與工藝相關(guān)，可可堿和咖啡堿含量變化趨勢(shì)可能與品種相關(guān)，其余物質(zhì)基本呈下降趨勢(shì)。香氣檢測(cè)結(jié)果表明，黑毛茶發(fā)花后香氣種類(lèi)數(shù)目增多，種類(lèi)變化與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花過(guò)程基本一致[18]。香氣成分中含量最多的為碳?xì)浠衔?，與Zheng等[20]研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)檐虿杓庸すに嚭桶l(fā)花過(guò)程中涉及到的微生物種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)菌種不同所致。本研究收集的云臺(tái)大葉、櫧葉齊和桃源大葉3個(gè)茶樹(shù)品種在湖南省種植面積廣，均選育自安化群體品種，親緣關(guān)系較近；研究發(fā)現(xiàn)黑毛茶的初制工藝對(duì)于冠突散囊菌 LJSC.2005發(fā)花過(guò)程中生化成分的變化影響明顯。后期研究可選擇特異性較強(qiáng)或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的茶樹(shù)品種制作黑毛茶，以冠突散囊菌LJSC.2005進(jìn)行散茶發(fā)花，研究品種、工藝對(duì)于茯茶品質(zhì)的影響，分析其滋味香氣變化，探究原料品種、制作工藝及金花菌種多因素對(duì)湖南茯茶品質(zhì)的影響，以期進(jìn)一步提升湖南茯茶品質(zhì)。