磷鋁互作對(duì)茶樹根系生長及有機(jī)酸分泌的影響

周貝妮，梅慧玲，李建杰，陳伶俐，衷青，李小倩，陳暄*，黎星輝*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210095

鋁作為地殼中含量最豐富的金屬，在酸性土壤中會(huì)以可溶性離子的形式從不溶性硅酸鋁或氧化物中釋放出來[1]。濃度極低的鋁離子也會(huì)抑制大多數(shù)植物的根系生長[2]。植物中鋁毒引起所有的癥狀都與根系的嚴(yán)重變化有關(guān)[3]，主要表現(xiàn)為迅速抑制根系生長，干擾根尖和側(cè)根的細(xì)胞分裂，造成根系受損、數(shù)量減少，因此根系的生長情況也被用于衡量植物的耐鋁性。Sjogren等[4]研究表明，鋁會(huì)造成細(xì)胞周期停滯、根尖末端停止分化等，從而導(dǎo)致根系伸長受到抑制，這些過程都與鋁損害了 DNA完整性有關(guān)。

茶樹是一種較為特殊的經(jīng)濟(jì)作物，適宜在酸性土壤中生長，并對(duì)鋁有很高的耐受性，甚至必須有鋁元素才能實(shí)現(xiàn)最佳生長[5-6]。在一定的鋁濃度處理下，茶樹根的生長（包括主根、側(cè)根和根毛）顯著增加，而地上部的生長基本不變，說明鋁更能有效地促進(jìn)茶樹根部的生長，且茶樹可以承受至少1 mmol·L-1鋁濃度，而不會(huì)對(duì)正常生長產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。鋁還能夠刺激液體培養(yǎng)的離體茶樹根和簡單鹽溶液中懸浮培養(yǎng)的茶葉細(xì)胞的生長[8]，這表明鋁能夠刺激茶樹生長，而且這種生長效應(yīng)還能夠發(fā)生在組織和細(xì)胞水平上。劉騰騰等[9]研究表明，茶樹根系主要分泌草酸、檸檬酸及蘋果酸，約占有機(jī)酸分泌總量的 90%；而在 2 mmol·L-1鋁濃度范圍內(nèi)，茶樹分泌的多種有機(jī)酸水平隨鋁離子濃度的增加而升高[10]。

磷是酸性土壤的主要限制養(yǎng)分[11]。由于磷離子較易與金屬陽離子形成離子對(duì)或絡(luò)合物，導(dǎo)致土壤中只存在極少數(shù)的可溶性磷離子。多項(xiàng)研究表明，磷在許多土壤中的有效性，尤其是在酸性土壤中的有效性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足植物生長[12]，土壤中有效磷濃度通常為 0.01 mmol·L-1或更低[13]。另一方面，由于磷肥或有機(jī)肥的施用量過多，一些茶園出現(xiàn)了磷濃度過高的現(xiàn)象[14]。Yan等[15]報(bào)道，在高生產(chǎn)力的茶園中，表層土壤有效磷含量高達(dá) 400 mg·kg-1。阮宇成等[16]測定了不同磷鋁濃度下茶樹葉片的各項(xiàng)指標(biāo)，包括葉片的光合速率、葉綠素含量等，提出最適宜茶樹生長的鋁磷比值。由此可見，環(huán)境中磷鋁濃度與茶樹的生長密切相關(guān)。

因此，本研究通過分析不同磷鋁濃度下茶樹根系生長情況、茶樹不同部位磷鋁兩元素含量以及茶樹根系有機(jī)酸分泌的變化情況，以期進(jìn)一步闡明磷鋁互作對(duì)茶樹生長的影響，并對(duì)茶樹根系發(fā)育、茶樹對(duì)磷鋁兩元素的吸收及茶園土壤酸化提供理論支持，為豐富茶樹栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試茶苗為半年生龍井長葉扦插穴盤苗。水培試驗(yàn)于2021年7月6日—9月2日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候溫室內(nèi)進(jìn)行，營養(yǎng)液參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行配制，(NH4)2SO4、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、K2SO4、CaCl2、MgSO4、Al2(SO4)3·18H2O濃度分別為0.375、0.25、0.05、0.95、0.395、0.2、0.5 mmol·L-1，H3BO3、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O 、 Na2MoO4·2H2O 、 Na2EDTA 、FeSO4·7H2O 濃度分別為 3.33、0.5、0.51、0.13、0.17、2.1、2.1 μmol·L-1。氣候條件為：晝夜溫度25℃，光周期12 h/12 h，濕度80%～90%。茶苗首先用去離子水培養(yǎng) 3 d，然后改用 1/2營養(yǎng)液培養(yǎng) 1周，再轉(zhuǎn)為全營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)21 d，培養(yǎng)過程中用氣泵持續(xù)通氣，待茶苗長出大量白色新根后，選取長勢相同的茶苗（8～10片葉，20～25 cm）進(jìn)行試驗(yàn)。

