PCDH9基因rs9540720 與中國(guó)漢族人群抑郁癥易感性的關(guān)聯(lián)*

李 悅，周 川，梁 鵬，梁蕓丹

成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室（成都 610500）

抑郁癥是一種復(fù)雜和嚴(yán)重的精神疾病，以觀(guān)念、情緒、運(yùn)動(dòng)和植物神經(jīng)癥狀受損等為特點(diǎn)，可導(dǎo)致患者嚴(yán)重殘疾[1]。目前抑郁癥已成為全球致殘的主要原因之一[2]。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約有3.22億人受其影響，且約有7.5 %的患者會(huì)導(dǎo)致殘疾[3]。目前，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制仍未明確，但抑郁癥相關(guān)的基因多態(tài)性研究[4]表明，抑郁癥具有遺傳性，總體遺傳率為31%～41%，此種程度的遺傳特性使其難以找到風(fēng)險(xiǎn)或保護(hù)位點(diǎn)；其次可能由于抑郁癥的顯著異質(zhì)性和多樣化，未找到有意義的基因位點(diǎn)[5]。同時(shí)抑郁癥在全球的發(fā)病率高，世界不同地區(qū)的不同基因存在差異，這進(jìn)一步擴(kuò)大了尋找抑郁癥風(fēng)險(xiǎn)或保護(hù)性位點(diǎn)的難度，因此與抑郁癥有關(guān)的基因多態(tài)性研究范圍廣泛。原鈣黏蛋白（PCDHs）是鈣黏蛋白超家族中最大的家族，大多在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在神經(jīng)突觸的連接和作為受體在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮一定作用[6]。PCDHs主要分為簇狀PCDHs（cPCDHs） 和非簇狀PCDHs （ncPCDHs），聚集形成的cPCDHs參與神經(jīng)元的形成和存活，與自閉癥譜系障礙、精神分裂癥、女性局限性癲癇和認(rèn)知障礙等的神經(jīng)、精神疾病有關(guān)[7]。編碼原鈣黏蛋白9（PCDH9）基因的缺乏會(huì)減少積極情緒行為，可能是抑郁癥新的風(fēng)險(xiǎn)因素[8-9]。有研究[10-12]顯示，PCDH9的表達(dá)與神經(jīng)形成、物體識(shí)別和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)發(fā)育等有關(guān)，可調(diào)節(jié)神經(jīng)回路的形成。由此推測(cè)，PCDH9可能是抑郁癥的一個(gè)新的生物標(biāo)志物或一個(gè)潛在的治療位點(diǎn)。

本研究通過(guò)分析PCDH9單核苷酸多態(tài)性rs9540720與抑郁癥的相關(guān)性，探討PCDH9單核苷酸多態(tài)性rs9540720在抑郁癥發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年3月至2019年12月3家醫(yī)院480例抑郁癥患者作為試驗(yàn)組，329例非抑郁癥患者作為對(duì)照組，所有樣本均來(lái)源于中國(guó)漢族人。該研究經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)?；颊咴\斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)疾病和有關(guān)健康問(wèn)題的國(guó)際統(tǒng)計(jì)分類(lèi)第十次修訂本，癥狀的嚴(yán)重程度評(píng)分采用漢密爾頓抑郁評(píng)定的24項(xiàng)版本。使用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管收集所有受試者2～3 mL外周靜脈血全血樣品，并儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中。排除標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)系統(tǒng)疾病、急性或慢性感染、甲狀腺功能異常、神經(jīng)生殖系統(tǒng)疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ习Y和帕金森氏癥）及其他疾病，如物質(zhì)濫用共病、認(rèn)知障礙、參與評(píng)估能力差等；目前懷孕或喂養(yǎng)。臨床數(shù)據(jù)來(lái)自醫(yī)療記錄，包括年齡、性別、發(fā)病年齡、漢密頓抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）評(píng)分、脈搏率、抑郁程度、家族史、自殺觀(guān)念/行為及是否首發(fā)。

對(duì)照組男 105例，女 224例，年齡（44.00 ± 16.90）歲。試驗(yàn)組男 139例，女 341例，年齡（41.80±17.60）歲；發(fā)病年齡（36.80±16.90）歲；心率（80.60±11.40）次/min；中度抑郁228例，重度抑郁252例；有家族病史94例，無(wú)家族病史386例；有自殺觀(guān)念292例，無(wú)自殺觀(guān)念188例；首次發(fā)病248例。

1.2 主要試劑

血液基因組DNA快速抽提試劑盒、AMPure XP磁珠、瓊脂糖膠、引物、通用P7引物、通用P5引物、PCR Ready Mix均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.3 主要儀器

Qubit 2.0熒光定量?jī)x[賽默飛世爾（中國(guó)）有限公司]、PCR儀（BIO-RAD，T100TM）、電 泳 儀（BIO-Rad，powerPac Basic）、HiSeqXTen測(cè)序儀（Illumina，San Diego，CA）。

1.4 方法

1.4.1 基因DNA提取 使用血液基因組DNA快速抽提試劑盒對(duì)血液樣品進(jìn)行DNA抽提，并在提取完成后使用Qubit 2.0對(duì)獲得的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，確保獲得高質(zhì)量基因組DNA。

1.4.2 基因分型 以上述方法提取出的DNA為模板，以 上 游 引 物“AGAGAAAGTTTCTTTTTGAGACC AG” 和 下 游 引 物“ACAAAAAGTAACATTTTCT TTTCTT”擴(kuò)增出含有rs9540720位點(diǎn)的DNA片段。多重?cái)U(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性 3 min，[98 ℃（30 s）、50 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）]進(jìn)行8個(gè)循環(huán)，[98 ℃（30 s）、66 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）]進(jìn)行 25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，產(chǎn)物通過(guò)AMPure XP磁珠純化回收，并進(jìn)行二輪擴(kuò)增獲得Illumina測(cè)序文庫(kù)，擴(kuò)增條件如下：98 ℃預(yù)變性 5 min，[94 ℃（30 s）、55 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）]進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，使用AMPure XP磁珠純化回收，PCR產(chǎn)物分別等量混合，再使用HiSeqXTen測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，對(duì)PCDH9家族rs9540720進(jìn)行分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，直接計(jì)數(shù)獲得rs9540720基因型頻率，采用χ2檢驗(yàn)分析rs9540720基因型在兩組中的分布情況和Hardy-Weinberg平衡，采用比值比（OR）和95%置信區(qū)間（Cl）評(píng)估基因多態(tài)性和病情情況的相關(guān)性，并根據(jù)年齡和性別數(shù)據(jù)對(duì)OR值進(jìn)行校正。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說(shuō)明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

PCDH9基因rs9540720多態(tài)位點(diǎn)在兩組共顯性、顯性、隱性、等位基因方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)組抑郁發(fā)作程度、自殺觀(guān)念/行為和是否為首發(fā)患者的分層分析發(fā)現(xiàn)，中度抑郁癥患者中AG和AG-AA基因型頻率分別為57.02%和74.56%，高于重度抑郁癥患者中的頻率（46.43%和62.30%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AG與GG相比：OR=1.81，95%CI：1.08～3.03，P＜ 0.05；AG-AA與GG相比：OR=1.75，95 %CI：1.00～3.06，P ＜ 0.05）（表 2）。

表1 PCDH9基因rs9540720多態(tài)性與抑郁癥的關(guān)聯(lián)[n（%）]

表2 PCDH9基因rs9540720在抑郁癥患者中的分層分析[n（%）]

3 討論

抑郁癥是一種復(fù)雜、常見(jiàn)的疾病，其發(fā)作和發(fā)展涉及許多因素[13]。新型冠狀病毒肺炎疫情的流行加劇了抑郁癥的患病率以及社會(huì)負(fù)擔(dān)[14]，因此關(guān)于抑郁癥的研究尤為重要。越來(lái)越多研究[15-16]表明，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制可能與患者個(gè)體遺傳異常有關(guān)，或與出生前不明的基因突變有關(guān)。PCDH9基因的缺乏會(huì)減少積極情緒行為，有必要進(jìn)一步研究編碼PCDH9基因在抑郁癥中的作用。