通過調(diào)整原有營養(yǎng)液中的 Al2(SO4)3·18H2O及KH2PO4的用量。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)鋁濃度0、0.5、1 mmol·L-1，分別記為 Al0、Al1、Al2；5個(gè)磷濃度 0、0.01、0.05、0.1、0.5 mmol·L-1、分別記為 P0、P1、P2、P3、P4，共 15組完全不重復(fù)的磷鋁交互處理，其中P2Al1處理為正常營養(yǎng)液培養(yǎng)（CK），每組設(shè)有 3株重復(fù)。同時(shí)不同處理通過調(diào)整 K2SO4的用量維持鉀離子的總濃度在 1 mmol·L-1，pH 統(tǒng)一調(diào)整為4.5。營養(yǎng)液每隔7 d更換 1次，處理21 d后取樣進(jìn)行形態(tài)及根系生長數(shù)據(jù)測定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根系數(shù)據(jù)測定

將茶苗的根部完整地剪下，將根系平鋪于盛有水的托盤中，避免根系交疊。將托盤放入根系掃描儀（ScanMaker i800 Plus，Microtek）中進(jìn)行掃描分析，根據(jù)根系掃描儀的顏色差異篩選功能，篩選獲取處理后白色新根部分的各項(xiàng)數(shù)據(jù)。

將剪下的茶樹根系放于 65℃烘箱中烘至足干。將烘干后的樣品置于萬分之一天平（AS160.R1，RADWAG）上稱重并記錄為干物質(zhì)量，干物質(zhì)量與CK（P2Al1）的干物質(zhì)量之差記為干物質(zhì)增加量。

1.2.2 磷、鋁元素含量測定

將茶苗的全根、莖、老葉（第五六片葉）、嫩葉（第一二片葉）取下，65℃烘至足干，放入磨樣機(jī)（Grinder-48，騁克）磨至粉末狀。稱取 0.1 g樣品粉末放入完全干燥的消解管中，加入5 mL濃硝酸后放入微波消解爐中消解。消解程序?yàn)椋?～20 min，升溫至185℃；20～40 min，保持 185℃。

將消解后的液體通過0.22 μm水系濾膜后注入離心管中，定容至 50 mL后于電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（ICP-OES，optima 8000，PerkinElmer）上檢測。并檢測Al、P元素含量，檢測波長分別為396.153 nm和213.617 nm[18]。

1.2.3 有機(jī)酸測定

將各組茶苗根部用純水洗凈，反復(fù)沖洗后擦凈水分，放入盛有35 mL 0.02 mol·L-1CaCl2（pH 3.8）溶液的50 mL離心管中，保證根系完全浸沒于液體內(nèi)，培養(yǎng)并收集茶樹 24 h的有機(jī)酸分泌量[19]。

收集液經(jīng)過濾后放入液氮中速凍，再放入冷凍干燥機(jī)（ALPHA2-4/LSC，Christ）中凍干至粉末狀。用2 mL超純水將粉末重新溶解，通過0.45 μm水系濾膜后放入超高效液相色譜（UltiMATE 3000，Thermo）中檢測。檢測條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm×1.8 μm），流動(dòng)相為 0.01 mol·L-1KH2PO4（含有 1%的甲醇，pH 2.10），流速0.25 mL·min-1，柱溫 30℃，進(jìn)樣量 2 μL，檢測波長 214 nm[19]。用外標(biāo)法測定草酸、蘋果酸、檸檬酸的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素及雙因素方差分析，使用GraphPad Prism v8.0進(jìn)行繪圖。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值，P＜0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷鋁處理對(duì)茶樹根系形態(tài)的影響