本研究結(jié)果顯示，PCDH9基因SNPrs9540720多態(tài)性與自殺觀(guān)念/行為、是否為首次發(fā)病無(wú)關(guān)，表明抑郁癥患者的自殺觀(guān)念/行為、是否首次發(fā)病與該基因無(wú)關(guān)，可能是由其他基因或因素決定。抑郁癥的病因尚未明確，但目前多數(shù)學(xué)者[17-18]認(rèn)為是基因-環(huán)境因素共同發(fā)揮作用所致。因此未來(lái)研究應(yīng)對(duì)有自殺傾向或首次發(fā)病的抑郁癥患者進(jìn)行多因素分析。通過(guò)對(duì)抑郁癥危險(xiǎn)因素的認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)對(duì)自殺風(fēng)險(xiǎn)和抑郁癥首次發(fā)病的早期識(shí)別，并盡早進(jìn)行預(yù)防干預(yù)，同時(shí)提高治愈率。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCDH9基因 rs9540720多態(tài)性可能與抑郁癥的嚴(yán)重程度有關(guān)，AG和AG-AA基因型攜帶者更易發(fā)生中度抑郁癥，表明PCDH9基因rs9540720多態(tài)性與抑郁癥發(fā)病機(jī)制可能有關(guān)。目前，PCDH家族有較多成員已被研究[19-22]證明與精神類(lèi)疾病有關(guān)，如PCDH19基因多態(tài)性可能與癲癇有關(guān)，PCDH8可能與自閉譜系有關(guān)，PCDH10、PCDH17等與神經(jīng)、精神疾病有關(guān)。有研究[11]表明，PCDH9參與長(zhǎng)期社會(huì)和物體識(shí)別及感覺(jué)運(yùn)動(dòng)發(fā)展，PCDH9缺陷導(dǎo)致特定的長(zhǎng)期社會(huì)和物體識(shí)別障礙。有研究[23]表明，PCDHs主要在大腦中表達(dá)，并受發(fā)育調(diào)節(jié)，與其他PCDH家族成員一樣，PCDH9主要在胎兒和成人的大腦中表達(dá)，其在大腦中發(fā)育調(diào)節(jié)的表達(dá)模式表明，這些蛋白直接影響形態(tài)發(fā)生的各個(gè)方面。同時(shí)在抑郁癥的研究中，進(jìn)行社交交流訓(xùn)練可有效緩解抑郁癥的負(fù)面情緒，促進(jìn)社會(huì)功能恢復(fù)[24]。以上研究結(jié)果表明，PCDH9基因rs9540720多態(tài)性與抑郁癥發(fā)病機(jī)制有關(guān)，這或許可以解釋在分層分析中的陽(yáng)性結(jié)果。

本研究存在一定局限性。首先，本研究樣本量較小，未來(lái)有必要擴(kuò)大樣本量對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究；其次，本研究樣本納入標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單，采用的是使用最低限度表型定義的患者，該結(jié)果可能是由抑郁癥遺傳和非遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素的異質(zhì)性和多基因性質(zhì)以及抑郁癥亞型的異質(zhì)性共同決定[25]。此外，盡管本研究有相關(guān)證據(jù)表明基因?qū)膊∫赘行缘呢暙I(xiàn)，但缺乏實(shí)質(zhì)性的分子遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)[26]，無(wú)法進(jìn)一步證實(shí)抑郁癥風(fēng)險(xiǎn)多態(tài)性對(duì)mRNA表達(dá)的影響。因此，有必要在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，同時(shí)繼續(xù)收集臨床樣本進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示PCDH9基因rs9540720位點(diǎn)可能與抑郁癥嚴(yán)重程度有關(guān)，可能是抑郁癥病情的風(fēng)險(xiǎn)因子。在后續(xù)研究中有必要擴(kuò)大候選基因選擇范圍，進(jìn)一步揭示PCDH9基因在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的作用。