處理 21 d后茶苗根系形態(tài)的變化如圖1所示，鋁元素的存在對(duì)新根生長較為關(guān)鍵，隨著鋁濃度升高，茶樹的新根生長明顯增強(qiáng)。在Al1水平下，高磷條件（P4）新根幾乎全部褐化；但當(dāng)鋁濃度提升到高鋁（Al2）時(shí)，高磷條件（P4）下茶樹能夠維持白色新根的生長，說明高鋁能緩解高磷對(duì)新根生長的抑制。

圖1 不同磷鋁處理下茶樹的根系形態(tài)Fig. 1 Root morphology of tea plants under different phosphorus and aluminum treatments

2.2 不同磷鋁處理對(duì)茶樹根系生長的影響

由表1可知，在相同鋁濃度（Al1、Al2）處理下，新根的根尖數(shù)、根長、平均直徑及干物質(zhì)增加量均在P1條件下達(dá)到最大值。P1Al1處理的根尖數(shù)、根長、平均直徑，相較 CK（P2Al1）分別高出43.09%、35.28%和18.75%，干物質(zhì)增加量較CK高出127.33 mg。在低磷高鋁（P1Al2）處理下，根尖數(shù)、根長及平均直徑均達(dá)到各處理中的最大值，比CK分別高出 134.61%、55.99%和 43.75%；干物質(zhì)增加量比CK高出158.23 mg。在同一磷水平下，供鋁使新根的根尖數(shù)、根長、平均直徑及干物質(zhì)增加量顯著增加，且隨鋁濃度的上升而增加。Al1處理下，P0、P1、P2及P3的新根長度較Al0處理分別增加了190.28倍、45.02倍、16.78倍及15.01倍，而Al2處理的新根長度較Al1處理增加了 80.29%、15.3%、13.79%及51.23%。雙因素分析結(jié)果表明，磷、鋁濃度對(duì)茶樹的根尖數(shù)、根長、平均直徑及干物質(zhì)增加量均有極顯著影響，但僅有根尖數(shù)及根長受到磷鋁交互作用的影響。

表1 磷鋁互作下茶樹的各項(xiàng)根系指標(biāo)Table 1 Theindex of rootsystem in tea plants under phosphorus and aluminum interaction

2.3 不同磷鋁處理對(duì)茶樹各部位磷、鋁元素含量的影響

在培養(yǎng)期間，鋁元素先在茶樹根部積累，茶樹根部鋁含量遠(yuǎn)高于其他部位（圖2）。一定范圍內(nèi)，磷濃度的增加使茶樹根部鋁含量顯著增加，在P3時(shí)均達(dá)到最大值，而高磷（P4）顯著抑制茶樹根部鋁的吸收。在 Al0、Al1和Al2處理下，P3處理時(shí)根部鋁含量分別為 P0處理的3.07倍、5.40倍及4.23倍。供鋁后（Al1、Al2），在一定磷濃度范圍內(nèi)，嫩葉中鋁含量隨磷濃度增加呈現(xiàn)上升趨勢，但在高磷（P4）時(shí)顯著下降。而無磷（P0）處理時(shí)的嫩葉鋁含量卻始終高于低磷（P1）處理，此變化趨勢與根部基本保持一致。供鋁后（Al1、Al2）茶樹莖部鋁含量也在P3處達(dá)到最大值，相較P0處理分別增加了4.19倍及1.73倍。當(dāng)環(huán)境磷濃度達(dá)到高磷（P4）水平后，各部位鋁元素含量均顯著下降。在 Al0、Al1和 Al2處理下，與 P3相比，P4處理根部鋁含量分別下降了50.49%、56.46%和61.33%，莖部分別下降了17.41%、80.34%和92.15%，老葉分別下降了27.28%、59.12%和44.77%，嫩葉分別下降了15.02%、48.71%和53.36%。雙因素分析結(jié)果表明，磷、鋁濃度以及磷鋁互作對(duì)茶樹根、莖、老葉和嫩葉中的鋁含量均有極顯著影響（P＜0.01）。

圖2 不同磷鋁處理下茶樹根、莖、老葉、嫩葉中的鋁含量Fig. 2 Al contents in roots, stems, mature leaves and shoot of tea plants under phosphorus and aluminum treatments

磷元素首先積累在茶樹根部。由圖3可知，除高磷（P4）處理外，在同一磷濃度下，高鋁（Al2）顯著促進(jìn)了茶樹根部磷元素的積累，在 P0、P1、P2和 P3處理下 Al2比 Al0處理分別增加了 479.11%、116.43%、76.72%和107.23%，比 Al1處理分別增加了 335.79%、84.71%、99.95%和 50.77%。在地上部分，尤其在莖和嫩葉中，磷充足條件下（P2、P3和P4）的磷含量總體隨鋁含量上升而下降；在茶樹嫩葉中，磷的積累被高鋁（Al2）顯著抑制，比 Al0處理分別下降了 31.19%、66.48%和87.94%；而在磷缺乏條件下（P0及 P1），環(huán)境鋁濃度對(duì)嫩葉中磷含量無明顯影響。在茶樹老葉中，僅在P3和P4處理下磷含量隨鋁濃度增加而下降。雙因素分析結(jié)果表明，磷、鋁濃度以及磷鋁互作對(duì)茶樹根、莖、老葉和嫩葉中的磷含量均有極顯著影響（P＜0.01）。

圖3 磷鋁互作下不同磷鋁處理下茶樹根、莖、老葉、嫩葉中的磷含量Fig. 3 P contents in roots, stems, mature leaves and shoot of tea plants under phosphorus and aluminum treatments

2.4 不同磷鋁處理對(duì)茶樹分泌有機(jī)酸的影響

由圖4可知，磷充足時(shí)（P2、P3和P4），供鋁均能增加草酸、蘋果酸及檸檬酸的分泌，這3種有機(jī)酸分泌量均隨鋁濃度的增加而升高。低磷（P1）或高鋁（Al2）均能夠顯著誘導(dǎo)茶樹草酸及蘋果酸的分泌。相較CK而言，在同一鋁濃度（Al1）下，P1處理使茶樹草酸及蘋果酸分泌量分別增加了 25.47%和127.38%；在同一磷濃度（P2）下，Al2使草酸及蘋果酸分泌量分別增加了 15.08%和94.05%。在低磷時(shí)供鋁對(duì)蘋果酸仍起促進(jìn)作用，但對(duì)草酸分泌卻呈抑制作用。低磷（P1）條件下，Al2相較 Al0而言，蘋果酸分泌量增加了 98.55%，而草酸分泌量減少了 8.74%。對(duì)檸檬酸而言，除P0處理外，其分泌量隨磷、鋁濃度的上升而增加，并在P3Al2處理下達(dá)到最大值（141.04 μg·mL-1），但在環(huán)境磷濃度達(dá)到高磷（P4）水平后，檸檬酸分泌量下降。雙因素分析結(jié)果表明，磷、鋁濃度以及磷鋁互作對(duì)茶樹分泌的草酸、蘋果酸及檸檬酸均有極顯著影響（P＜0.01）。

圖4 不同磷鋁處理對(duì)有機(jī)酸分泌的影響Fig. 4 Effects on organic acid secretion under phosphorus and aluminum treatments

3 討論

本研究表明，環(huán)境中的磷、鋁濃度及其相互作用對(duì)茶樹新根的根長、根尖數(shù)、各部位磷鋁元素積累及有機(jī)酸分泌均存在極顯著影響，表明磷鋁互作在茶樹的根系生長、有機(jī)酸分泌及磷鋁吸收中起到重要作用。磷鋁互作在其他植物中也有研究，Mora等[20]的研究結(jié)果表明，黑麥草對(duì)鋁的耐受性是由于其有效的磷轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和強(qiáng)抗氧化活性，從而可以較大程度地減輕鋁的毒性；Liang等[21]發(fā)現(xiàn)大豆的蘋果酸分泌受pH、Al和P等3個(gè)因素的共同調(diào)節(jié)。茶樹自然條件下均生長在酸性土壤中，酸性土壤往往也伴隨著低磷和高鋁的環(huán)境，因此，磷鋁互作與茶樹耐酸和耐鋁的生物學(xué)特性也可能存在潛在的相關(guān)性。

在茶樹中，低磷高鋁（P1Al2）對(duì)根系生長及蘋果酸分泌作用效果相似。首先，低磷或高鋁均能明顯地促進(jìn)茶樹新根的生長，且協(xié)同作用明顯。低磷條件下，茶樹的根尖數(shù)及根長均達(dá)到各處理中的最大值，鋁濃度的提升也使茶樹的各項(xiàng)根系指標(biāo)顯著增加；而在低磷高鋁處理下，二者間效果疊加明顯，茶樹根部的各項(xiàng)生理指標(biāo)均達(dá)所有處理的最大值。其次，低磷或高鋁均能促進(jìn)草酸及蘋果酸的分泌，且低磷高鋁能夠協(xié)同促進(jìn)蘋果酸分泌。Balzergue等[22]發(fā)現(xiàn)，缺磷促進(jìn)野生型擬南芥蘋果酸的分泌，具有延緩初生根的生長及促進(jìn)側(cè)根發(fā)育的雙重作用。結(jié)合本文研究結(jié)果來看，低磷能夠促進(jìn)茶樹根部蘋果酸的分泌及根系生長，但并未造成任何根系的生長抑制，可能是由于試驗(yàn)使用的扦插茶苗并無主根，低磷條件僅顯示出促進(jìn)了茶樹不定根生長的情況。還有研究表明，蘋果酸分泌也在茶樹耐鋁性中起到至關(guān)重要的作用[23]，因此茶樹在低磷高鋁共處理下協(xié)同促進(jìn)根系發(fā)生與蘋果酸的分泌存在一定相關(guān)性。

磷鋁的相互作用還表現(xiàn)在兩元素間相互促進(jìn)吸收上，提高環(huán)境中的磷鋁濃度能夠顯著促進(jìn)另一元素在茶樹根部的積累。有研究表明，在鋁濃度小于1 mmol·L-1的條件下，增加鋁濃度能夠?qū)е虏铇涓康牧缀外浀仍胤e累量增加[6]，而本研究表明磷濃度提升也能夠促進(jìn)茶樹根部鋁元素的積累，磷鋁元素間存在協(xié)同促進(jìn)吸收的作用。而磷鋁互作對(duì)兩種元素在嫩葉中的積累情況與根部不同。磷對(duì)鋁的影響總體表現(xiàn)為供鋁條件下磷能夠促進(jìn)鋁元素在嫩葉中的積累，但在低磷條件下卻會(huì)導(dǎo)致其積累量顯著下降，因此鋁向嫩葉的轉(zhuǎn)運(yùn)過程可能需要磷的參與。而在磷充足時(shí)，鋁卻會(huì)抑制磷在嫩葉中的積累。有研究發(fā)現(xiàn)，耐鋁型蕎麥相較鋁敏感型蕎麥而言，根系中的磷鋁濃度顯著升高，桑色素染色實(shí)驗(yàn)表明，根組織中的磷更能夠?qū)X固定在細(xì)胞壁中[24]。而茶樹作為耐鋁植物，根部的磷鋁元素間可能也有類似的情況，進(jìn)而影響了茶樹中磷的向上運(yùn)輸。

另外，由于茶樹白色根與褐色根的比例與其健康程度呈正相關(guān)[25]。本研究中，常規(guī)鋁（0.5 mmol·L-1）條件下，高磷（0.5 mmol·L-1）導(dǎo)致茶樹白色新根生長受阻。Konishi等[26]的研究中也發(fā)現(xiàn)，過量磷（0.8 mmol·L-1）會(huì)造成茶樹的白色新根褐化。本研究表明高鋁能夠在一定程度上緩解高磷條件下的白色新根褐化現(xiàn)象。有研究表明，油茶幼苗中添加磷能夠緩解鋁脅迫，并通過調(diào)節(jié)根部代謝如增加碳水化合物的合成等減少根中鋁的積累[27]，在茶樹中鋁是否可以通過類似的調(diào)節(jié)機(jī)制來緩解高磷造成的新根生長抑制也有待進(jìn)一步明確。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)磷、鋁濃度及其相互作用對(duì)茶樹的根系生長、有機(jī)酸分泌及磷鋁含量有極顯著影響，低磷高鋁對(duì)茶樹根系生長及蘋果酸分泌均具有協(xié)同作用；另一方面，提高磷鋁濃度能夠互相促進(jìn)茶樹根系對(duì)另一元素的吸收，磷能促進(jìn)鋁在嫩葉中的積累，鋁卻抑制了磷向嫩葉中的轉(zhuǎn)移。而磷鋁元素間是否存在共同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以及磷鋁互作的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。